Identificacion de Carbohidratos Lab

IDENTIFICACIÓN DE CARBOHIDRATOS
OBJETIVO:
Identificar el carbohidrato o la clase de carbohidratos presentes en una muestra biológica
comparándola con patrones de carbohidratos.
FUNDAMENTO:
Hay una amplia gama de métodos colorimétricos que permiten la determinación cualitativa y
cuantitativa de azúcares. Aunque son métodos muy generales, algunos de ellos permiten discriminar
entre diferentes tipos de azúcares. Así hay métodos de determinación de azúcares reductores, de
pentosas y hexosas, aldosas y cetosas, mono, oligo y polisacáridos, etc. En todos ellos el fundamento
es similar, y se basa en la reacción del azúcar con otro reactivo, con la formación productos
coloreados que se pueden determinar bien sea cualitativamente por su coloración o cuantitativamente
por espectroscopía visible.
Las pentosas y hexosas (tanto aldosas como cetosas) en presencia de ácidos minerales (p.ej., ácido
sulfúrico) y a temperaturas elevadas sufren procesos de deshidratación originando furfural
(derivados de pentosas) o hidroximetilfurfural (derivados de hexosas), tal y como se indica en la
figura.
Estos compuestos, furfural o hidroximetilfurfural, reaccionan con compuestos aromáticos (fenoles,

aminas cíclicas o heterociclos) dando productos coloreados. Aunque son pruebas específicas de
monosacáridos, los oligo y polisacáridos también dan positivo, ya que en medio ácido se hidroliza el
enlace glicosídico. Se disponen de diferentes técnicas, dependiendo del reactivo utilizado (ensayo de
Molish, con α-naftol; ensayo de la antrona; ensayo de Bial, con orcinol; ensayo de Seliwanoff, con
resorcinol). En la presente práctica se llevará a cabo la determinación cualitativa de azúcares mediante
los siguientes ensayos: Molish, Bial y Seliwanoff
Pruebas para azucares reductores: Fehling y Benedict

Los carbohidratos que presentan grupos aldehídicos libres o en forma hemiacetálica (grupos aldehídicos
potenciales) no bloqueados (por ejemplo formando parte de un enlace glicosídico) pueden ser oxidados
por diferentes reactivos, por lo que se les denomina azúcares reductores.
Entre los principales reactivos se encuentran los de Fehling y Benedict. Estos contienen sales cúpricas
(tartrato citrato) que le dan un color azul al reactivo. En medio alcalino el ion cúprico (Cu +2) se
transforma en hidróxido cúprico [Cu(OH)2]n y este, en presencia de un azúcar reductor se transforma en
hidróxido cuproso que, a su vez, por acción del calor, se transforma en oxido cuproso (Cu2O). El óxido
cuproso es insoluble en agua y produce un precipitado de color rojo aunque a bajas concentraciones el
color es amarillento.
Prueba de Barfoed para diferenciar monosacáridos de disacáridos
La prueba de Barfoed utiliza básicamente el mismo procedimiento que los reactivos de Fehling y
Benedict pero con un fin distinto. Aquí el cobre esta en una disolución débilmente ácida, en forma de
acetato; por efecto de sustancias reductoras, en caliente, producen iones cuprosos que precipitan en
caliente en forma de oxido cuproso. La velocidad de reacción es mucho más lenta para los disacáridos
que para los monosacáridos lo cual permite diferenciarlos.
Reconocimiento de cetosas: reacciones de Seliwanoff y Bang
Seliwanoff: Las cetosas, en presencia de ácido clorhídrico, se deshidratan mas rápidamente que las
aldosas produciendo derivados de furfural que se condensan con resorcinol para formar un complejo
rojo. Se debe evitar un calentamiento prolongado que dé origen a falsos positivos.
Bang: La fructuosa y los compuestos que la poseen se deshidratan en presencia de ácido para dar
hidroximetilfurfural el cual, en presencia de sales biliares, producen un intenso color violeta.
Prueba de Bial para reconocimiento de pentosas
Cuando se calientan pentosas con ácido clorhídrico concentrado se forma furfural que se condensa con
orcinol, en presencia de iones férricos, para dar un color verde azuloso. El calentamiento prolongado de
algunas hexosas producen hidroximetilfurfural que también reacciona con orcinol pero el producto
coloreado que se forma en este caso es amarillo o marrón.
Reconocimiento de polisacáridos con yodo
El yodo forma complejos coloreados con las cadenas helicoidales de los polisacáridos. Para que haya
estructura helicoidal se necesita una cadena con, por lo menos ocho unidades monosacáridas.
Los polisacáridos que a todo lo largo de su molécula muestran estructura helicoidal, como la amilosa,
dan coloración azul intensa. Aquellos que son ramificados con hélices interrumpidas, como la
amilopectina, producen coloraciones menos intensas.
Los altamente ramificados, con segmentos cortos, como el glicógeno, producen color pardo o rojizo.
MATERIALES Y REACTIVOS:
Tubos de ensayo, gradilla, beaker de 600 ml., pipeta de 2 ml y 10 ml, agitador, probeta de 25 ml,
embudo tallo recto, mortero, solución problema de carbohidratos, miel de abeja ( 2 sobres), 100 ml de
leche, clara de un huevo, 100 ml de jugo claro o gaseosa, ácido acético al 25%, carbón activado, glucosa,
fructosa, sacarosa, maltosa, glucosa, xilosa, arabinosa, al 2% almidón, glicógeno y dextrina al 0,5 %, 5
ml de reactivo de Molisch (α-naftol al 2% en etanol ), Ácido sulfúrico concentrado, ácido nítrico
concentrado, ácido clorhídrico concentrado.
20 ml Fenilhidrazina: ( se disuelven 20 grs de clorhidrato de Fenilhidrazina y 30 grs de acetato sódico en
100 ml de agua destilada). Se puede calentar para facilitar la disolución de la Fenilhidrazina y utilizar
todavía caliente. Se debe preparar inmediatamente antes de usar
20 ml reactivo de Fehling. Solución A: sulfato cúprico al 7%; solución B: tartrato sódico potásico al
33% en NaOH al 10%
10 ml reactivo de Benedict: (se disuelven 90 g de carbonato sódico en 600 ml de agua caliente; todavía
en caliente, se disuelven en esta solución 174 g de citrato sódico; la disolución se lleva a 850 ml con
agua y se filtra. Por otro lado, se disuelven 17 g de sulfato de cobre cristalizado en 100 ml de agua; una
vez disuelto se lleva a 150 ml con agua y se añade lentamente a la disolución de citrato-carbonato,
agitando constantemente).
10 ml reactivo de Barfoed: (se disuelven 67 g de acetato cúprico y 9 ml de ácido acético glacial en agua
y se enrasa hasta completar en litro).
10 ml reactivo de Seliwanoff: resorcinol al 0.05% en HCl 3 M
10 ml reactivo de Bial: (orcinol al 0.3% en ácido clorhídrico concentrado; se adicionan 5 gotas de
cloruro férrico al 30%. Se debe preparar inmediatamente antes de usar. 10 ml reactivo de Lugol: yodo al
0.5% en yoduro de potasio al 3%)
PROCEDIMIENTO
Preparación de las muestras biológicas:
Miel de abejas: Disuelva 2 sobres de miel de abejas en agua destilada hasta completar 50 ml. Si es
necesario, caliente suavemente, con agitación constante, dentro de un baño María.
Leche: Deposite 100 ml de leche descremada en un vaso de precipitados de 250 ml. Adicione ácido
acético al 25%, gota a gota y agitando después de cada adición hasta que se produzca un floculo o un
precipitado. En ese momento el pH debe estar cercano a 4.8. Deseche el precipitado y utilice el
sobrenadante para determinar los azucares presentes en la leche.
Suero sanguíneo: Deje en reposo, dentro de una nevera, 100 ml de sangre, durante una hora. Se
centrífuga a 5000 rpm durante diez minutos y se desecha el precipitado. El filtrado constituye el suero
sanguíneo y debe tener un color amarillento. Este se va a utilizar para determinar el (los) azúcar (es)
presente(s).
Clara de huevo: Dentro de una probeta mida el volumen de una clara de huevo. Agregue dos
veces su volumen en agua y agite bien. Con esta solución se harán las pruebas para determinar los
azucares presentes.
Jugos y bebidas: Se pueden utilizar directamente si son transparentes, preferiblemente jugo natural
(limón, piña o naranja) con el fin de no retirar el color con carbón activado.
PRUEBA DE MOLISCH PARA RECONOCIMIENTO DE CARBOHIDRATOS EN GENERAL
Carbohidratos: muestras biológicas, solución problema (dada por el profesor), glucosa, fructosa,
sacarosa y almidón.
Tome 1 ml de las soluciones de carbohidratos y muestras en varios tubos de ensayo y se le añaden tres
gotas de reactivo de Molisch y se agita. Luego, se dejan resbalar por las paredes del tubo de ensayo sin
agitar 1ml de ácido sulfúrico concentrado. Si hay carbohidratos presentes, en la interfase entre los dos
líquidos, debe aparecer un anillo color violeta.
AZUCARES REDUCTORES: PRUEBAS DE FEHLING Y BENEDICT
Carbohidratos: muestras biológicas

, solución problema, glucosa, fructosa, sacarosa y almidón
Reacción de Fehling: En un tubo de ensayo mezcle 2 ml de la solución de Fehling A con 2 ml de la

solución de Fehling B y de inmediato, agregue 1 ml de la solución de carbohidrato. Agite e introduzca
los tubos en un baño de agua hirviente, durante quince minutos. La aparición de una coloración verde,
amarilla, anaranjada o rojiza o de u precipitado rojo (según la concentración del material reductor) indica
la presencia de azúcar reductor.
Reacción de Benedict: Agregue 1 ml de la solución de carbohidrato a 2 ml de reactivo de Benedict.

Agite y caliente en un baño de agua hirviente durante cinco minutos. La formación de un rojo
amarillento indica la presencia de un carbohidrato reductor.
PRUEBA DE BARFOED PARA DISTINGUIR ENTRE MONOSACÁRIDOS Y DISACÁRIDOS
Carbohidratos: muestras biológicas, solución problema, glucosa, fructosa, maltosa y lactosa.
A 2 ml de reactivo de Barfoed agregue 1 ml de la solución de carbohidrato y agite. Caliente el tubo en

un baño de agua hirviente durante cinco minutos. La aparición de un precipitado rojo amarillento indica
la presencia de un monosacárido; los disacáridos reductores se demoran más en producir el mismo
precipitado.
PRUEBA PARA EL RECONOCIMIENTO DE CETOSAS
Carbohidratos: muestras biológicas, solución problema, glucosa, fructosa y sacarosa.
Seliwanoff: A 2 ml del reactivo de Seliwanoff agregue 1 ml de la solución de carbohidrato y caliente

en un baño de agua hirviendo. El desarrollo de un color rojo intenso en pocos minutos es prueba positiva
para cetohexosas, las aldosas dan pruebas más débiles y después de un tiempo mayor.
PRUEBA DE BIAL PARA RECONOCER PENTOSAS
Carbohidratos: muestras biológicas, muestra problema, xilosa, arabinosa y glucosa
A 1 ml de la solución de carbohidrato agregue 3 ml de reactivo de Bial. Agite y caliente en un baño de

agua hirviendo. La aparición de una coloración azul verdosa en unos pocos minutos, es una prueba
positiva para pentosas.
RECONOCIMIENTO DE POLISACÁRIDOS CON EL REACTIVO DE LUGOL
Carbohidratos: muestra biológica, muestra problema, glucosa, dextrina, almidón y glicógeno.
A 1 ml de la solución de carbohidrato agregue dos gotas del reactivo de Lugol y agite. En el caso del
almidón se debe obtener un color azul oscuro mientras que con dextrina y glicógeno la coloración es
pardo rojiza.
RESULTADOS:
En una tabla coloque en forma horizontal los carbohidratos ensayados y en forma vertical las pruebas
realizadas. Indique con +, - ó ? Si los resultados fueron positivos, negativos o dudosos.
Compare los resultados obtenidos con la muestra biológica y con la solución problema y compárelos con
los obtenidos con los diferentes carbohidratos. En base a esa comparación deduzca que carbohidratos se
encuentran presentes en la muestra biológica y la solución problema con las cuales trabajó.

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IDENTIFICACIÓN DE CARBOHIDRATOS

Estos compuestos, furfural o hidroximetilfurfural, reaccionan con compuestos aromáticos (fenoles,

Pruebas para azucares reductores: Fehling y Benedict

Prueba de Barfoed para diferenciar monosacáridos de disacáridos

Reconocimiento de cetosas: reacciones de Seliwanoff y Bang

Prueba de Bial para reconocimiento de pentosas

Reconocimiento de polisacáridos con yodo

Preparación de las muestras biológicas:

PRUEBA DE MOLISCH PARA RECONOCIMIENTO DE CARBOHIDRATOS EN GENERAL

AZUCARES REDUCTORES: PRUEBAS DE FEHLING Y BENEDICT

Carbohidratos: muestras biológicas

Reacción de Fehling: En un tubo de ensayo mezcle 2 ml de la solución de Fehling A con 2 ml de la

Reacción de Benedict: Agregue 1 ml de la solución de carbohidrato a 2 ml de reactivo de Benedict.

PRUEBA DE BARFOED PARA DISTINGUIR ENTRE MONOSACÁRIDOS Y DISACÁRIDOS

Carbohidratos: muestras biológicas, solución problema, glucosa, fructosa, maltosa y lactosa.

A 2 ml de reactivo de Barfoed agregue 1 ml de la solución de carbohidrato y agite. Caliente el tubo en

PRUEBA PARA EL RECONOCIMIENTO DE CETOSAS

Carbohidratos: muestras biológicas, solución problema, glucosa, fructosa y sacarosa.

Seliwanoff: A 2 ml del reactivo de Seliwanoff agregue 1 ml de la solución de carbohidrato y caliente

PRUEBA DE BIAL PARA RECONOCER PENTOSAS

Carbohidratos: muestras biológicas, muestra problema, xilosa, arabinosa y glucosa

A 1 ml de la solución de carbohidrato agregue 3 ml de reactivo de Bial. Agite y caliente en un baño de

Carbohidratos: muestra biológica, muestra problema, glucosa, dextrina, almidón y glicógeno.

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