Práctica 8.

AISLAMIENTO DE ARN DE BACTERIAS

Introducción
La extracción de biomoléculas como el ARN es un método crucial utilizado en biología
molecular. Se puede extraer de cualquier material biológico como tejidos o células vivas o
conservadas. A diferencia del ADN, el ARN es transitorio, frágil, elusivo y difícil de
recuperar. Generalmente, la purificación exitosa de ácidos nucleicos requiere de 4 pasos
importantes: la disrupción efectiva de las células; la desnaturalización de complejos de
nucleoproteínas; la inactivación de las ARNasas; y la eliminación de contaminantes (Doyle,
1996). En el caso particular del ARN, debe de estar libre de proteínas, carbohidratos, lípidos
y especialmente de ADN (Buckigham, 2007), ya que la calidad y la integridad del ARN
aislado afectará directamente los resultados de las técnicas posteriores (Cseke, 2005).
Con respecto al ADN, el ARN es una molécula inestable, ya que el enlace C-OH de la ribosa
es más reactivo que el enlace C-H de la desoxirribosa. Además, tiene una vida media muy
corta una vez que ha sido extraído de las células (Brooks, 1998). Es necesario tener mucho
cuidado y precaución durante la extracción de ARN ya que es susceptible a la degradación
enzimática (Buckigham, 2007). El ARN es especialmente inestable debido a la ubicuidad de
las ARNasas, las cuales están presentes en todos los tejidos, así como en todas las bacterias
y hongos del ambiente (Buckigham, 2007; Brooks, 1998). La inhibición de las ARNasas
durante los protocolos de aislamiento y purificación de ARN se logra con desnaturalizantes
fuertes como el tiocianato de guanidina, ya que las ARNasas pueden volver a obtener su
estructura terciaria después de la desnaturalización por calor y son difíciles de inactivar
porque no requieren de cofactores (Doyle, 1996).
El primer método reportado para la extracción de ARN con isotiocianato de guanidina es
muy laborioso (Ulrich, 1977), por lo que fue reemplazado por una técnica de un solo paso
desarrollada por Chomczynski y Sacchi (1987) conocido como extracción con tiocianato de
guanidina – fenol – cloroformo, en el cual el homogeneizado es extraído con
fenol/cloroformo a un pH bajo.
El tiocianato de guanidina es un agente caotrópico utilizado para la desnaturalización de las
proteínas. El principio de este método es que el ARN es separado del ADN después de su
extracción con una solución ácida que contiene tiocianato de guanidina, acetato de sodio,
fenol y cloroformo (Chomczynski, 2006). En condiciones ácidas, el ARN permanecerá en la
parte superior o fase acuosa, mientras que el ADN y las proteínas se encontrarán en la
interfase o en la fase orgánica. La recuperación de ARN total se realiza por precipitación con
isopropanol.
La purificación basada en fases sólidas es utilizada en la mayoría de los kits comerciales
disponibles en el mercado. Este método permite purificar el ARN con mayor eficiencia y
velocidad que los métodos convencionales (Esser, 2005). Muchos de los problemas
asociados a la extracción líquido-líquido, como la separación incompleta de las fases, pueden
ser evitados.
El principio de la utilización de fases sólidas es que el ARN es absorbido en esta por
interacciones de unión de los átomos de hidrógeno con una matriz hidrofílica bajo
condiciones caotrópicas, por intercambio iónico bajo condiciones acuosas o por mecanismos
de exclusión molecular. La absorción es dependiente del pH y la concentración salina del
amortiguador.
Los cuatro pasos que involucran la extracción en fase sólida son la lisis celular, la absorción
en el soporte, el lavado y la elución. La purificación en fase sólida es comúnmente realizada
en columnas que operan bajo la fuerza centrífuga (Gjerse, 2009) y como soportes sólidos se
utilizan matrices de sílica, partículas de vidrio, tierra de diatomeas o resinas de intercambio
iónico.
La etapa inicial del proceso de extracción en fase sólida es el acondicionamiento del soporte
para que la muestra pueda absorberse. Esto se realiza mediante la utilización de un
amortiguador a un pH particular que convierte la superficie del soporte o ciertos grupos
funcionales del mismo en una forma química particular que lo hace afín al ARN.
Posteriormente, la muestra que ha sido extraída por lisis celular es depositada en la columna.
Si el pH y la concentración de sales de la solución de unión son las adecuadas, el ARN es
absorbido en el soporte. Otros compuestos, como proteínas y ADN, que podrían también
tener afinidad con la superficie del soporte, son removidos por un agente competitivo
presente en el amortiguador de lavado. En la etapa de elución, el ARN se remueve del soporte
con agua y es colectado con una mayor pureza (Gjerse, 2009). Normalmente, para las etapas
de lavado y elución se requiere centrifugar o filtrar con vacío para realizar la separación de
los compuestos.
Tanto el ADN como el ARN pueden ser purificados utilizando los mismos soportes y su
unión es favorecida por la presencia de sales caotrópicas y etanol. Sin embargo, la elución de
cada uno de éstos dependerá del pH de la solución de elución que se utilice.
El ADN es más estable y se disuelve más rápido en amortiguadores con pH entre 8 y 9,
mientras que el ARN se disuelve mejor a pH ácidos, por lo que el agua a pH de 4 a 5 es el
diluyente más utilizado en estos casos.
Material y equipo necesario
 Cultivo de E. coli en medio sólido (proporcionado por el profesor)
 Beta-mercaptoetanol
 Etanol absoluto
  Amortiguador Tris EDTA (TE)
 Agua inyectable
 Lisozima (1 mg/mL)
 Microcentrífuga
 Micropipetas y puntas de 20 μL, 200 μL y 1,000 μL estériles
 Microtubos de 1.6 mL, nuevos y estériles
 Rejilla para microtubos
 Guantes de látex o nitrilo
 Vórtex
 Matraz Erlenmeyer de 125 mL
 Pipetas de vidrio graduadas de 25 mL y propipeta
 Asa microbiológica
 Campana de flujo laminar
 Incubadora a 37 °C con agitación orbital
 Tubo cónico de 50 mL, nuevo y estéril
 Kit RNeasy® Mini (Qiagen) con las siguientes soluciones:
- Amortiguador RLT
- Amortiguador RW1
- Amortiguador RPE
- Agua libre de ARNasa
 Hielo/contenedor
 Ultracongelador a -80 °C
Protocolo
El día anterior a la práctica:
1. Bajo condiciones de asepsia, inocular las bacterias en el matraz Erlenmeyer con 25
mL de medio LB.
2. Incubar a 37 °C durante toda la noche (14-16 h) con agitación orbital de 250 rpm.
El día de la práctica:
1. Tomar 20 mL de cultivo y centrifugar a 8,000 rpm durante 10 min.
2. Resuspender la pastilla en 100 μL de lisozima (1 mg/mL) y colocar en un microtubo de
1.6 mL.
3. Incubar a 30 °C agitando periódicamente con vórtex hasta observar un aumento en la
viscosidad de la muestra.
4. Agregar 350 μL de amortiguador RLT con 3.5 μL de beta-mercaptoetanol y mezclar
vigorosamente con vórtex.
5. Adicionar 250 μL de etanol absoluto. Mezclar suavemente durante pipeteo.
6. Colocar una columna RNeasy spin en un tubo colector y transferir a ésta, hasta 700 μL
de la mezcla de lisado, incluyendo cualquier precipitado que se pueda haber formado.
7. Cerrar la tapa del tubo en la boca de la columna y centrifugar durante 45 s a 10,000 rpm.
 8. Desechar el filtrado. Si se tiene más mezcla de lisado, repetir desde el paso 6 hasta agotar
el lisado.
9. En el mismo tubo colector y columna, agregar 700 μL de amortiguador RW1.
10. Cerrar la tapa del tubo en la boca de la columna y centrifugar durante 45 s a
1. 10,000 rpm. Desechar el líquido filtrado.
11. Colocar la columna en el mismo tubo colector y agregar 500 μL de amortiguador
2. RPE.
12. Cerrar la tapa y centrifugar durante 2 min a 10,000 rpm.
13. Colocar la columna en un microtubo nuevo y agregar 30 μL de agua libre de ARNasa
directamente sobre la membrana de la columna.
14. Dejar reposar durante 2 min a temperatura ambiente.
15. Cerrar la tapa y centrifugar durante 1 min a 10,000 rpm.
16. Desechar la columna y conservar el ARN eluido a -80 °C.

Análisis de resultados
Describa detalladamente los fundamentos de cada paso realizado durante la extracción de
ARN bacteriano.
Observe y documente los cambios físicos de la muestra durante todo el proceso de
extracción y purificación.
Discuta cuál es el fundamento de la extracción de ARN con la columna utilizada.
Cuestionario
1. ¿Cuántos tipos de ARN hay y en qué proporción se encuentran en la célula procariota?
2. Además de la lisozima, ¿qué otros procedimientos se pueden utilizar para lisar bacterias?
3. ¿Qué estrategia se puede realizar para evitar la degradación del ARN intracelular si la
muestra no es procesada inmediatamente después de ser colectada?
4. Durante el procesamiento de las muestras, ¿qué enzima debe de ser inhibida para obtener
una concentración y calidad adecuada de ARN?
5. Analizando el protocolo utilizado en esta práctica, ¿cuáles son los componentes
principales de cada uno de los amortiguadores utilizados en cada etapa?
6. Una vez aislado y purificado el ARN, ¿cómo debe conservarse para su utilización
posterior?

Soluciones
• Medio LB (250 mL)
Mezclar 2.5 g de triptona, 1.25 g de extracto de levadura y 2.5 g de NaCl en 200 mL de agua
destilada. Ajustar el pH a 7 con NaOH 5 M. Ajustar el volumen a 250 mL con agua destilada.
Esterilizar por autoclave y guardar a temperatura ambiente.
• Lisozima (1 mg/mL)
Será proporcionada por el profesor. Descongelar, homogenizar y mantener en hielo.
• EDTA 0.5 M, pH 8.0 (250 mL)
PMEDTA 372.24
Agregar 46.52 g de EDTA en 150 mL de agua Milli-QTM, agitar vigorosamente con una
barra magnética y ajustar el pH a 8.0 con NaOH (alrededor de 5 g de NaOH). Ajustar a un
volumen de 250 mL. Esterilizar por autoclave en un frasco de vidrio con tapón de rosca.
• Amortiguador de Tris-HCl 1 M, pH 7.6 (100 mL)
PMTris 121.14
Disolver 12.1 g de Tris base en 80 mL de agua Milli-QTM, ajustar el pH a 7.6 agregando
alrededor de 4 mL de HCl concentrado. Ajustar el volumen a 100 mL. Esterilizar por
autoclave en un frasco de vidrio con tapón de rosca. Si al momento de utilizar esta solución
tiene color amarillo, será necesario preparar una nueva.
• TE (40 mL)
Calcular los volúmenes requeridos de las soluciones stock para preparar 40 mL de TE a las
siguientes concentraciones finales:
- Amortiguador de Tris-HCl 10 mM, pH 7.6
- EDTA 1 mM
Almacenar a temperatura ambiente en un frasco de vidrio con tapón de rosca y esterilizar por
autoclave.
Referencias Bibliograficas
1. Brooks G. Biotechnology in healthcare: An introduction to biopharmaceuticals. Reino
Unido: Pharmaceutical Press; 1998.
2. Buckingham L, Flaws ML. Molecular diagnostics: Fundamentals, methods and clinical
applications. Estados Unidos: FA Davis; 2007.
3. Chomczynski P, Sacchi N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium
thiocyanate-phenol-chloroform etraction: twenty-something years on. Nature Protocols
2006; 1(2): 581-585.
4. Cseke LJ, Kaufman PB, Podila GK, Tsai C-J. Handbook of molecular and cellular
methods in biology and medicine. 2a. ed. Estados Unidos: CRC Press; 2005.
5. Doyle K. The source of discovery: Protocols and applications guide. Estados Unidos:
Promega; 1996.
6. Esser K-H, Marx WH, Lisowsky T. Nucleic acid-free matrix: regeneration of DNA
binding columns. BioThechniques 2005; 39: 270-271.
7. Gjerse DT, Hoang L, Hornby D. RNA purification and analysis: Sample preparation,
extraction, chromatography. Alemania: Wiley-VCH; 2009.
8. Qiagen. RNeasy® Mini Handbook. Disponible en:
https://www.qiagen.com/us/resources/resourcedetail?id=14e7cf6e-521a-4cf7-
8cbcbf9f6fa33e24&lang=en. Consultado septiembre 1, 2017.
9. Ullrich A, Shine J, Chirgwin J, Pictet R, Tischer E, Rutter WJ, Goodman HM. Rat insulin
genes: Construction of plasmids containing the coding sequences. Science 1977; 196:
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