Analisis Instrumentalde Alimentos EDUNIV2021

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Análisis Instrumental de los Alimentos
Book · February 2021
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Héctor Zumbado
Universidad Técnica de Manabí (UTM)
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ANÁLISIS
Instrumental
DE LOS ALIMENTOS
HÉCTOR ZUMBADO FERNÁNDEZ
Editorial Universitaria
Ministerio de Educación Superior
La Habana, 2021
ANÁLISIS
Instrumental
DE LOS ALIMENTOS
Página legal
543-Z948 2021
Zumbado Fernández, Héctor
Análisis instrumental de los alimentos / Héctor Zumbado Fernández, autor,

edición y diseño de la cubierta. – La Habana : Editorial Universitaria
(Cuba), febrero 2021. – ISBN 978-959-16-4542-5 (PDF interactivo, 16 Mb).
– (xvi, 496 páginas): tablas, ilustraciones y apéndices. – 8,27 por 11,69
pulgadas.
1. Química Analítica; 2. Alimentos; 3. Educación Superior; 4. EcuLibro.

I. Título.
El libro: Análisis instrumental de los alimentos ha sido evaluado por expertos de reconocido prestigio internacional y
ha sido avalado para su publicación y utilización en el proceso de enseñanza-aprendizaje de las universidades
adscritas al Ministerio de Educación Superior de la República de Cuba. El libro es una versión actualizada de la obra:
Análisis instrumental de los alimentos / Héctor Zumbado Fernández. – Editorial Félix Varela, 2015. – ISBN 978-959-
2035-2, la cual recibió, en 2016, el Premio de la Crítica Científico-Técnica, otorgado por el Instituto Cubano del
Libro.
Editorial Universitaria. Calle 23 esquina a F. núm. 565. Sección de Editores de la SOCICT Cuba 460, e/ Teniente
El Vedado, La Habana, portal web Rey y Amargura, La Habana Vieja, portal web
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Disponible en la Plataforma digital EdUniv-SOCICT

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se modifique el contenido de forma alguna, ni se comercialice sin la autorización del autor.
Avalado por Editorial Universitaria para su publicación en Avalado por la SOCICT como fuente confiable para la escritura
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EL AUTOR
Héctor Manuel Zumbado Fernández (1962-). Cubano.

Doctor en Ciencias Pedagógicas (2005), Master en Ciencias
de la Educación Superior (1999) y Master en Ciencia y
Tecnología de los Alimentos (1998). Licenciado en
Alimentos (1985).
Ha impartido docencia en pregrado y postgrado en
temáticas de Análisis de los Alimentos, Química de los
Alimentos, Metodología de la Investigación Científica,
Didáctica Universitaria y Comunicación Educativa, entre otras. Ha realizado
investigaciones en el campo de las ciencias alimentarias y en el área educativa.
De estos temas se han derivado más de 40 publicaciones en revistas nacionales
e internacionales, así como en Memorias de eventos científicos. Autor de 5 libros
de texto.
Trabajó como docente e investigador durante 33 años en el Instituto de Farmacia
y Alimentos de la Universidad de La Habana, fungiendo como miembro del
Comité Académico y del Tribunal Nacional del Doctorado en Ciencias de los
Alimentos. Premio Anual de la Academia de Ciencias de Cuba (2002); ostenta la
Distinción por la Educación Cubana y la Medalla Rafael María de Mendive. En la
actualidad labora como docente en la Universidad Técnica de Manabí, Portoviejo,
Ecuador.
Email: hzumbadof@gmail.com
I ndice de contenidos
Prefacio /1
Capítulo 1. Introducción al Análisis Instrumental de los Alimentos /4

1.1. El análisis de los alimentos /4
1.1.1. Principales campos de aplicación de la química analítica en el área de
los alimentos /5
1.2. Química analítica. Definición y clasificación de los métodos de análisis /9
1.3. Metodología analítica /10
1.3.1. Determinación de los objetivos analíticos /12
1.3.2. Selección del método analítico /13
1.3.3. Muestreo y toma de la muestra /14
1.3.4. Preparación de la muestra /16
1.3.5. Procedimiento de determinación /20
1.3.6. Cálculos e interpretación de los resultados /21
1.4. Los métodos instrumentales de análisis de los alimentos /21
1.4.1. Tipos de métodos instrumentales /22
1.4.2. Instrumentos para el análisis /24
1.4.3. Parámetros de calidad de los métodos e instrumentos /25
1.4.3.1. Precisión /26
1.4.3.2. Veracidad o justeza /28
1.4.3.3. Linealidad /31
1.4.3.4. Sensibilidad /33
1.4.3.5. Límite de detección /34
1.4.3.6. Límite de cuantificación /34
1.4.3.7. Intervalo de concentración /35
1.4.3.8. Selectividad /36
Trabajo independiente /37
Bibliografía /37
Capítulo 2. Introducción a los métodos ópticos /39

2.1. Características de la radiación electromagnética /39
2.2. Espectro electromagnético /42
2.3. Interacción de radiación electromagnética con la materia /43
2.3.1. Absorción de radiación electromagnética /43
Índice de contenidos
2.3.1.1. Espectros de absorción /44

2.3.1.2. Absorción atómica /45
2.3.1.3. Absorción molecular /45
2.3.2. Emisión de radiación electromagnética /48
2.3.3. Refracción de radiación electromagnética /49
2.3.4. Polarización de radiación electromagnética /51
2.4. Clasificación de los métodos ópticos /53
Bibliografía /53
Capítulo 3. Espectrometría de absorción molecular ultravioleta y visible /55

3.1. Regiones del espectro Ultravioleta-Visible /55
3.2. Características de los espectros de absorción en la región UV-Visible /56
3.3. Leyes que rigen la absorción /57
3.3.1. Desviaciones de la Ley de Lambert-Beer /60
3.4. Especies absorbentes /61
3.4.1. Especies químicas absorbentes que contienen electrones ,  y n /62
3.4.2. Absorción por transferencia de carga /67
3.5. Instrumentos de medición /68
3.5.1. Fuentes de radiación /69
3.5.2. Selector de longitud de onda /70
3.5.3. Recipientes para muestras /71
3.5.4. Detectores /72
3.5.5. Registro y procesamiento de datos /73
3.6. Aplicaciones cualitativas de la espectrometría de absorción UV-visible /73
3.7. Aplicaciones cuantitativas de la espectrometría UV-visible /74
3.7.1. Establecimiento de las condiciones de trabajo /75
3.7.1.1. Elección de la longitud de onda de trabajo /75
3.7.1.2. Reacciones de derivatización a considerar /76
3.7.1.3. Variables que influyen en la absorbancia /77
3.7.1.4. El ensayo en blanco /77
3.7.2. Métodos de cuantificación /77
3.7.2.1. Método del patrón externo /78
3.7.2.2. Curva de calibración /79
3.8. Aplicaciones en el análisis de los alimentos /85
Bibliografía /88
Capítulo 4. Espectrometría de absorción atómica /89

4.1. Principios generales de la espectrometría de absorción atómica /90
4.2. Técnicas de atomización de la muestra /92
4.2.1. Atomización con llama /92
4.2.2. Atomización electrotérmica /96
4.3. Fuentes de radiación /99
4.4. Interferencias en espectroscopia de absorción atómica /101
4.4.1. Interferencias espectrales /101
4.4.2. Interferencias químicas /102
4.5. Técnicas analíticas de absorción atómica /105
4.5.1. Preparación de la muestra /105
4.5.2. Análisis cualitativo /106
4.5.3. Análisis cuantitativo /107
4.6. Aplicaciones de la espectrometría de absorción atómica /110
4.6.1. Aplicaciones en el análisis de los alimentos /111
Bibliografía / 113
Capítulo 5. Espectrometría de emisión atómica /115

5.1. Principios generales de la espectrometría de emisión atómica /115
5.2. Espectroscopia de emisión con fuentes de plasma /118
5.2.1. La fuente de plasma de acoplamiento inductivo /119
5.2.2. La fuente de plasma de corriente continua / 122
5.2.3. Aplicaciones de las fuentes de plasma /123
5.3. Espectroscopia de emisión con fuentes de arco y chispa /126
5.3.1. Espectroscopia de emisión con fuente de arco /127
5.3.2. Fuentes de chispa y espectros de chispa /129
5.4. Fuentes de emisión de llama /130
Bibliografía /131
Capítulo 6. Espectrometría de fluorescencia molecular /132

6.1. Teoría de la fluorescencia /132
6.1.1. Diagrama de niveles de energía para las moléculas fluorescentes /132
6.1.2. Procesos de desactivación /133
6.2. Variables que afectan a la fluorescencia /136
6.2.1. Rendimiento cuántico /136
6.2.2. Tipos de transiciones en fluorescencia /137

6.2.3. Eficacia cuántica y tipo de transición /137
6.2.4. Fluorescencia y estructura /138
6.2.5. Efecto de la rigidez estructural /139
6.2.6. Efectos de la temperatura y del disolvente /140
6.2.7. Efecto del pH en la fluorescencia /140
6.2.8. Efecto del oxígeno disuelto /141
6.2.9. Efecto de la concentración en la intensidad de fluorescencia /141
6.3. Instrumentos para la medida de la fluorescencia /142
6.3.1. Componentes de los fluorómetros y de los espectrofluorímetros /143
6.4. Aplicaciones de los métodos fluorescentes /144
Bibliografía /146
Capítulo 7. Refractometría y polarimetría /147

7.1. Refractometría /147
7.1.1. Variables que afectan las mediciones del índice de refracción /147
7.1.2. Instrumentos para medir el índice de refracción /148
7.1.2.1. Refractómetros óptico-mecánicos /149
7.1.2.2. Refractómetros automáticos digitales /153
7.1.3. Aplicaciones de la refractometría /154
7.2. Polarimetría /158
7.2.1. Variables que afectan la rotación óptica /159
7.2.2. Polarímetros /160
7.2.2.1. Sacarímetros /164
7.2.2.2. Polarímetros automáticos / 164
7.2.3. Aplicaciones de la polarimetría /166
Bibliografía /168
Capítulo 8. Introducción a los métodos cromatográficos /169

8.1. Generalidades /169
8.2. Clasificación de los métodos cromatográficos /171
8.3. Mecanismos de separación cromatográfica /173
8.3.1. Cromatografía de adsorción /173
8.3.2. Cromatografía de reparto /175
8.3.3. Cromatografía de intercambio iónico /177
8.3.4. Cromatografía de filtración sobre gel /181

Bibliografía /184
Capítulo 9. Cromatografía en columna /185

9.2. Etapas de trabajo de la cromatografía líquida en columna convencional /186
9.2.1. Selección y preparación de la fase móvil y la fase estacionaria /186
9.2.2. Aplicación de la muestra /188
9.2.3. Corrida cromatográfica y elución de los componentes /188
9.2.4. Recogida de los eluatos y detección de los componentes /190
9.2.5. Identificación y cuantificación de los compuestos separados /192
9.3. Eficiencia de una columna cromatográfica /193
9.3.1. Teorías de la elución cromatográfica /195
9.3.1.1. Teoría de los platos teóricos /196
9.3.1.2. Teoría cinética /197
9.3.2. Otros parámetros cromatográficos de interés /202
Bibliografía /205
Capítulo 10. Cromatografía líquida de alta resolución /206

10.2. Descripción del proceso cromatográfico /207
10.3. Los componentes del sistema cromatográfico /208
10.3.1. La fase móvil /209
10.3.2. La bomba /212
10.3.3. Sistema de inyección o válvula de introducción de muestras /214
10.3.4. La precolumna /216
10.3.5. La columna cromatográfica /216
10.3.5.1. Características generales /216
10.3.5.2. La fase estacionaria /219
10.3.5.3. Los mecanismos de separación en HPLC /222
10.3.5.4. Especificaciones de las columnas cromatográficas /230
10.3.5.5. Problemas de la columna cromatográfica /231
10.3.6. Los detectores /233
10.3.6.1. Detectores espectrofotométricos UV-Vis /233
10.3.6.2. Detector refractométrico /234
10.3.6.3. Detector de fluorescencia /235

10.3.6.4. Detector electroquímico /235
10.3.6.5. Detector de conductividad /237
10.3.6.6. Otros detectores usados en HPLC /237
10.3.6.7. Acople de la HPLC con espectrometría de masas /238
10.3.7. Sistema de registro y procesamiento de la información
cromatográfica /243
10.3.8. El colector de fracciones /244
10.4. Modos de operación en HPLC /245
10.4.1. Régimen isocrático /245
10.4.2. Programación de la composición de la fase móvil /246
10.4.2.1. La Elección de los Solventes A y B /247
10.4.2.2. Tipos de gradiente /247
10.4.3. Programación de flujo o presión de la fase móvil /249
10.4.4. Programación de temperatura /250
10.5. Tratamiento de muestras para HPLC /250
10.5.1. Extracción en fase sólida /251
10.5.2. Microextracción en fase sólida /252
10.6. Aplicaciones analíticas de HPLC /254
10.6.1. Análisis cualitativo /255
10.6.1.1. Comparación de los tiempos de retención /256
10.6.1.2. Anchura en la altura media /256
10.6.1.3. Enriquecimiento de pico /257
10.6.1.4. Utilización de un detector con arreglo de diodos /257
10.6.1.5. Acoplamiento en línea de HPLC con técnicas
espectroscópicas /258
10.6.1.6. Colección de analitos eluidos e identificación por técnicas
espectroscópicas, de microanálisis y por cromatografía de
capa delgada /258
10.6.2. Análisis cuantitativo /259
10.6.2.1. Método de la curva de calibración /262
10.6.2.2. Método del patrón externo /262
10.6.2.3. Método del patrón interno /264
10.6.2.4. Método de normalización interna /269
10.6.3. Límite de detección y límite de cuantificación /270
10.7. HPLC preparativa /271
10.7.1. La fase móvil /272
10.7.2. Solubilidad de la muestra en la fase móvil /272

10.7.3. Importancia relativa del número de platos teóricos y el factor de
selectividad /273
10.7.4. La masa de la muestra a inyectar /273
10.7.5. Rendimiento /273
10.7.6. Alcance y requerimientos materiales de la HPLC preparativa /274
Bibliografía /275
Capítulo 11. Cromatografía de gases /278

11.2. Descripción del proceso cromatográfico /278
11.3. El cromatógrafo de gases /280
11.3.1. Los gases /280
11.3.2. Prefiltros /282
11.3.3. Control de flujo. Manoreductor /283
11.3.4. La cámara de inyección /283
11.3.4.1. La cámara de inyección para columnas empacadas /285
11.3.4.2. El inyector y los métodos de inyección para columnas
capilares /287
11.3.5. La columna cromatográfica /290
11.3.5.1. Columnas empacadas /291
11.3.5.2. Columnas capilares /297
11.3.6. El horno /301
11.3.6.1. Cromatografía a temperatura programada /302
11.3.7. El detector /305
11.3.7.1. Características fundamentales de los detectores /305
11.3.7.2. Descripción del principio y aplicaciones de algunos
detectores de gran uso /308
11.3.7.2.1. Detectores de conductividad térmica /308
11.3.7.2.2. Detector de ionización por llama /310
11.3.7.2.3. Detector de captura electrónica /312
11.3.7.2.4. Detector termoiónico /315
11.3.7.2.5. Detector fotométrico de llama /316
11.3.7.2.6. Acoplamiento GC-MS /318
11.3.8. Amplificador /320
11.3.9. Registrador /320
11.4. Tratamiento de muestras en cromatografía de gases /321
11.4.1. Derivatización /321

11.4.2. Técnicas empleadas para la extracción de componentes volátiles
/323
11.4.2.1. Microextracción en fase sólida /324
11.5. Aplicaciones analíticas de la cromatografía de gases /327
11.5.1. Uso de columnas de diferente polaridad /328
11.5.2. Utilización de varios detectores /328
11.5.3. Partición seguida de cromatografía gaseosa /329
11.5.4. Transesterificacion /329
11.5.5. Desplazamiento de un pico por modificación química /329
Bibliografía /330
Capítulo 12. Cromatografía en capa delgada /333

12.2. Naturaleza del proceso cromatográfico /337
12.3. Placas cromatográficas /338
12.4. Aplicación de la muestra /341
12.5. Técnicas de desarrollo de los cromatogramas /343
12.6. Técnicas de revelado /349
12.6.1. Revelado físico /349
12.6.2. Revelado químico /349
12.7. Análisis cualitativo /351
12.8. Análisis cuantitativo /353
12.8.1. Método de elución de los componentes /353
12.8.2. Métodos densitométricos /354
Bibliografía /358
Capítulo 13. Métodos potenciométricos /359

13.1. Principios generales de los métodos potenciométricos /359
13.2. Electrodos de referencia /362
13.2.1. Electrodos de Calomel /363
13.2.2. Electrodos de plata/cloruro de plata /364
13.3. Electrodos indicadores /364
13.3.1. Electrodos indicadores metálicos /365
13.3.2. Electrodos indicadores de membrana /367
13.4. Aplicaciones de los métodos potenciométricos /370
13.4.1. Métodos potenciométricos directos /371

13.4.2. Métodos potenciométricos indirectos /372
13.4.3. Preparación de muestras y límites de detección /375
13.4.4. Aplicaciones de los métodos potenciométricos en el análisis de los
alimentos /375
Bibliografía /378
Capítulo 14. Ejercicios y problemas /379

14.1. Ejercicios propuestos /379
14.2. Problemas integradores /403
14.3. Análisis de documentación científica /413
Capítulo 15. Aplicaciones de los métodos instrumentales en la investigación

científica /417
15.1. Determinación de polisacáridos totales en gel líquido de Aloe Vera L, para
su empleo como materia prima en formulaciones de suplementos
dietéticos /420
15.2. Leche fluida y yogur natural enriquecidos con hierro /424
15.3. Desinfestación del frijol de soja por irradiación /432
15.4. Caracterización analítica de alginato de sodio /437
15.5. Validación de un método para la determinación de patulina en jugos y
purés de frutas por HPLC /447
15.6. Carotenoides séricos y su relación con la dieta en un grupo de adultos
cubanos /453
15.7. Ocurrencia de aflatoxina M1 en leches cruda, ultrapasteurizada y orgánica
producidas y comercializadas en el altiplano mexicano /463
15.8. Análisis de los compuestos volátiles del tomate de árbol (Cyphomandra
betacea Sendtn.) mediante microextracción en fase sólida /473
15.9. Método de microextracción en fase sólida para el análisis de compuestos
volátiles en cervezas /479
15.10. Validación de un método por cromatografía de gases para la
determinación de los ácidos grasos que componen el D-004 ingrediente
activo /486
Apéndices
Apéndice A. Resumen de los aspectos generales del análisis de los alimentos
A-1. Lugar y papel del análisis de los alimentos en las Ciencias
Alimentarias
A-2. Metodología analítica
A-3. Algunos procedimientos de preparación de la muestra
A-4. Criterios de calidad de los instrumentos y métodos de análisis
Apéndice B. Resumen de los métodos ópticos

B-1. Resumen gráfico de los métodos de absorción
B-2. Resumen gráfico de los métodos de emisión
B-3. Procedimientos más usuales para el tratamiento de muestras en los
métodos ópticos estudiados
B-4. Características de los instrumentos empleados en los métodos ópticos
estudiados
B-5. Resumen de los procedimientos de cuantificación empleados en los
métodos ópticos estudiados
B-6. Parámetros estadísticos a considerar para verificar el ajuste del
modelo a los resultados experimentales en los procedimientos
analíticos de curva de calibración, adición de patrón y patrón interno
B-7. Resumen gráfico de los métodos refractométricos y polarimétricos
Apéndice C. Resumen de los métodos cromatográficos
C-1. Resumen gráfico de la clasificación de los métodos cromatográficos
C-2. Mecanismos de separación en cromatografía
C-3. Eficiencia de una columna cromatográfica
C-4. Principios de funcionamiento de los métodos cromatográficos
estudiados
C-5. Instrumentación empleada en cromatografía líquida de alta resolución
(HPLC)
C-6. Instrumentación empleada en cromatografía de gases (GLC)
C-7. Procedimientos de identificación empleados en HPLC y Cromatografía
de gases
C-8. Procedimientos de cuantificación empleados en HPLC y Cromatografía
de gases
C-9. Procedimientos de identificación y cuantificación empleados
cromatografía en capa delgada (CCD)
C-10. Comparación entre la cromatografía líquida de alta resolución
(HPLC) y la cromatografía de gases (GLC)
Apéndice D. Resumen de los métodos potenciométricos
D-1. Principios y electrodos
D-2. Aplicaciones de los métodos potenciométricos
P refacio
La Ciencia dispone hoy en día de una serie impresionante de poderosas y

selectivas herramientas instrumentales para obtener información cualitativa y
cuantitativa acerca de la composición y estructura de la materia. A estos
métodos modernos, que emplean instrumentos de medición con mayor o menor
grado de sofisticación, para la separación y determinación de especies químicas
en matrices generalmente complejas, se les conoce, en conjunto, como métodos
instrumentales de análisis.
Sin embargo, la correcta elección y el buen uso de los métodos modernos de
análisis instrumental, requiere la comprensión de los principios fundamentales en
los que se basan estos sistemas de medida. Sólo así se puede elegir de forma
adecuada entre las distintas alternativas para resolver un problema analítico, y
sólo así se podrán valorar las dificultades inherentes a las medidas físicas y esta-
blecer un criterio respecto a las limitaciones de las medidas instrumentales en
cuanto a la sensibilidad, precisión y exactitud.
Este libro va dirigido especialmente a los profesionales y estudiantes de las
Ciencias Alimentarias. Los textos básicos que tradicionalmente se han utilizado
para el estudio del Análisis Instrumental, si bien han tenido un adecuado nivel
científico técnico, han carecido de un enfoque analítico dirigido al campo de los
alimentos, lo cual ha conspirado contra el necesario estudio independiente que
garantice una adecuada profundización de los contenidos en una enseñanza de
nivel superior.
Si bien el análisis instrumental incluye un gran número de métodos, no todos
aparecen en este libro, sino solo aquellos de mayor y más frecuente aplicación
en matrices alimentarias. Así por ejemplo, técnicas espectroscópicas tan
poderosas desde el punto de vista cualitativo como la espectroscopia infrarroja,
la espectrometría de masas y la espectroscopia de resonancia magnética nuclear
no se incluyen en este texto porque su empleo en el análisis de los alimentos es
muy poco frecuente. Lo mismo ocurre con los métodos electroanalíticos de
electrogravimetría, polarografía, conductimetría, amperometría y voltametría, los
cuales tampoco aparecen referidos por las mismas razones.
Con esta idea, el objetivo de este texto es proporcionar al profesional de las
Ciencias Alimentarias una introducción a los principios de los métodos de análisis
espectrométricos, cromatográficos y potenciométricos1.
1
Debe señalarse que los contenidos incluidos en este libro pueden ser también útiles para profesionales y
estudiantes de las áreas de Ciencias biológicas, Química, Ciencias de la salud, Ingeniería y Ciencias
medioambientales, entre otras.
Análisis Instrumental de los Alimentos 1

Prefacio
En el Capítulo 1 se abordan los principios generales del análisis instrumental,

aplicado al campo de las ciencias alimentarias revelándose su importancia y los
principales campos de aplicación de los métodos instrumentales en la evaluación
de los alimentos. Especial interés revisten los epígrafes relacionados con el
esquema de un análisis completo a los cuales se debe prestar una particular
atención dado que constituyen el hilo conductor de cualquier procedimiento
analítico dirigido a la determinación de un componente en un alimento.
Cualquiera que sea el método de análisis químico aplicado a una materia prima o
producto terminado, con independencia de los fundamentos teóricos que
sustenten estos métodos (volumétricos, gravimétricos, ópticos, cromatográficos,
electroanalíticos, etc), será obligado transitar de alguna u otra forma por las
etapas que integran este esquema general de trabajo y expresar finalmente los
resultados como una forma de concentración.
Los fundamentos básicos de los métodos ópticos se explican en el primero de los
cuatro capítulos dedicados ellos (Capítulo 2). Le siguen capítulos más detallados
sobre espectrometría de absorción molecular UV-Vis (Capítulo 3), espectrometría
de absorción y emisión atómica (Capítulos 4 y 5) y espectrometría de
fluorescencia molecular (Capítulo 6). El Capítulo 7 se dedica al estudio de la
refractometría y la polarimetría que, aunque de menor empleo que los anteriores
presentan algunas aplicaciones de interés en el análisis de los alimentos. La
información que aparece en estos capítulos incluye los principios generales, los
componentes instrumentales y las aplicaciones cualitativas y cuantitativas de
estos métodos.
El Capítulo 8, constituye el primero de una serie de cinco, dedicados a las
separaciones cromatográficas, donde se expone los fundamentos generales de
estos importantísimos métodos de análisis. Los cuatro restantes se dedican al
estudio particular de la cromatografía en columna clásica (Capítulo 9), la
cromatografía líquida de alta resolución (Capítulo 10), la cromatografía de gases
(Capítulo 11) y la cromatografía en capa delgada (Capítulo 12).
El último de los capítulos del cuerpo teórico del libro se centra en el estudio de
los métodos potenciométricos (Capítulo 13) el cual es el único de los
procedimientos electroanalíticos que se tratan en este texto por las razones
antes expuestas.
El Capítulo 14 (Ejercicios y problemas) incluye 19 ejercicios y 4 problemas
integradores elaborados especialmente para este texto con vistas a facilitar la
necesaria ejercitación que requiere una disciplina de este tipo. Se presenta
también en este capítulo un epígrafe especial dedicado al análisis de
documentación científica cuyo objetivo es el estudio e interpretación de algunos
artículos científicos que aparecen en el capítulo 15.
Finalmente se presenta el Capítulo 15 (Aplicaciones de los métodos
instrumentales en la investigación científica) en el cual aparecen de forma
íntegra 10 artículos científicos publicados en revistas nacionales e internacionales
40d78409-8f5a-44ad-af96-811f110af4ad
Prefacio
entre los años 1995 y 2010, donde se evidencia la aplicación concreta de los
elementos teóricos y prácticos contenidos en el texto, en la resolución de
problemáticas actuales en el campo de los alimentos y donde se pone de
manifiesto el carácter multidisciplinario de la ciencia, puesto que se integran
elementos de diferentes asignaturas y disciplinas que ya ha recibido, está
recibiendo o incluso recibirá el estudiante de la especialidad de Ciencias
Alimentarias (Análisis Químico, Química de los Alimentos, Bioestadística,
Evaluación Sensorial, Toxicología y Nutrición, entre otras).
Se incluyen también en este texto cuatro apéndices, a modo de resúmenes de
los aspectos más importantes de los métodos abordados, presentados en forma
de esquemas y tablas principalmente.
Es importante señalar que al finalizar los capítulos teóricos (con excepción del
capítulo 2), se orienta un estudio independiente consistente por lo general en la
resolución de determinados ejercicios y problemas incluidos en el Capítulo 14.
También pueden encontrarse orientaciones para resolver tareas docentes
relacionadas con el estudio y análisis de los artículos científicos que aparecen en
el Capítulo 15 o consultar algunos de los resúmenes que aparecen en el apartado
Apéndices.
En este sentido, insistimos en la importancia de realizar el trabajo independiente,
justo en el momento en que se orienta, pues es precisamente inmediatamente
después de estudiar un contenido que se está en mejores condiciones para
ejercitar los conceptos estudiados.
Escribir este libro constituyó una tarea laboriosa y compleja, que requirió muchos
meses de profundo estudio, reflexión, búsqueda de información y consultas con
especialistas. Entre la bibliografía consultada cabe destacar los textos Principios
de Análisis Instrumental, de Skoog, D; Holler, F y Nieman, T. (2001) y la obra
Métodos cromatográficos, de Dierksmeier, G. (2005), en las que encontré
valiosas informaciones que contribuyeron de forma significativa al diseño de esta
obra.
Esperamos que esta obra les sea útil a profesionales y estudiantes del campo de
la química analítica instrumental, particularmente a aquellos que se desempeñan
en el fascinante mundo de los alimentos. Agradecemos por anticipado sus
opiniones y sugerencias sobre la forma y contenido de este libro. Ustedes, los
lectores, tendrán la última palabra.
El autor

1 Introducción al Análisis Instrumental
de los Alimentos
1.1. EL ANÁLISIS DE LOS ALIMENTOS

La importancia de la alimentación como necesidad vital es un hecho
incuestionable conocido por todos. Si bien es importante comprender esta
verdad, también es necesario conocer como nos alimentamos, es decir cuál es la
calidad de los alimentos que ingerimos, sobre todo por la gran relación que se ha
demostrado que tiene la alimentación con la salud. La alimentación por ser un
acto reiterado, a largo plazo y vital, constituye el factor ambiental que más
influye en la etiología, es decir la causa, de numerosas enfermedades como el
cáncer, la obesidad, la ateroesclerosis, etc.
Los alimentos no son compuestos estáticos, sino dinámicos y consecuentemente
las ciencias alimentarias deben estudiar la composición de los alimentos y los
efectos que sus componentes provocan en el curso de los diferentes procesos a
que están sujetos los alimentos, investigando y descubriendo las conexiones que
existen entre la estructura de los diferentes compuestos y sus propiedades
organolépticas así como su capacidad de deterioro en función de su composición
química.
La caracterización de los alimentos proviene de los resultados de los diferentes
ensayos a que puede sometérseles utilizando diferentes métodos de evaluación,
los cuales pueden agruparse en función de los objetivos que persigan y los
principios en que se fundamentan. Así, la evaluación de los alimentos involucra
tres tipos de análisis: análisis físico-químico, análisis microbiológico y análisis
sensorial.
Análisis físico-químico: Implica la caracterización de los alimentos desde el
punto de vista físico-químico, haciendo énfasis en la determinación de su
composición química, es decir, cuales sustancias están presentes en un alimento
(proteínas, grasas, vitaminas, minerales, hidratos de carbono, contaminantes
metálicos, residuos de plaguicidas, toxinas, antioxidantes, etc.) y en qué
cantidades estos compuestos se encuentran. El análisis físico-químico brinda
poderosas herramientas que permiten caracterizar un alimento desde el punto de
vista nutricional y toxicológico, y constituye una disciplina científica de enorme
impacto en el desarrollo de otras ciencias como la bioquímica, la medicina y las
ciencias farmacéuticas, por solo mencionar algunas.
Análisis microbiológico: Los alimentos son sistemas complejos de gran riqueza
nutritiva y por tanto, sensibles al ataque y posterior desarrollo de
microorganismos (bacterias, hongos y levaduras). En todos los alimentos hay
40d78409-8f5a-44ad-af96-811f110af4ad
1. Introducción al Análisis Instrumental de los Alimentos
siempre una determinada carga microbiana, pero esta debe ser controlada y no
debe sobrepasar ciertos límites, a partir de los cuales comienza a producirse el
deterioro del producto con la consecuente pérdida de su calidad y aptitud para el
consumo. Por otra parte, existen microorganismos patógenos que producen
enfermedades y cuya presencia es por tanto indeseable y hace
extraordinariamente peligroso su consumo. El análisis microbiológico se realiza
entonces con vistas a identificar y cuantificar los microorganismos presentes en
un producto, así como también constituye una poderosa herramienta en la
determinación de la calidad higiénico-sanitaria de un proceso de elaboración de
alimentos, lo que permite identificar aquellas etapas del proceso que puedan
favorecer la contaminación del producto.
Análisis sensorial: Constituye una disciplina científica que permite evaluar,
medir, analizar e interpretar las características sensoriales de un alimento (color,
olor, sabor y textura) mediante uno o más órganos de los sentidos humanos. A
pesar de que la evaluación sensorial es el análisis más subjetivo, pues el
instrumento de medición es el ser humano, muchas veces define el grado de
aceptación o rechazo de un producto. Está claro que un alimento que no resulte
grato al paladar, a la vista o al olfato, no será aceptado, aunque contenga todos
los constituyentes nutritivos necesarios y esté apto desde el punto de vista
microbiológico.
Debe tenerse muy presente que ninguno de los métodos señalados tiene mayor
o menor importancia que los otros y todos desempeñan un gran papel en la
determinación del valor de los alimentos. Solo la aplicación articulada y
consecuente de los métodos físico-químicos, microbiológicos y sensoriales puede
ofrecer evidencia objetiva de la calidad integral de un alimento.
Los contenidos que se presentan en este texto, estarán centrados en el estudio
de los métodos instrumentales de análisis. De ahí, que a continuación reseñaremos
brevemente cuales son los principales campos de aplicación de estos métodos en
las ciencias alimentarias, de los cuales se deriva su incuestionable importancia.
1.1.1. Principales campos de aplicación de la química analítica en el área
de los alimentos.
1. Control de la calidad.
La norma ISO 9000 define el término “calidad” como el conjunto de
propiedades y características de un producto o servicio que le confieren su
actitud para satisfacer necesidades al consumidor.
Hoy en día, ningún producto sale al mercado sin antes ser sometido a un
riguroso control de calidad que garantice su aceptación para ser
comercializado. En los alimentos el control de calidad constituye una etapa
más del proceso productivo y adquiere una particular importancia por la
relación existente entre la alimentación y la salud. Por otra parte, el control
de calidad en la industria de los alimentos permite encontrar las fallas y los
errores en el proceso de fabricación y en lo que respecta a las materias
primas, almacenamiento, transportación, etc., proponiendo medidas eficaces

para disminuir o eliminar estos errores.
Las determinaciones físico-químicas que se realizan a los alimentos como
parte del control de calidad, así como los límites en que deben encontrarse los
componentes que se cuantifican están normadas en documentos técnicos y
dependen del tipo de alimento.
A modo de ejemplo, se relacionan a continuación las especificaciones de
calidad que deben cumplir algunos productos alimenticios elaborados (tabla
1.1).
Tabla 1.1. Indicadores físico químicos generales por grupo de alimentos.
Grupos de Indicadores
Indicadores específicos
alimentos generales
Leche y derivados pH, Acidez, Grasa, • Humedad (Leche en polvo y quesos)
Proteína, Caracteres • Sólidos totales (Helado, leche
organolépticos. pasteurizada, yogurt)
• Densidad (leche fluida)
• Cloruros (Quesos)
Productos Cárnicos pH, Acidez, Grasa, • Humedad (Embutidos)
Proteína, Cloruros
Pescados, mariscos y pH, Acidez, Cloruros, • Peróxidos (conservas en aceite)
productos de la Grasa, Proteínas, • Humedad (Embutidos)
pesca. Caracteres
organolépticos.
• Densidad (Vinos)
Bebidas alcohólicas Acidez total, Grado • Acidez Volátil (Vinos)
alcohólico • Sólidos solubles (Licores, cervezas)
• CO2 (Cervezas)
Bebidas no Acidez, pH • CO2 (Refrescos carbonatados, Maltas)
alcohólicas (incluye
vinagres)
Cereales, granos y Humedad • Cenizas (Harinas, Especias)
especies secas • Acidez (Harinas)
Grasas y Aceites Acidez, Índice de • Punto de Fusión (Margarinas)
comestibles (incluye Peróxido, Índice de • Contenido de grasa total (Mayonesa)
Mayonesa) Yodo, Ácidos grasos,
Caracteres
organolépticos, Kreiss
Frutas y Vegetales pH, Acidez • Sólidos Solubles (Conservas de
tomate, Néctares, Frutas y Vegetales
en almíbar)
• Cloruros (Conservas de Vegetales)
Caldos y sopas Humedad • Cenizas (Caldos y sopas)
deshidratadas, sal, • Sólidos insolubles (Sal)
azúcares y polvos en
general (incluye café)
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Grupos de Indicadores
Indicadores específicos
alimentos generales
Confituras Humedad
(Chocolates,
Caramelos, gelatinas)
Pastas alimenticias y Humedad
galletas en general
Salsas condimentadas pH, Acidez • Cloruros (Salsa de soya)
y aderezos • Índice de peróxido (salsas a base de
grasa)
El control de calidad no se circunscribe solo al producto final, sino que

también deben controlarse rigurosamente la materia prima y el producto
durante el propio proceso de elaboración. Así, por ejemplo, en la fabricación
de yogurt, la leche que se emplea como materia prima debe poseer
determinados niveles de acidez, proteínas y grasas que son necesarios
controlar. Luego durante el proceso de elaboración es indispensable
determinar el % de acidez expresado como ácido láctico, puesto que niveles
entre 0.6 y 0.8 % indican el momento de detener la fermentación.
Debe señalarse que si bien se ha hecho énfasis en el control físico-químico
existen parámetros microbiológicos y sensoriales que igualmente son
determinados como parte del control de calidad.
2. Estudios de almacenamiento y conservación.
Durante la etapa de almacenamiento, los alimentos pueden sufrir
transformaciones que involucren cambios en su composición química con la
consecuente aparición de productos indeseables que afectan su conservación
y por ende su aptitud para el consumo. Así, la efectividad de un nuevo envase
o método de conservación y/o almacenamiento, puede ser evaluada a través
de la determinación cualitativa o cuantitativa de ciertas sustancias. Por
ejemplo, la presencia de peróxidos en los aceites y grasas comestibles, es
indicativo de la ocurrencia de procesos oxidativos en los lípidos que
imposibilitan su consumo. Por otra parte, el incremento del contenido de
azúcares reductores en mermeladas y compotas puede ser resultado de
procesos hidrolíticos que sufre el almidón por acción de enzimas secretadas
por microorganismos. En ambos casos, las determinaciones de estos
componentes (peróxidos y azúcares reductores) se realiza usando métodos
físico- químicos y constituyen una medida de la estabilidad del producto,
bajo las condiciones de conservación y almacenamiento.
Debe señalarse que algunos estudios de almacenamiento se realizan como
parte del control de calidad. Otros sin embargo se integran en el campo de la
investigación.

3. Estudios nutricionales y toxicológicos.

El valor nutricional de un alimento depende obviamente de su composición
química y está asociado no solo a la cantidad de nutrimentos que posea sino
también y sobre todo a la calidad de estos nutrimentos. No basta con conocer
la cantidad de proteínas o grasas presentes en un alimento sino que también
es necesario conocer como estos se metabolizan y la incidencia que los
mismos tienen en la salud. Mediante los métodos instrumentales es posible
no solo determinar la cantidad de proteínas o grasas de un alimento sino
también la composición de aminoácidos que poseen las proteínas y la
proporción de ácidos grasos presentes en los lípidos.
Por otra parte, la calidad de un alimento depende también de su inocuidad, es
decir de la ausencia de ciertas sustancias que pueden resultar tóxicas y por
tanto dañinas al organismo. Estas sustancias son de naturaleza muy variada y
pueden contaminar los alimentos durante los procesos tecnológicos de
elaboración o ser parte de una contaminación ambiental del producto
(contaminación metálica con los envases o durante el proceso productivo,
presencia de aflatoxinas como resultado de una contaminación fúngica,
presencia de residuos de plaguicidas, etc.). Otras sustancias tóxicas son
componentes naturales en los alimentos (glicósidos cianogénicos, alcaloides,
aminas biógenas, etc.) o se forman como resultado de procesos fermentativos
por microorganismos (formación de metanol, alcoholes superiores, etc.).
También existen sustancias denominadas aditivos, que se añaden
intencionalmente dado que cumplen alguna función en el proceso de
elaboración (preservantes, colorantes, saborizantes, espesantes,
estabilizadores, etc.) y algunas de ellas poseen efectos tóxicos si se
sobrepasan determinados niveles, por lo que su presencia debe ser
rigurosamente controlada.
Resulta entonces extraordinariamente importante realizar estudios dirigidos a
evaluar el estado toxicológico de un alimento. En este sentido debe
destacarse que una enorme cantidad de sustancias tóxicas pueden ser
analizadas cualitativa y cuantitativamente empleando métodos instrumentales
de análisis.
4. Estudios de nuevas fuentes de alimentación no convencionales y
productos para regímenes especiales.
La búsqueda de nuevas fuentes de alimentación no convencionales (salvado
de arroz, frijol de soya, espirulina, etc.), así como la formulación de nuevos
productos utilizando estas fuentes es un objetivo esencial de la investigación
actual, que requiere la aplicación de numerosos métodos de análisis químico
con vistas a caracterizar nutricionalmente estos productos y evaluar su
factibilidad en la alimentación humana.
Por otra parte, hoy se investigan y producen un conjunto de alimentos
dirigidos a grupos de consumidores que reclaman una alimentación especial
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(deportistas, diabéticos, obesos, personas con trastornos del metabolismo,

etc.). Sin el auxilio de la química analítica estos estudios serían imposibles de
completar satisfactoriamente.
El impacto y alcance de los métodos instrumentales en la producción y la
investigación es enorme. Los diferentes campos de aplicación en el área de
los alimentos, arriba referidos, constituyen tan solo algunos ejemplos de la
extraordinaria importancia de la química analítica como herramienta
indispensable para el desarrollo de investigaciones que pueden conllevar a
nuevos hallazgos y descubrimientos en las ciencias alimentarias.
1.2. QUÍMICA ANALÍTICA. DEFINICIÓN Y CLASIFICACIÓN DE LOS

MÉTODOS DE ANÁLISIS.
Para poder realizar el análisis químico de los alimentos, hay que auxiliarse de
una de las más antiguas e importantes de las ramas de la química: “la química
analítica”, la cual brinda las herramientas necesarias para poder determinar
quiénes son las sustancias que están presentes en los alimentos y en qué
cantidades ellas se encuentran. Así, la química analítica puede definirse como la
rama de la química que se ocupa de la identificación y cuantificación de un
componente químico en una sustancia dada.
De esta definición se deriva que la química analítica se divide en dos grandes
campos de actuación: el análisis cualitativo, cuyo objeto es identificar cuáles son
los componentes que están presentes en una muestra, y el análisis cuantitativo,
a través del cual se determina cuánto hay de cada componente en la muestra
evaluada.
Para cumplimentar cualquiera de estos objetivos (cualitativos o cuantitativos), el
procedimiento del cual se vale la química analítica se denomina método analítico.
El método analítico puede definirse como el conjunto de operaciones físicas y
químicas que permite identificar y/o cuantificar un componente químico, al cual
se denomina “analito” en el sistema material que lo contiene, al cual se le
denomina “matriz”. Así por ejemplo, en la determinación de vitamina C en
muestras de naranjas de diferentes variedades, las naranjas constituyen la
“matriz” en la cual se desea determinar el “analito” (vitamina C).
Atendiendo a las características del procedimiento analítico y del principio
general en el cual se fundamenta la determinación, los métodos de análisis
químico pueden clasificarse en dos grandes grupos: métodos clásicos y métodos
instrumentales
Métodos químicos clásicos: Son los métodos más antiguos e involucran
generalmente la aplicación de una reacción química en la que interviene el
constituyente que se desea determinar.
Métodos instrumentales: Constituyen un conjunto de procedimientos basados
en la medición instrumental de alguna propiedad físico-química del sistema
estudiado.
Ambos grupos de métodos pueden emplearse con fines cualitativos y

cuantitativos. Sin embargo, el contenido de este texto estará centrado en el
estudio de los métodos instrumentales de análisis 1.
1.3. METODOLOGÍA ANALÍTICA

La Química Analítica ha experimentado en los últimos 20 años un desarrollo
espectacular. Este desarrollo no es más que una consecuencia de la realidad
impuesta por el desarrollo de la sociedad. Actualmente los laboratorios analíticos
independientemente de que se dediquen a la investigación o estén vinculados a
la industria se enfrentan diariamente a problemáticas mucho más complejas que
hace varias décadas.
El surgimiento de nuevos materiales implica la consideración de nuevas matrices
y nuevos analitos. Si se enfoca esta realidad desde el punto de vista químico,
encontramos una gran cantidad de materiales de diversa naturaleza y estado
físico, que pueden estar compuestos por un número elevado de sustancias
químicas, dentro de las cuales nos puede interesar uno, varios o todos los
componentes, los cuales pueden estar presentes a su vez en diferentes
concentraciones.
Lo ideal sería contar con un método analítico que requiera del mínimo número de
operaciones, con el mínimo de muestra, en el cual el resultado pueda ser
obtenido de forma rápida y a bajo costo y que cuente con adecuados criterios de
calidad.
Ante esta realidad que hemos expuesto, contar con un método que reúna todas
estas características es prácticamente imposible, pero lo que sí debe quedar
claro es que cuando se concibe una metodología para enfrentar un determinado
problema analítico, debe estar dirigida a garantizar al menos algunos de estos
requerimientos.
En la práctica nos enfrentamos a múltiples dificultades entre las que podemos
citar la complejidad de la matriz, aspecto que desde el comienzo de la
investigación debe ser cuidadosamente valorado. Otra dificultad muy común es
no contar con una metodología apropiada que se ajuste perfectamente a nuestra
situación, que en muchos casos nos obliga a adoptar procedimientos ya
reportados en la literatura científica, o a cambiar algunos de los pasos
fundamentales.
Es necesario señalar que elaborar procedimientos analíticos no es fácil incluso
para analistas experimentados. Por otra parte, cada vez aumentan más las
exigencias de calidad para la aceptación de un método analítico, lo que exige
esfuerzo y un riguroso tratamiento estadístico que permita considerar el
resultado como confiable.
1
Para obtener información sobre los métodos químicos clásicos véase: Zumbado, H. Análisis Químico de los
Alimentos. Métodos clásicos. Ed. Felix Varela. La Habana, Cuba, 2006.
40d78409-8f5a-44ad-af96-811f110af4ad
Por último, no podemos dejar pasar por alto factores tan importantes como son
el tiempo y el costo del análisis. En ocasiones se nos exigen resultados rápidos,
por lo que al diseñar la metodología del análisis debe contemplarse este aspecto.
El costo es también esencialmente importante, sobre todo en nuestras
condiciones.
En algunos casos pretendemos emplear métodos más caros pero más novedosos
cuando quizás el problema pueda resolverse empleando métodos más sencillos y
baratos.
El camino que conduce al conocimiento de la composición total o parcial de una
matriz requiere indiscutiblemente de esfuerzo intelectual, aptitud, experiencia,
intuición y sobre todo de un adecuado criterio químico analítico. Este criterio
tiene muchas veces más peso que la disponibilidad de grandes y costosos
instrumentos.
La solución es llegar a una metodología analítica que permita transformar el
material (matrices alimentarias, en nuestro caso) en una muestra medible y que
a su vez obtengamos resultados que puedan considerarse confiables. Para
conseguir estos objetivos debe centrarse la atención tanto en las especies a
analizar como en la matriz, lo cual es la base del denominado “Enfoque
Analítico”.
El Enfoque analítico es básicamente una cadena de operaciones que se construye
a partir del cuestionamiento de aspectos esenciales para la realización del
análisis. Veamos a continuación algunas de las interrogantes que surgen a la
hora de acometer un problema analítico:
• ¿Qué especie (o especies) quiero medir y en que matriz se encuentran?
• ¿En qué rango de concentraciones están presentes?
• ¿Qué operaciones o procesos químicos, físicos o biológicos pueden afectar la
concentración o la estabilidad de las especies objeto de estudio?
• ¿Qué técnica analítica es la adecuada para el estudio de dichas especies?
• ¿Qué componentes propios de la matriz pueden constituir interferencias en el
análisis?
• ¿Qué nivel de precisión y exactitud requiere el método analítico para
cumplimentar el objetivo propuesto?
• ¿Qué materiales y equipos se necesitan para ejecutar el proyecto?
Las respuestas a estas interrogantes permiten conformar una metodología
analítica que permitirá abordar de forma integral el análisis. Esta metodología
pudiera definirse como una serie de etapas y operaciones comunes a cualquier
método analítico, que es necesario considerar a la hora de realizar el análisis.
Este esquema está conformado básicamente por las siguientes etapas:
• Determinación de los objetivos analíticos

• Selección del método analítico

• Muestreo
• Preparación de la muestra
• Determinación
• Cálculos, reporte e interpretación de los resultados.
Estas etapas no pueden ser consideradas de forma independiente. Entre ellas
existe una relación de interdependencia que permite que la metodología se
conforme como una unidad integral. Analicemos ahora con detalle cada una de
estas etapas.
1.3.1. Determinación de los objetivos analíticos.
La definición de los objetivos es la etapa que permite trazar la estrategia de
análisis sobre la base de las respuestas a las primeras interrogantes que
habíamos planteado:
• ¿Qué especies se van a determinar, o lo qué es lo mismo, quién o quiénes
son los analitos?
• ¿En qué matriz se encuentran?
• ¿Qué tipo de análisis necesito realizar? En este caso nos estamos
refiriendo a definir si es necesario realizar una cuantificación o si la simple
detección cualitativa es suficiente.
Para analistas experimentados esta etapa pudiera parecer trivial, sin embargo en
el caso de los estudiantes, o de analistas de poca experiencia es necesario dejar
clara la diferencia entre objetivo analítico y el problema a resolver.
Por ejemplo, se detecta una intoxicación alimentaria en un grupo poblacional que
ingirió croquetas de jamonada en un local gastronómico de trabajadores por
cuenta propia.
El problema a resolver será identificar la sustancia tóxica responsable de la
intoxicación, sin embargo para resolver esta problemática es necesario definir
más de un objetivo analítico, que a su vez generan varias tareas analíticas. Por
ejemplo:
• ¿En qué matriz biológica se va a realizar la determinación?: la jamonada
del relleno, la harina, el aceite empleado para la fritura, la sal, etc.
• ¿Cuáles son los posibles analitos que pudieran estar contaminando la
materia prima?: NaNO2 como aditivo en la jamonada, naturaleza de la
harina ¿es en realidad harina de trigo u otro producto de características
físicas parecidas como por ejemplo un plaguicida?, calidad del aceite
empleado, etc.
Indiscutiblemente de la correcta definición de los objetivos depende en gran
medida el éxito de la determinación.
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1.3.2. Selección del método analítico.

La selección del método analítico ha sido considerada siempre como una de las
etapas de mayor importancia en el esquema de un análisis completo. Para la
correcta selección del método adecuado para la realización de un análisis es
necesario considerar diferentes aspectos tales como:
1. Características del analito: En este sentido se debe considerar la
naturaleza química y las propiedades físico-químicas del componente que se
desea cuantificar. No existe ningún método analítico universal, es decir que
sea aplicable a la determinación de toda clase de analitos. De hecho no se
utilizan los mismos métodos para la determinación de sustancias orgánicas
que para sustancias inorgánicas o para la determinación de sustancias de
bajo y alto peso molecular. Sin embargo no basta con tener en cuenta las
características del analito, sino que es también importante tener en cuenta las
características de la matriz.
2. Características de la matriz: Obviamente dentro de las características
importantes a considerar está el estado de agregación y la complejidad de la
matriz. No es lo mismo realizar un análisis sobre un producto líquido que
sobre uno sólido, puesto que la matriz ha de sufrir diferentes tratamientos en
función de su estado de agregación. Así mismo, estos tratamientos serán más
engorrosos en la medida que la matriz sea más compleja, es decir, posea un
mayor número de componentes, puesto que entonces el método seleccionado
ha de ser más específico a fin de determinar solo aquella sustancia que
interesa (analito) en presencia de un gran número de otras sustancias que
coexisten en la matriz. Si por el contrario, se trata de una matriz con un
reducido número de sustancias, resulta más fácil muchas veces la selección
del método.
3. Validación del método analítico: La validación del método analítico es el
proceso que permite establecer qué características del funcionamiento del
método analítico son adecuadas para la aplicación que se pretende.
En este sentido es importante señalar que para obtener los mejores resultados
deben considerarse todas las variables del método, que incluyen la etapa de
muestreo, la preparación de la muestra, la detección y evaluación de los datos,
es decir se deben considerar todas las etapas del esquema.
El objetivo principal de la validación analítica es el de asegurar que un
procedimiento analítico dará resultados reproducibles y confiables que sean
adecuados para el propósito previsto.
Hay importantes razones para validar los métodos de análisis. En primer lugar la
validación es una parte integral del desarrollo de un método analítico, en
segundo lugar, las Buenas Prácticas de Elaboración así lo exigen. Por otra parte y
desde el punto de vista comercial los métodos validados permiten obtener datos
fiables por lo que se facilitan las transacciones comerciales basadas en la
aceptación mutua de los resultados.
Los estudios de validación constituyen una parte esencial en el desarrollo de

técnicas analíticas encaminadas tanto al control de calidad, en la industria de los
alimentos, como a estudios de conservación, almacenamiento y evaluación
nutricional y toxicológica de productos destinados al consumo humano.
Los requisitos o criterios de validación que debe cumplir un método analítico y
que deben ser determinados en el procedimiento de validación, según lo
estipulado por diferentes organizaciones internacionales tales como: NMKL,
(1996); AOAC, (2000); Codex Alimentarius, (2001) y IUPAC (2002) son:
precisión, veracidad o justeza, linealidad, sensibilidad, límite de detección, límite
de cuantificación, intervalo de concentración y selectividad, entre otros2. El en
epígrafe 1.4.3 de este capítulo se abordan con profundidad algunos de estos
parámetros de calidad.
1.3.3. Muestreo y toma de la muestra
En términos generales, los químicos analíticos no siempre le han dado la
importancia y prioridad que en los resultados analíticos puede tener, y de hecho
tiene, la etapa de selección de la muestra o muestreo. Con frecuencia, aún un
analítico entrenado puede olvidar algunas de las reglas básicas del muestreo o
puede aplicar estas de forma incorrecta. Tales errores pueden negar la validez de
los resultados obtenidos.
En realidad, el analista no ha sido entrenado en el muestreo. En la mayoría de
los casos, el analista no tiene responsabilidad en las fases de diseño y realización
del muestreo, sino que el primer contacto que él tiene con esas operaciones es la
de recepcionar la muestra de laboratorio.
Sin embargo, es importante que un químico analítico tenga un verdadero sentido
de la incertidumbre involucrada en un muestreo, debido a que esta
incertidumbre determina, en gran medida, la variabilidad que puede ser
permitida en el análisis. Conociendo el error potencial de un muestreo, se conoce
ya más de las dos terceras partes del error total del análisis.
El muestreo se define como un proceso de selección de una muestra para ser
analizada, de forma tal que sea representativa del conjunto del material del cual
se ha tomado y sea además congruente con la definición del problema analítico;
dicho de otro modo, la concentración del analito en la porción de la muestra que
se analiza, debe ser igual a la concentración del analito en la población (lote,
partida, etc.) de la cual se ha tomado la muestra. De nada serviría realizar un
análisis perfecto cuando la muestra no es representativa, ya que estos resultados
no representarían la composición de todo el material de donde fue tomada la
muestra y por lo tanto se obtendrían resultados no confiables.
2
Para mayor información sobre los procedimientos de validación véase: AOAC. Official Methods Validation
Program“ AOAC International Official Methods of Analysis.” 17th Edition. Page XXIII. 2000; Codex Alimentarius.
CXMAS – 09 – 1. “Directrices armonizadas para la validación interna de métodos de análisis de la IUPAC” 2001;
IUPAC. “Harmonized Guidelines for the in-house validation of methods of analysis (Technical report)”.
Budapest. 2002; NMKL. Comité Nórdico de Análisis de Alimentos. “Validation of Chemical Analytical Methods”.
Procedimiento #4. Versión 1. 1996. Finlandia.
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Los procedimientos de muestreo, en casos particulares, pueden ser totalmente

diferentes para cada tipo de producto, pues dependen del estado de agregación
de la sustancia y de sus características particulares. Para cada tipo de material
analizado existen instrucciones especiales concernientes a cómo realizar el
muestreo y que cantidad de muestra debe tomarse de acuerdo con las
particularidades específicas del material dado. Estas instrucciones aparecen en
manuales de análisis técnicos conocidos como Normas de Muestreo.
El principio general de cualquier procedimiento de muestreo consiste en que la
muestra representativa debe estar compuesta del mayor número posible de
porciones de sustancia tomadas de manera absolutamente arbitraria (al azar) de
diversos lugares de la población que se estudia (partida, lote, etc.).
Para comprender la necesidad del muestreo se debe tener presente que la
mayoría de los alimentos son matrices complejas y heterogéneas. Un lote de un
mismo producto en sus diferentes partes, trozos, granos, etc., puede tener una
composición muy distinta. Cuanto mayor número de porciones de la sustancia se
escojan al azar de sus diferentes partes, tanto mayor será la probabilidad de que
todas las desviaciones eventuales del promedio se compensen y la composición
de la muestra se acerque a la composición media de la sustancia que se analiza.
Por ejemplo, si se desea determinar el contenido de proteínas en un lote de arroz
almacenado en sacos de 50 Kg y el lote está compuesto por 200 sacos colocados
en varias estibas, no basta con tomar la muestra de un solo saco, sino que se
hace necesario tomar al azar muestras de diferentes sacos y de diferentes
lugares de los sacos seleccionados al azar, con vistas a que la muestra sea
verdaderamente representativa de la población.
Usualmente la muestra representativa primaria no se emplea directamente en el
análisis debido a que aún es muy grande (varios Kg) y heterogénea. Por eso se
tritura (como resultado aumenta la homogeneidad de la sustancia) y debe
disminuirse su tamaño. Uno de los procedimientos más empleados para reducir
el tamaño de las muestras sólidas es el cuarteo. Este procedimiento consiste en
lo siguiente: la muestra primaria triturada se extiende uniformemente sobre una
superficie lisa de modo que resulte un cuadrado. Este se divide diagonalmente en
cuatro triángulos, de los cuales se eliminan dos opuestos y los dos restantes se
mezclan nuevamente entre sí. El material mucho más homogéneo obtenido de
este modo se vuelve a cuartear tantas veces como sea necesario hasta reducir el
tamaño de la muestra hasta un valor conveniente (50 g – 1 Kg o más) para
finalmente almacenar cuidadosamente esta muestra y enviarla al laboratorio.
En este sentido, deben diferenciarse los términos muestra bruta y poción de
ensayo. La muestra bruta es la porción del material tomado de la población
inicial (lote de un proceso de producción de alimentos, almacén de sacos de
arroz, etc.) que llega al laboratorio analítico y debe ser de un tamaño adecuado
(entre 50 g y 1 Kg o más). La porción de ensayo es la cantidad de muestra
tomada en el laboratorio por el analista para realizar el análisis, y su tamaño

depende de las características del método y de los objetivos del análisis.

Usualmente estos términos no se distinguen y se habla de forma general de
muestra, pero debe quedar claro a que muestra nos estamos refiriendo.
El caso considerado constituye solo un ejemplo ilustrativo de muestreo y toma de
muestra para el caso de materiales sólidos envasados a granel. Obviamente para
otros productos (conservas de frutas enlatadas, compotas, caramelos, bebidas
envasadas, etc.) el procedimiento puede ser muy diferente.
El muestreo consta de dos fases: fase de diseño y fase de implementación. En la
fase de diseño el analista aplica los principios estadísticos para generar un plan
de muestreo. Dicho plan intenta minimizar las diferencias entre las propiedades
estimadas para una muestra y las propiedades del lote en su totalidad. La fase
de implementación involucra la realización física de la toma de las porciones
estadísticamente diseñadas. En esta etapa hay que considerar la instrumentación
del muestreo, los recipientes para las muestras así como el almacenamiento y la
conservación.
1.3.4. Preparación de la muestra.
La etapa de preparación de muestra es una de las etapas que puede
considerarse crítica en una metodología analítica. De forma general en la
literatura científica suele dársele mayor importancia a la etapa de selección del
método analítico que a la etapa de preparación de la muestra. Sin embargo, en
los últimos años diversos autores han llamado la atención con respecto a la
importancia de esta última etapa (tabla 1.2).
Tabla 1.2
Tiempo utilizado en diferentes etapas del proceso analítico
Porcentaje en base
Etapa
al tiempo total de análisis
Gestión de datos 27%
Preparación de la muestra 61%
Muestreo 6%
Determinación 6%
Nótese que el mayor tiempo es consumido justamente en la etapa de

preparación de muestra.
La mayoría de las determinaciones analíticas requieren de una preparación
previa de la muestra. Esto obedece a diferentes razones entre las cuales se
pudieran mencionar las siguientes:
1. Alta complejidad de la matriz, lo que aumenta la posibilidad de la
presencia de interferencias. En este sentido se debe recordar que la
complejidad de una matriz está relacionada con diferentes criterios y no
solamente con el alto número de componentes.
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2. Muestras muy diluidas, es decir, el o los analitos se encuentran en bajas

concentraciones en la muestra original pudiendo encontrarse por debajo
del límite de detección del método analítico.
3. Muestras muy concentradas, lo que pudiera ocasionar que el analito pueda
dar una señal fuera de escala. En el caso más simple bastaría realizar un
proceso de dilución para resolver este problema.
4. Las características físico químicas de la muestra (matriz) no son
compatibles con el método analítico. Así por ejemplo el método puede
exigir un análisis del analito en disolución a partir de una muestra sólida.
En el caso más sencillo bastaría un proceso de disolución.
Así, el objetivo central del proceso de preparación de la muestra es el de poner al
analito en condiciones óptimas para ser analizado; dicho de otro modo, obtener
muestras enriquecidas en las sustancias de interés analítico y asegurar la
detección y/o cuantificación eficiente del o los analitos, así como la
compatibilidad con el sistema analítico, lo cual está obviamente relacionado con
el éxito del análisis.
Por lo tanto, la etapa de preparación de la muestra requiere de un diseño y
planificación rigurosos el cual debe realizarse atendiendo a los siguientes
criterios:
1. Naturaleza química del analito.
2. Concentración del analito en la matriz.
3. Característica de la matriz (homogeneidad o heterogeneidad, estabilidad,
volatilidad, solubilidad)
4. Naturaleza química de las sustancias interferentes
5. Características del método analítico seleccionado.
En el análisis de los alimentos, la preparación de la muestra incluye un número
de etapas más o menos numerosas que dependen del tipo de producto (matriz) y
del componente que se desea cuantificar (analito). Ahora bien, existen dos
momentos perfectamente delimitados que pueden clasificarse como sub etapas y
forman parte de la etapa de preparación de la muestra; estos momentos son:
preparación de la muestra bruta y preparación de la porción de ensayo.
A. Preparación de la muestra bruta
Constituye un proceso de tratamiento de la matriz, dirigido a garantizar la
representatividad de los resultados y a facilitar la posterior extracción del analito.
Se realiza, como su nombre lo indica a la muestra que llega al laboratorio
(muestra bruta) antes de proceder a la pesada o medida del volumen de la
misma.
Usualmente, el procedimiento de preparación de la muestra bruta aparece
descrito en normas que regulan e indican cómo debe realizarse esta etapa en

función de las características de la matriz. Así por ejemplo, en el análisis de

conservas cárnicas en salmuera, la norma cubana exige que la muestra sea
preparada de la siguiente forma:
“Se drena el contenido del envase y se toman varias porciones de diferentes
zonas del producto en cantidades adecuadas. Las porciones tomadas se hacen
pasar por una máquina moledora o batidora eléctrica si es necesario, mezclando
después de cada operación para lograr una buena homogenización.
Posteriormente se pasa a un recipiente cerrado herméticamente y se almacena
bajo condiciones en que se preserve de cualquier deterioro o cambio en su
composición. La muestra debe analizarse antes de las 24 horas posteriores a su
preparación”.
Nótese que este procedimiento es general y se realiza a los productos cárnicos
en conserva, con independencia del analito que se desee cuantificar. En otras
ocasiones, sin embargo, es necesario realizar procedimientos adicionales en
función del método de cuantificación que será empleado posteriormente. Por
ejemplo, si en esta misma muestra de carne en conserva se quiere acometer la
determinación de grasa por un método de extracción con solventes orgánicos, se
hace necesario, además de las operaciones indicadas, realizar un previo secado
de la muestra puesto que elevados contenidos de humedad en el producto
interfieren en la determinación.
B. Preparación de la porción de ensayo.
Esta etapa se inicia invariablemente con la medición exacta de la porción de la
muestra homogenizada, puesto que los resultados finales del análisis se reportan
en forma de concentraciones, es decir, se refiere la cantidad de analito
cuantificado en función de la cantidad de muestra tomada para el análisis
(porcientos, mg/g, mg/L, mg/100 g, etc.).
Una vez medida exactamente la porción de ensayo, se realizan diferentes
tratamientos de mayor o menor complejidad, cuyo objetivo es el de separar el
analito del resto de los componentes que pudieran constituir interferencias y
facilitar la cuantificación.
A partir del análisis de estos aspectos se diseña una estrategia analítica la cual
puede enfocarse desde dos puntos de vista:
1. A partir de la matriz original se realizan las operaciones químicas
necesarias que permiten eliminar las interferencias. (Proceso de limpieza o
“clean up”)
2. A partir de la matriz original se extraen selectivamente los compuestos de
interés (analitos). (Proceso de extracción)
Estas etapas se pueden acometer empleando métodos clásicos de mayor o
menor complejidad, cuya descripción sería imposible de abordar totalmente en
este texto dado el enorme número de posibilidades que existen. De cualquier
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manera, relacionamos a continuación algunos de los procedimientos más

comunes.
Dilución: Se emplea para muestras líquidas en las cuales el analito se encuentra
en altas concentraciones o en productos fuertemente coloreados cuya coloración
interfiere en el análisis. Es uno de los procedimientos más simples de
preparación. Un típico ejemplo es la determinación de acidez total en vinagre
comercial, el cual posee una elevada concentración de ácido acético que es
necesario disminuir a través de una dilución.
Extracción sólido-líquido: Consiste en la extracción del analito a partir de una
matriz sólida empleando un disolvente adecuado capaz de solubilizar el
componente en estudio. En la determinación del contenido de cloruro de sodio
por el método de Mohr en productos cárnicos, la porción pesada y homogenizada
se suspende en agua destilada y se mantiene en reposo durante una hora para
garantizar que el cloruro de sodio sea extraído y pase a la solución. Luego se
filtra y se determina el contenido de cloruro de sodio en la solución salina.
El procedimiento de extracción sólido-líquido arriba descrito, es relativamente
sencillo pero existen otros más complejos que pueden involucrar el empleo de
varias etapas con diferentes solventes y operaciones más engorrosas.
Clarificación: Consiste en eliminar las interferencias por precipitación o
floculación empleando un agente precipitante adecuado. Así por ejemplo, en la
determinación de azúcares reductores en compotas, los pigmentos y otras
macromoléculas que constituyen interferencias, se precipitan por adición de una
solución saturada de acetato de plomo. El precipitado se separa por filtración y
se obtiene una solución transparente que contiene los azúcares objeto de
cuantificación. Este procedimiento se conoce también con el nombre de
defecación plúmbica.
Destilación: El analito se separa del resto de los componentes que pueden
interferir en el análisis aplicando un procedimiento de destilación con vapor de
agua. La determinación de ésteres totales en rones es un típico ejemplo que
requiere de un proceso de destilación a través del cual se obtienen los ésteres en
el destilado que posteriormente se analiza.
Incineración: La incineración es el proceso de combustión de la materia
orgánica que deja un residuo de material inorgánico conocido como cenizas. En
algunas determinaciones de compuestos de naturaleza inorgánica se requiere
eliminar primeramente el material orgánico para facilitar el análisis. Así por
ejemplo, en la determinación de calcio en vinos por un método complejométrico,
o en la determinación de metales por espectrometría de absorción atómica, la
cuantificación se realiza sobre las cenizas del producto, obtenidas por
incineración a altas temperaturas.
Digestión: Es un proceso de hidrólisis (ácida fundamentalmente) de la materia
orgánica, que puede incluso, en función de las condiciones de tratamiento,
producir agentes oxidantes que transforman la materia orgánica a dióxido de
carbono, vapor de agua y otros compuestos volátiles. La determinación de

nitrógeno total por el método Kjeldahl incluye una etapa de digestión que
transforma el nitrógeno orgánico en sulfato de amonio con el empleo de ácido
sulfúrico concentrado y calor en presencia de un catalizador de sulfato de
cobre. En esta determinación se realiza además una posterior destilación, por lo
que constituye un ejemplo en que se combinan varios procedimientos con vistas
a transformar el analito en una sustancia fácilmente cuantificable.
Reflujo: Es una operación que se realiza con el fin de propiciar o acelerar una
reacción química entre dos sustancias mediante la aplicación de calor. Consiste
en colocar las sustancias reaccionantes (en disolución), en un frasco erlenmeyer
de tapa esmerilada conectado a un condensador de reflujo o tubo refrigerante, a
través del cual circula agua. Se aplica calor al frasco erlenmeyer, mediante
mechero, plancha de calefacción o baño termostatado, y la reacción ocurre a
altas temperaturas sin pérdida de los reaccionantes, por cuanto los vapores
desprendidos se condensan al chocar con el tubo refrigerante y caen nuevamente
en el seno de la solución. Así por ejemplo, la determinación del índice de
saponificación en aceites y grasas comestibles requiere obligatoriamente de una
etapa de reflujo para que tenga lugar la reacción de neutralización entre los
ácidos grasos y el hidróxido de potasio, ya que esta reacción no tiene lugar a
temperatura ambiente.
Los procedimientos arriba explicados constituyen tan solo unos pocos ejemplos
de las numerosas operaciones que pueden emplearse como parte de la
preparación de la muestra.
La etapa de preparación de muestras no ha avanzado a la par del desarrollo de
los métodos analíticos. Muchos de los métodos empleados son considerados
clásicos y se utilizan desde hace muchos años. Sin embargo, en los últimos años,
con la introducción de la extracción en fase sólida comenzó un proceso de
desarrollo de los métodos de preparación de muestra que se ha visto
incrementado con el empleo de los fluidos supercríticos y las microondas.
1.3.5. Procedimiento de determinación
La etapa de determinación consiste en acometer el método de cuantificación
propiamente dicho, el cual presentará características particulares en función del
analito que se cuantifique y del principio en que se fundamente la cuantificación
(volumetría, gravimetría, espectrofotometría, cromatografía, etc.).
Al efectuar una determinación analítica cuantitativa, se debe seguir
minuciosamente la metodología de trabajo establecida en la técnica analítica. Es
necesario tener presente que los resultados del análisis son válidos solo en el
caso de que se cumplan rigurosamente todas las condiciones planteadas en la
metodología descrita, pues esta ha sido comprobada y validada en función de
estas indicaciones. Cualquier desviación de las condiciones establecidas en la
metodología original (cambio de algún reactivo por otro, modificación en los
volúmenes adicionados o en la concentración de alguna de las soluciones
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empleadas, etc.) conduce siempre a errores y disminuye apreciablemente la

precisión y exactitud del método.
Con el mismo esmero se deben observar las reglas concernientes a la técnica de
diversas operaciones (filtración, lavado y secado de los precipitados, valoración,
incineración, destilación, etc.). Por más insignificantes que parezcan algunas de
estas reglas, se debe tener presente que todas ellas son resultado de la
experiencia acumulada por generaciones de químicos, y que solamente
siguiéndolas del modo más riguroso, se puede obtener la precisión y exactitud
deseada en los resultados del análisis.
1.3.6. Cálculos, reporte e interpretación de los resultados
El resultado final del análisis cuantitativo se calcula a partir de los resultados
obtenidos experimentalmente (datos de las pesadas realizadas, mediciones de
volúmenes obtenidos al efectuar el análisis, señal que se obtiene de un equipo
instrumental, etc.).
Los cálculos de los resultados del análisis son una parte integrante del
procedimiento analítico al igual que cualquier otra operación del mismo; de ahí
que un error de cálculo entraña las mismas consecuencias que un error
cometido en cualquier otra operación del análisis.
En un proceso de producción de alimentos, el resultado del análisis
frecuentemente se utiliza para orientar y corregir el proceso tecnológico,
inmediatamente después de recibir los resultados del laboratorio de control de
calidad. Es evidente que, en este caso, un error de cálculo es inadmisible.
Así mismo, de nada valdría realizar correctamente los cálculos si no se sabe
interpretar el resultado y tomar decisiones sobre las acciones que deben
acometerse en función del resultado obtenido.
¿La magnitud cuantificada del analito indica un deterioro del producto que puede
resultar dañino a la salud? ¿Se rechaza el producto y se retira del mercado? ¿Se
mantiene el producto en el mercado por un corto período de tiempo? .Estas y
otras muchas, son las interrogantes que pueden aflorar de un resultado analítico.
El profesional de la rama de alimentos debe saber dar respuestas acertadas
sobre la base de una rigurosa interpretación de los resultados.
1.4. LOS MÉTODOS INSTRUMENTALES DE ANÁLISIS DE LOS ALIMENTOS

A principios del siglo XX lo químicos comenzaron a hacer uso de fenómenos
diferentes a los utilizados en los métodos clásicos (volumétricos y gravimétricos)
para resolver los problemas analíticos. Así, para el análisis cuantitativo de una
gran variedad de analitos inorgánicos, orgánicos y bioquímicos se empezaron a
utilizar las medidas de sus propiedades físicas tales como la conductividad, el
potencial de electrodo, la absorción o emisión de la luz, la relación masa/carga y
la fluorescencia. Además, en la separación de mezclas complejas, las técnicas
cromatográficas y electroforéticas altamente eficaces empezaron a reemplazar a
la destilación, extracción y precipitación como etapa previa a su determinación
cualitativa o cuantitativa. A estos métodos más modernos para la separación y

determinación de especies químicas se les conoce, en conjunto, como métodos
instrumentales de análisis.
Muchos de los fenómenos en los que se fundamentan los métodos instrumentales
se conocen desde hace más de un siglo. Sin embargo, su aplicación por la mayor
parte de los químicos se retrasó por falta de una instrumentación sencilla y
fiable. De hecho, el crecimiento de los métodos instrumentales de análisis
modernos ha ido paralelo al desarrollo de la industria electrónica e informática.
1.4.1. Tipos de métodos instrumentales
Al abordar los diferentes tipos de métodos instrumentales es conveniente
considerar las propiedades químicas y físicas que se puedan utilizar en el análisis
cualitativo o cuantitativo. La tabla 1.3 enumera la mayoría de las propiedades
características que se utilizan actualmente en análisis instrumental. La mayor
parte de ellas requieren una fuente de energía para estimular una respuesta
medible que procede dcl analito. Por ejemplo, en emisión atómica se requiere un
aumento de temperatura del analito para que, en primer lugar se produzcan
átomos en estado gaseoso y después para excitar dichos átomos a niveles de
mayor energía. Posteriormente emiten una radiación electromagnética
característica que es la cantidad medida por el instrumento. La energía de
excitación puede darse como un cambio térmico rápido, tal como sucede en el
ejemplo anterior, donde la radiación electromagnética de la región del espectro
seleccionada se transforma en un parámetro eléctrico tal como potencial,
corriente o carga o bien, tener formas más sutiles, intrínsecas al propio analito.
Tabla 1.3.
Propiedades químicas y físicas que se emplean en los métodos instrumentales.
Propiedades Métodos instrumentales

Emisión de la radiación Espectroscopia de emisión* (rayos X, UV*, visible* y
electrones), fluorescencia*, fosforescencia y luminiscencia
(rayos X, UV, visible).
Absorción de la radiación Espectrofotometría y fotometría* (rayos X, UV*, visible*,
IR), resonancia magnética nuclear y espectroscopia de
resonancia de espín electrónico.
Dispersión de la radiación Turbidimetría, nefelometría y espectroscopia Raman.
Refracción de la radiación Refractometría*, interferometría.
Difracción de la radiación Métodos de difracción de rayos X u electrones.
Rotación de la radiación Polarimetría*, dispersión rotatoria óptica.
Potencial eléctrico (*) Potenciometría*.
Carga eléctrica Culombimetría.
Corriente eléctrica Polarografía, amperometría, electroforesis.
Resistencia eléctrica Conductimetría.
Razón masa / carga Espectrometría de masas.
Velocidad de reacción Métodos cinéticos.
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Propiedades Métodos instrumentales

Propiedades térmicas Calorimetría de barrido diferencial, análisis térmico
diferencial, métodos de conductividad térmica.
Radiactividad Métodos de activación y de dilución isotópica.
Solubilidad Cromatografía de reparto o partición*.
Adsorción Cromatografía de adsorción*.
Masa molar Cromatografía de filtración sobre gel*.
Acido base Cromatografía de intercambio iónico*.
Obsérvese que las seis primeras entradas de la tabla 1.3 están relacionadas con
las interacciones del analito y la radiación electromagnética. En la primera, el
analito origina la señal radiante: las cinco siguientes implican cambios en el haz
de radiación producidos por su interacción con la muestra. Las cuatro que siguen
son eléctricas y luego, cuatro propiedades diversas se agrupan conjuntamente:
la relación masa/carga, la velocidad de reacción, las señales térmicas y la
radiactividad. Finalmente se agrupan cuatro propiedades que se explotan en los
métodos cromatográficos.
La segunda columna de la tabla 1.3 indica los nombres de los métodos
instrumentales relacionados con las distintas propiedades físicas y químicas. Hay
que tener en cuenta que no siempre es fácil elegir el método óptimo de entre la
cantidad de técnicas instrumentales disponibles, así como de sus homólogos
clásicos. Algunas de ellas son más sensibles que las técnicas clásicas, pero otras
no. Un método instrumental puede ser más selectivo para ciertos compuestos o
combinaciones de elementos, pero para otros, un análisis volumétrico o
gravimétrico puede tener menores interferencias.
Son igualmente difíciles de establecer las generalizaciones sobre la exactitud, la
idoneidad o el tiempo empleado. Tampoco es necesariamente cierto que los
procedimientos instrumentales utilicen aparatos más sofisticados y más
costosos; en realidad, la balanza analítica electrónica moderna que se emplea en
las determinaciones gravimétricas es un instrumento más complejo y refinado
que muchos de los usados en algunos de los métodos mencionados en la tabla
1.3.
Como se ha indicado, existe un grupo de procedimientos instrumentales que se
utilizan para separar y resolver compuestos afines. La mayoría de ellos están
relacionados con la cromatografía y la electroforesis. Para completar el análisis,
tras las separaciones cromatográficas, se suele usar alguna de las propiedades
de la tabla 1.3. Con esta finalidad se han utilizado, por ejemplo, la conductividad
térmica, la absorción en el infrarrojo y el ultravioleta, el índice de refracción y la
conductancia eléctrica.
En el presente texto se abordarán los principios, las aplicaciones y las
características de funcionamiento de los métodos instrumentales señalizados con
un asterisco (*) en la tabla 1.3, por cuanto éstos son los de mayor aplicación en

el análisis de los alimentos. Los métodos clásicos no se tratarán dado que se

supone que el lector habrá aprendido estas técnicas en estudios anteriores.
1.4.2. Instrumentos para el análisis
Un instrumento para el análisis químico transforma la información relacionada
con las propiedades físicas o químicas del analito en información que pueda ser
manipulada e interpretada por un ser humano. Por tanto, un instrumento
analítico puede considerarse como un dispositivo de comunicación entre el
sistema objeto de estudio y el científico.
Para conseguir la información del analito deseada es necesario proporcionar un
estímulo, generalmente en forma de energía electromagnética, eléctrica,
mecánica o nuclear, como se muestra en la figura 1.1. El estímulo provoca una
respuesta del sistema objeto de estudio, en la cual la naturaleza y magnitud de
la misma se rigen por las leyes fundamentales de la Química y de la Física. La
información resultante radica en el fenómeno que surge de la interacción del
estímulo con el analito. Un ejemplo habitual es el paso de una banda estrecha de
longitudes de onda de luz visible a través de una muestra para medir la
capacidad de absorción del analito. Se determina la intensidad de la luz antes y
después de su interacción con la muestra y la relación entre ellas proporciona la
medida de la concentración del analito.
Figura 1.1. Diagrama de bloques del proceso completo de una medida instrumental
1.4.2.1. Detectores, transductores y sensores

Los términos: detector, transductor y sensor se utilizan, con frecuencia, como
sinónimos, pero tienen un significado con matices diferentes. El término más
general de los tres, detector, se refiere a un dispositivo mecánico, eléctrico o
químico que identifica, registra o indica un cambio en alguna de las variables de
su entorno, tal como la presión, La temperatura, La carga eléctrica, la radiación
electromagnética, la radiación nuclear, las partículas o las moléculas. Este
término se ha convertido en un comodín, hasta el punto de que, a menudo, se
denominan detectores a instrumentos enteros. En el contexto del análisis
instrumental, se debería utilizar el término detector con el sentido general con el
que lo acabamos de definir, y se debería utilizar sistemas de detección para
referirse al conjunto completo de dispositivos que indican o registran cantidades
40d78409-8f5a-44ad-af96-811f110af4ad
físicas o químicas. Un ejemplo es el detector de UV (ultravioleta) utilizado, a

menudo, para indicar o registrar la presencia de los analitos eluidos en
cromatografía líquida.
El término transductor se refiere, de manera específica, a los dispositivos que
convierten la información de dominios no eléctricos en dominios eléctricos y
viceversa. Algunos ejemplos de transductores son los fotodiodos,
fotomultiplicadores y otros fotodetectores electrónicos que producen corrientes o
potenciales proporcionales a la potencia radiante de la radiación
electromagnética que incide en sus superficies.
Por otra parte, el término sensor se reserva en este texto para el tipo de
dispositivos analíticos que son capaces de controlar determinadas especies
químicas de manera continua y reversible. Ejemplos de sensores lo constituyen
el electrodo de vidrio y otros electrodos selectivos de iones utilizados en los
métodos potenciométricos.
1.4.2.2. Dispositivos de lectura
Un dispositivo de lectura es un transductor que convierte la información que
procede de un dominio eléctrico a otro que sea comprensible para el observador.
Generalmente la señal transformada tiene la forma de la señal de salida
alfanumérica o gráfica en un tubo de rayos catódicos, de una serie de números
en un visualizador digital, de la posición de una aguja en una escala métrica o,
en ocasiones, de impresiones en una placa fotográfica o de un trazo en un papel
de registro. En algunos casos, el dispositivo de lectura se puede preparar para
que proporcione directamente la concentración del analito.
1.4.2.3. Microprocesadores y ordenadores en los instrumentos
La mayoría de los instrumentos analíticos modernos disponen, o están acoplados,
a uno o más dispositivos electrónicos sofisticados y a convertidores de dominios
de los datos, como los amplificadores operacionales, los circuitos integrados, los
convertidores analógico-digitales y digital-analógicos, los contadores, los
microprocesadores y ordenadores.
Para apreciar la capacidad y las limitaciones de estos instrumentos, es necesario
que el investigador tenga, al menos, un conocimiento cualitativo del
funcionamiento y de las posibilidades de estos dispositivos.
1.4.3. Parámetros de calidad de los métodos e instrumentos
En la tabla 1.4 se enumeran los criterios cuantitativos de funcionamiento de los
instrumentos, criterios que se pueden utilizar para decidir si un determinado
método instrumental es o no adecuado para resolver un problema analítico.

Tabla 1.4.
Criterios numéricos para seleccionar métodos analíticos
Criterio Parámetros de calidad

Desviación estándar absoluta, desviación estándar
1. Precisión
relativa, coeficiente de variación, varianza
2. Veracidad Porcentaje de recuperación
3. Linealidad Regresión lineal, coeficiente de determinación
4. Sensibilidad Sensibilidad de calibración, sensibilidad analítica
Blanco más tres veces la desviación estándar del
5. Límite de detección
blanco
Blanco más diez veces la desviación estándar del
6. Límite de cuantificación
blanco
Concentración entre el límite de cuantificación (LOQ) y
7. Intervalo de concentración
el límite de linealidad (LOL)
8. Selectividad -
Estas características se expresan en términos numéricos y se denominan

parámetros de calidad. Para un problema analítico dado, los parámetros de
calidad permiten reducir la elección de los instrumentos a tan sólo unos pocos y
entonces la selección entre ellos se hace con criterios cualitativos de
funcionamiento tales como: la velocidad, la facilidad y comodidad del método, la
habilidad del operador, el costo y disponibilidad del equipo así como el costo por muestra.
A continuación, nos detendremos en la descripción y análisis de cada uno de
estos criterios de calidad:
1.4.3.1. Precisión
La precisión describe la reproducibilidad de los resultados; es decir, la
concordancia entre los valores numéricos de dos o más medidas replicadas o
medidas que se han realizado exactamente de la misma forma. En general, la
precisión de un método analítico se obtiene fácilmente mediante la simple
repetición de la medida.
La precisión indica la medida del error aleatorio, o indeterminado, de un análisis.
Los parámetros de calidad de la precisión son la desviación estándar absoluta, la
desviación estándar relativa, el coeficiente de variación y la varianza. Estos
términos se definen en la tabla 1.5.
Un método o un instrumento serán más precisos, en tanto menor coeficiente de
variación se obtenga, es decir, cuanto más se acerquen entre sí los resultados
obtenidos de varios análisis realizados a una misma muestra.
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Tabla 1.5.
Parámetros de calidad para la precisión de los métodos analíticos
Parámetro Expresión para el cálculo
( X − X
2
Desviación estándar absoluta, s i )
S=
n −1
S
Desviación estándar relativa, RSD RSD= ̅
X
S
Coeficiente de variación, CV CV= ̅ ∙ 100
X
Varianza S 2
donde
̅ es el valor promedio obtenido de las diferentes repeticiones
X
Xi es el valor individual obtenido para cada una de las diferentes determinaciones
n es el número de determinaciones (repeticiones realizadas)
Veamos un ejemplo:
En un estudio del contenido de grasa en chocolate en polvo se ensayaron 2
métodos analíticos realizando 8 repeticiones para cada técnica y se obtuvieron
los siguientes resultados.
Resultados obtenidos para las 8 repeticiones (g grasa/100g de muestra)
Método A 3,2 3,5 3,2 3,4 3,3 3,4 3,3 3,3

Método B 3,1 3,2 3,4 3,5 3,6 3,4 3,3 3,4
Si se desea calcular la precisión de ambos métodos el procedimiento a seguir

sería:
Método A
3,2 + 3,5 + 3,2 + .... + 3,3
X=
8
X = 3,32
(3,32 − 3,2 )2 + (3,32 − 3,5 )2 + .... + (3,32 − 3,3)2
S=
8 −1
S = 0,1035
0,1035
CV =  100
3,32
CV = 3,1%

Método B
X = 3,4
S = 0,2
CV = 5,9%
Obviamente el método A es más preciso que el método B, dado que posee un
menor coeficiente de variación (3,1 %  5,9 %).
Los valores de coeficiente de variación reportados para que un método analítico
sea considerado preciso, se mueven en rangos más o menos amplios en la
literatura científica que aborda esta temática, pero con independencia de los
valores reportados como aceptables para el coeficiente de variación, estos deben
ser tomados solo como una referencia aproximada. Para concluir si realmente un
método es o no preciso se requiere de la aplicación de métodos estadísticos tales
como el cálculo del intervalo de confianza entre otras pruebas.
Debe señalarse que el coeficiente de variación puede también emplearse para
determinar la precisión de un analista; siempre y cuando, el método que se
aplica esté previamente validado y se considere preciso.
1.4.3.2. Veracidad o justeza
La veracidad o justeza puede definirse como la proximidad de la concordancia
entre el valor promedio obtenido en una serie de resultados de ensayo y el valor
de referencia aceptado de la propiedad analítica que se está midiendo, o sea, el
contenido verdadero de un analito dentro de la muestra en estudio. Si la
diferencia entre el valor hallado y el valor verdadero es pequeña, la exactitud es
buena. Una diferencia grande significa que la exactitud es inadecuada y revela la
existencia de errores determinados que deberían corregirse.
La falta de veracidad puede ser por defecto o por exceso:
a- Las desviaciones por exceso suelen producirse cuando existen interferencias
analíticas del método y la selectividad no es la adecuada: los resultados
finales son superiores a los verdaderos. En este caso, debería modificarse el
método para hacerlo más selectivo.
b- Las desviaciones por defecto suelen darse en métodos analíticos muy
laboriosos en varias fases, extracciones, purificaciones, etc., que se traducen
inevitablemente, en una disminución de la recuperación.
La veracidad se expresa matemáticamente en forma de porcentaje de
recuperación de la cantidad del analito presente en la muestra, o bien en forma
de diferencia entre el valor hallado y el valor verdadero. Lo más usual es emplear
como parámetro de medida el porcentaje de recuperación:
Promedio de los valores obtenidos experimentalmente (X

̅)
% Recuperación= ∙100
Valor real
40d78409-8f5a-44ad-af96-811f110af4ad
La determinación del porcentaje de recuperación se puede llevar a cabo a través

de tres procedimientos: A.) análisis repetido de una muestra de concentración
única conocida, B.) método de adición de patrón y C.) comparación con otro
método analítico ya validado.
A. Análisis repetido de una muestra de concentración única y conocida.
La muestra generalmente será una solución de concentración conocida formada
por adición de una cantidad única de patrón de analito.
Esta solución se analiza varias veces (n = 6 ó 10) por el método que se evalúa y
se calcula el % de recuperación. Por ejemplo, si se desea evaluar la veracidad de
un método de determinación de vitamina C en jugo de naranja, se prepara una
solución de un patrón de vitamina C a una única concentración (10 mg/100mL),
la cual constituye el valor real, y se determina el contenido de vitamina C a
través del método que desea evaluarse.
Supongamos que se obtuvieron los siguientes resultados:
Resultados obtenidos para 8 repeticiones (mg vit C/100 mL) Valor real (mg/100mL)
9,05 9,16 9,21 8,91 9,11 8,95 9,09 9,25 10
El % recuperación será:
̅)
Valor real
9,09
10
% Recuperación= 90.9 %
Este procedimiento posee el inconveniente de realizar el análisis en una solución
patrón del analito y no sobre la matriz, por lo que no considera la influencia de
posibles sustancias interferentes que pudieran existir en la matriz. Tal dificultad
puede minimizarse empleando el procedimiento de adición de patrón.
B. Método de adición de patrón.
En este caso se trabaja con el extracto del analito obtenido de la matriz original
por un procedimiento adecuado. De esta solución se toman como mínimo dos
alícuotas, a una de ellas se le añade una cantidad conocida de un patrón de
referencia del analito, y ambas se analizan en paralelo.
Un patrón de referencia es una sustancia de elevada pureza y estructura y composición

idénticas al analito que se determina. Así, por ejemplo, un patrón de referencia de la
vitamina C consiste en ácido ascórbico altamente puro. Hoy en día se comercializan
patrones de referencia para casi todas las sustancias conocidas y usualmente se
adquieren a altos precios.
Los resultados obtenidos de ambas determinaciones se procesan y la diferencia

(muestra + patrón) – (muestra sin patrón) indica la cantidad cuantificada del

patrón añadido por el método en cuestión. Este valor se compara con la cantidad
de patrón añadido (valor verdadero) y los resultados se expresan como
porcentaje de recuperación.
Retomando el ejemplo de vitamina C en el jugo de naranja empleando este
procedimiento, supongamos que se siguió la metodología descrita en la figura
1.2.
Figura 1.2. Metodología seguida para el ensayo de recuperación
Con estos resultados se puede calcular la cantidad de patrón cuantificado (PC)

por el método, según:
m(PC) = m(vit. C)PATRON + MUESTRA – m(vit. C)MUESTRA
m(PC) = 58,6 mg – 54,1 mg
m(PC) = 4,5 mg
calculando ahora el porcentaje de recuperación

̅)
Valor real
y se sabe que:
valor obtenido = m (PC) = 4,5 mg
valor real = m (patrón añadido) = 5 mg
entonces:
4,5 mg
5 mg
% Recuperación= 90 %
Aunque en este ejemplo se han procesado los resultados con un solo valor
calculado para cada caso (muestra + patrón) y (muestra sin patrón), en la
práctica deben realizarse repeticiones (n  7) y realizar los cálculos con los
valores promedios.
40d78409-8f5a-44ad-af96-811f110af4ad
Si la adición del patrón del analito se realiza desde las primeras fases del estudio
(directamente a la matriz, como en el ejemplo considerado) el % Recuperación
indica la veracidad del método. Por el contrario, si la adición del patrón se
efectúa inmediatamente antes de la medición, el %Recuperación solo indicará la
veracidad del instrumento.
C. Comparación con otro método analítico ya validado.
Otra posibilidad para conocer la exactitud de un método analítico es la
comparación de los resultados obtenidos por este, con los resultados obtenidos a
través de otro método ya validado.
En este procedimiento se parte de una muestra homogénea que se analiza
repetidamente (n  6) por el método analítico nuevo y por el método de
referencia.
Para cada serie de resultados se calcula la media y la desviación estándar y se
realizan pruebas estadísticas (t de student) para conocer si existen diferencias
entre las medias obtenidas por ambos métodos.
1.4.3.3. Linealidad
Se entiende por Linealidad la capacidad de un método analítico de obtener
resultados proporcionales a la concentración de analito en la muestra dentro de
un intervalo determinado. Dicho de otro modo, la Linealidad es la
proporcionalidad entre la concentración del analito y la respuesta del instrumento
en un intervalo o rango de concentraciones.
El ensayo de Linealidad puede efectuarse tanto sobre soluciones de
concentraciones crecientes del analito que se determina o sobre muestras
problemas a las que se han adicionado cantidades crecientes de un patrón del
analito. En ambos casos el procedimiento se conoce como “curva de calibración”
o “curva de calibrado”.
Los pasos generales para la realización de una curva de calibración son los
siguientes:
1. Se prepara una serie de soluciones de un patrón del analito a concentraciones
crecientes y se procede a su determinación en cada solución aplicando el
método que se evalúa y obteniéndose para cada solución una respuesta o
señal (mL consumidos, absorbancia, índice de refracción, etc.). el número de
soluciones puede estar comprendido entre 6 y 10 y las concentraciones se
seleccionan de acuerdo con las cantidades esperadas del analito en la
muestra.
Así, por ejemplo, en el análisis de la Linealidad de un método de determinación
de proteínas solubles en un extracto proteico de harina de soya se preparan
soluciones de una proteína patrón (albúmina de suero bovino) a concentraciones
de 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 y 1 mg/mL y se procede al análisis midiendo la

respuesta del método analítico (pudiera ser una señal instrumental como por
ejemplo absorbancia), para cada una de las soluciones preparadas.
2. Se determina la proporcionalidad existente entre la concentración y la
respuesta del método analítico, calculando por el método de ajuste mínimos
cuadrados la ecuación de regresión lineal del tipo.
y = mx + a
Donde: x = concentración, m = pendiente, y = respuesta del instrumento, a = intercepto
Los términos m (pendiente) y a (intercepto) pueden ser calculados a través de las

siguientes expresiones matemáticas
 x y
 xy − n
m=
( x )2
x − n 2
a=
 y − m x
n
donde: n es el número de soluciones preparadas.
Se calcula además el coeficiente de determinación (R2) el cual refleja el grado de
relación o proporcionalidad entre las variables concentración (x) y la respuesta
del instrumento (y). El coeficiente de determinación toma valores entre 0 y 1 y
mientras más se acerque a uno, mas linealidad existe entre las variables
evaluadas, es decir más lineal es el método analítico.
Retomando el ejemplo de la determinación de proteínas solubles, supongamos
que se obtuvieron las siguientes respuestas ( y) para cada concentración (x)
ensayada:
mg de proteína /mL (x) 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1

Respuesta del instrumento (y) 0,019 0,040 0,076 0,111 0,156 0,216
Al calcular la ecuación de regresión se obtuvo:
y = 0,2063 x – 0,046
y un coeficiente de determinación (R2) igual a 0,9931 lo cual demuestra que el
método considerado presenta una buena linealidad, en el rango de
concentraciones estudiadas (0,1—1mg/mL).
En el capítulo 3, epígrafe 3.7.2.2, se profundizará sobre la utilidad de la curva de
calibración como procedimiento de cuantificación y sobre el tratamiento
estadístico pertinente.
40d78409-8f5a-44ad-af96-811f110af4ad
1.4.3.4. Sensibilidad
En general se acepta que la sensibilidad de un instrumento o de un método es
una medida de su capacidad de diferenciar pequeñas variaciones en la
concentración del analito. Dos factores limitan la sensibilidad: la pendiente de la
curva de calibrado y la reproducibilidad o precisión del sistema de medida. Entre
dos métodos que tengan igual precisión, será más sensible aquel cuya curva de
calibrado tenga mayor pendiente. Obviamente si dos métodos tienen curvas de
calibrado con igual pendiente, será más sensible aquel que presente la mejor
precisión.
En un método analítico sensible, ligeros incrementos de la concentración del
analito provocan incrementos notables de la señal o respuesta que se mide.
Sensibilidad de calibrado
La definición cuantitativa de sensibilidad, aceptada por la Unión Internacional de
Química Pura y Aplicada (IUPAC), es la de sensibilidad de calibrado, que se
define como la pendiente de la curva de calibrado a la concentración objeto de
estudio. La mayoría de las curvas de calibrado que se usan en química analítica
son lineales y se pueden representar mediante la ecuación
S = mc + Sbl
en la que S es la señal medida, c es la concentración del analito, Sbl, es la señal
instrumental de un blanco y m es la pendiente de la línea recta. El valor de Sbl
será el intercepto, es decir, la intersección de la recta con el eje y. En dichas
curvas, la sensibilidad de calibrado es independiente de la concentración c y es
igual a la pendiente m. La sensibilidad de calibrado como parámetro de calidad
tiene el inconveniente de no tener en cuenta la precisión de las medidas
individuales.
Sensibilidad analítica
Mandei y Stiehler consideraron la necesidad de incluir la precisión en un
tratamiento matemático coherente para la sensibilidad y proponen la siguiente
definición para la sensibilidad analítica, representada por 
 = m/SS
Aquí, m es de nuevo la pendiente de la curva de calibrado y SS es la desviación
estándar de las medidas.
La sensibilidad analítica tiene la ventaja de ser relativamente insensible a los
factores de amplificación. Por ejemplo, al aumentar la ganancia de un
instrumento por un factor de cinco, el valor de m se incrementará en cinco veces.
Sin embargo, este aumento vendrá acompañado, en general, del
correspondiente aumento en SS, y por tanto la sensibilidad analítica se
mantendrá prácticamente constante. La segunda ventaja de la sensibilidad
analítica radica en su independencia de las unidades de medida de S.
Una desventaja de la sensibilidad analítica es que generalmente depende de la

concentración, ya que SS puede variar con ella.
1.4.3.5. Límite de detección
El límite de detección es la mínima concentración o la mínima masa de analito
que se puede detectar para un nivel de confianza dado. Dicho de otro modo, es
la cantidad o el contenido de un analito que corresponde a la señal de medición
más baja que con cierta confianza estadística puede ser interpretada como un
indicador de que el analito está presente en la solución, pero no necesariamente
permitiendo su exacta cuantificación.
El límite de detección es por tanto un parámetro analítico de gran interés en
ensayos de límites, análisis de trazas, contaminantes y productos de
degradación. Los términos cualitativos que aparecen en muchas publicaciones
como “ausencia de...” o “no detectado”, tiene su expresión numérica en el límite
de detección. Es más correcto decir “menos de 1g/g” que “ausencia de...”
Experimentalmente, el límite de detección se puede determinar realizando de 20
a 30 medidas del blanco, preferiblemente durante un amplio período de tiempo.
El límite de detección se calcula entonces como tres veces la desviación estándar
absoluta de la media obtenida de los resultados del blanco (tres desviaciones
estándar corresponden a una confianza de 99%).
Algunos métodos analíticos producen señales inciertas en la muestra-blanco. En
tales casos puede intentarse ampliar el ruido del instrumento y establecer el
límite de detección como tres veces la desviación típica del ruido.
Cuando se amplía el ruido del instrumento, se deben utilizar extractos de la
muestra-blanco (muestras-blanco concentradas). Este extracto debe ser,
además, significativamente más concentrado que los extractos de muestras
normales con el fin de establecer que no haya interferencia de ningún
componente.
El límite de detección es muy importante en el análisis elemental de trazas. Por
otro lado, es generalmente innecesario estimar este límite cuando se evalúan
métodos para la determinación de componentes principales de los alimentos.
1.4.3.6. Límite de cuantificación
El límite de cuantificación de un procedimiento o de un instrumento analítico es
la cantidad más baja de analito en una muestra que puede ser cuantitativamente
determinada con cierta confianza. A este límite también se le llama límite de
determinación.
Para su determinación experimental se analizan un número de muestras blanco
entre 20 y 30. El límite de cuantificación se calcula como 10 veces la desviación
estándar de la media de la muestra-blanco. La cantidad o el contenido de las
muestras, se determina a partir de la curva de calibración.
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Cuando se evalúan métodos cuantitativos, es importante definir y estimar la

concentración más baja que puede ser medida con una precisión suficientemente
definida. El procedimiento recomendado arriba está basado en la suposición de
que la precisión en el límite de determinación es igual a un análisis blanco
(dominio del ruido de fondo). Una medición correspondiente a 10 desviaciones
típicas tendrá entonces una precisión relativa del 30% ya que la precisión
absoluta (99% confianza, 10-15 mediciones) se estima para tres desviaciones
típicas.
El límite de cuantificación es, por lo tanto, un término cuantitativo (menor
cantidad medible) mientras que el límite de detección es cualitativo (menor
cantidad detectable).
La determinación práctica de los límites de detección y cuantificación es
laboriosa, por lo que solo se efectúa en el caso de métodos empleados para el
análisis de trazas, contaminantes e impurezas a muy bajas concentraciones.
Si las concentraciones a determinar son elevadas, se puede sustituir su estudio
por la determinación de la precisión y la veracidad a la concentración más baja
que presente el analito en la práctica.
1.4.3.7. Intervalo de concentración
El intervalo de concentración, también llamado intervalo de medición, es el
intervalo lineal de un método analítico o de un instrumento, que va desde la
concentración más pequeña a la que se puede realizar la cuantificación (límite de
cuantificación, LOQ) hasta la concentración a la que la curva de calibrado se
desvía de la linealidad (límite de linealidad, LOL). Para las medidas cuantitativas
se toma como límite inferior, en general, la que corresponde a diez veces la
desviación estándar de las medidas repetidas en un blanco o 10sbl.
La figura 1.3 ilustra la definición de intervalo lineal de un método analítico.
Figura 1.3. Intervalo lineal de un método analítico.

LOQ= límite de cuantificación, LOL= límite de linealidad

Algunos ejemplos de la pérdida de linealidad a bajas y altas concentraciones se

relacionan a continuación:
• Los métodos espectrométricos usualmente tienen un rango lineal de trabajo
hasta una cierta concentración. A concentraciones superiores, la curva se
inclina hacia el eje de las concentraciones. A menos que el método vaya a ser
utilizado para fines muy limitados en un rango de concentración conocida, es
necesario estudiar la extensión del rango lineal. Además, es meritorio
determinar en qué medida se satisfacen para este rango los requisitos
respecto a la precisión y la veracidad. En la práctica, la limitación relativa a la
parte inferior de la curva patrón se obtiene en la forma de límite de
cuantificación.
• Los electrodos de ión selectivo muestran una respuesta que tienen una
relación lineal contra el logaritmo de la concentración para un amplio rango
de concentración (generalmente desde mg/kg hasta concentraciones
molares), pero la curva se inclinará hacia el eje y cuando la concentración se
aproxime a cero. El límite de cuantificación puede entonces definirse como la
región inferior de la curva patrón aún lineal. Las muestras con muy baja
concentración pueden ser llevadas al rango lineal añadiendo cantidades
conocidas del analito. Durante la validación y verificación debe también
asegurarse que se reúnen los requisitos de precisión y veracidad en el rango
lineal.
• Los métodos gravimétricos y volumétricos (entre los que se encuentran
algunos métodos analíticos importantes como materia seca, ceniza, grasa y
nitrógeno Kjeldahl) no requieren la evaluación de la linealidad, pero si el
método se utiliza para determinar muy bajas concentraciones debe hallarse
entonces el límite de cuantificación.
1.4.3.8. Selectividad
La selectividad o especificidad se define como la capacidad de un método
analítico para medir exacta y específicamente el analito, sin interferencia de
impurezas u otros componentes que puedan estar presentes en la muestra.
La selectividad es una condición esencial para conseguir una buena exactitud,
por lo que constituye un criterio clave en la validación de un método analítico.
La selectividad depende de las características del propio método analítico y de las
características de la muestra (matriz) que se analiza.
Mientras más específica sea la reacción o el principio empleado para la
determinación, más selectivo será el método, puesto que se evitan reacciones
colaterales secundarias. Ahora bien, si la reacción es poco específica, otros
compuestos en la muestra serán capaces de reaccionar actuando como
interferencias y afectando la exactitud del método.
Por otra parte, la selectividad depende también de las características, naturaleza
y composición de la matriz estudiada. No es lo mismo determinar la
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concentración de vitamina C en tabletas, una matriz relativamente simple,

empleando un método reductimétrico, que determinar vitamina C en un alimento
vegetal donde puede existir un conjunto de compuestos reductores que
experimenten la misma reacción que el analito y actúen como interferencias. De
ahí que un método analítico puede ser muy específico para un tipo de muestra
(tabletas) y poco específico para otra matriz (alimento vegetal).
Los elementos antes expuestos, demuestran que, al validar un método de
análisis, debe reflejarse claramente no solo el analito que se certifica sino
también la matriz para la cual es válida la determinación.
La selectividad se evalúa usualmente a través de la Exactitud (% Recuperación)
empleando alguno de los siguientes procedimientos:
1. Se prepara una muestra que contiene los componentes usualmente presentes
en la matriz original (alimento), excepto el analito y se procede a la
determinación del analito en las condiciones del método evaluado. De forma
ideal, ninguno de los componentes presentes debe producir una respuesta
cuantificable del instrumento.
2. Se prepara una muestra con un patrón del analito y un componente de las
posibles impurezas. Se realiza la cuantificación y se comparan los resultados
con una muestra que solo contiene patrón del analito. En este caso hay que
aplicar pruebas estadísticas para corroborar la existencia o no de diferencias
entre los resultados obtenidos en ambos ensayos.
En resumen, un estudio de selectividad debe asegurar que la señal medida con el
método analítico procede únicamente de la sustancia a analizar sin interferencias
de otros componentes que estén presentes en la matriz estudiada.
Trabajo Independiente
Consulte los apéndices A-1, A-2, A-3 y A-4, en los que aparece un
resumen del presente capítulo.
BIBLIOGRAFÍA
1. Barzola, S, Zumbado, H. (2018). Manual teórico práctico de análisis
volumétrico de los alimentos, Editorial Grupo Compás, Guayaquil, Ecuador.
2. Cabrera, A. y Lines, G. (1985). Análisis Instrumental. Métodos ópticos. Tomo
I. Ed. Pueblo y Educación, La Habana. Cuba.
3. Colectivo de autores. (1999). Manual de Indicadores Empleados en la
Evaluación Sanitaria. Ministerio de Salud Pública. Instituto de Nutrición e
Higiene de los Alimentos. La Habana, Cuba.

4. Fon Fay, F, Zumbado, H. (2019). Análisis proximal en alimentos.

Fundamentos teóricos y técnicas experimentales. Editorial Coloquium.
Ecuador.
5. McLeod, J. A. (1973). Instrumental Methods of Food Analysis. Elek Science.
London.
6. NMKL Procedure Nº 4 (1996) Validation of Chemical Analytical Methods.

Version 1.
7. Pina, G. y Dorojova, E. (1991). Temas de Análisis Instrumental I. Tomo IV.
ENPES. La Habana. Cuba.
8. Sayago, A; Hernanz, D; Gallo, V; Beltrán, R. (2011). Adaptación de las
prácticas de Análisis Instrumental al Espacio de Convergencia Europeo.
Elaboración de Material Didáctico. Formación Universitaria – Vol. 4 Nº 1.
9. Skoog, D; Holler, F y Nieman, T. (2001). Principios de Análisis Instrumental.
Quinta edición. McGraw-Hill/Interamericana de España, S.A.U.
10. Zumbado, H. (2006). Análisis Químico de los Alimentos. Métodos Clásicos.
Ed. Félix Varela. La Habana. Cuba.
40d78409-8f5a-44ad-af96-811f110af4ad
2 Introducción a los métodos ópticos
Todos los métodos ópticos se basan en la interacción de la radiación

electromagnética con las sustancias, de ahí que antes de comenzar su estudio
resulta obligado estudiar brevemente las propiedades fundamentales de la
radiación electromagnética.
2.1. CARACTERÍSTICAS DE LA RADIACIÓN ELECTROMAGNÉTICA

La radiación electromagnética (REM) es un tipo de energía que se transmite por
el espacio a enormes velocidades; adopta muchas formas, siendo la más
fácilmente reconocibles la luz y el calor radiante. Manifestaciones menos
evidentes son los rayos X, la radiación ultravioleta e infrarroja, las microondas y
las ondas de radio.
Las primeras teorías conocidas acerca de la naturaleza de la REM datan del siglo
XVII, destacándose las teorías de Huyghens, que consideraba la luz como una
onda, y la de Newton, que en 1704 la describió como un flujo de partículas,
explicando la reflexión de la luz como los “choques” de esas partículas en un
espejo. La reputación que ya poseía este último en la época hizo que
mayoritariamente se aceptara la luz como un flujo de partículas.
Dos siglos más tarde (XIX) se logra dar explicación a fenómenos tales como la
interferencia, la difracción y la polarización de la luz sobre la base del modelo
ondulatorio a través de las aportaciones de Young y Fresnel. En 1860 aparece la
teoría de Maxwell del campo electromagnético, que relaciona la óptica con el
magnetismo y se determina que la velocidad de propagación de las ondas
electromagnéticas en el vacío tiene un valor de 300 000 km/s, lo que concuerda
admirablemente con los resultados experimentales. A partir de este momento el
modelo ondulatorio gana una preponderancia absoluta sobre el modelo
corpuscular.
Sin embargo, a finales del siglo XIX y principios de del XX se detectan fenómenos
que no se pueden explicar sobre la base del modelo ondulatorio, tales como: la
distribución de intensidades de los espectros de radiación de los sólidos a alta
temperatura y el efecto fotoeléctrico
Estos fenómenos lograron explicarse posteriormente sobre la base de modelos
que no consideraban el carácter ondulatorio de la luz, sino que más bien lo
rechazaban. Así, aparece la teoría cuántica de la luz (Planck, 1900) y la teoría de
los fotones de Einstein (1905). Según este último modelo, la luz es un flujo de
partículas que se transmite no en forma continua sino en forma discreta como
paquetes de energía que Einstein denominó fotones.
Como se observa los estudios sobre la naturaleza de la REM son aparentemente
39
2. Introducción a los métodos ópticos
contradictorios y esta ambigüedad es precisamente la característica esencial que

le atribuye a la luz conjuntamente propiedades de onda y de partícula. Esta
particularidad de la luz se conoce como dualidad partícula-onda.
Hasta el momento no existe una teoría unificada capaz de explicar todos los
fenómenos conocidos en que interviene la luz. Las teorías ondulatoria y
corpuscular se complementan. Algunos fenómenos se explican correctamente
utilizando la teoría ondulatoria, mientras que otros necesitan de la teoría
corpuscular para ser analizados satisfactoriamente. El punto de vista moderno
es considerar que la luz no es partícula ni es onda; se manifiesta como una o
como otra en dependencia de la interacción específica que se esté considerando,
y se trabaja para encontrar una teoría que represente mejor sus propiedades.
2.1.1. Propiedades de las ondas
Con diversos fines resulta conveniente considerar la radiación electromagnética
como un campo de fuerza eléctrico oscilatorio en el espacio que está
acompañado de un campo de fuerza magnético que oscila perpendicularmente.
La figura 2.1 es una representación gráfica del vector eléctrico de una radiación
monocromática polarizada en un plano, que es tipo más simple de radiación.
Monoromática significa que la radiación tiene una sola frecuencia y polarizada en
un plano significa que la oscilación tiene lugar en un plano del espacio y solo en
uno.
Figura 2.1. Representación de un haz de radiación monocromática polarizada en un

plano. Las flechas representan el vector eléctrico.
Los parámetros que caracterizan a la radiación electromagnética como una onda,

son los siguientes:
• Longitud de onda (). Es la distancia entre dos máximos o dos mínimos
sucesivos de una onda. Se expresa en unidades de longitud, siendo las más
usuales: nm, cm, y metros.
• Frecuencia (). Es el número de oscilaciones del campo por unidad de tiempo,
generalmente 1 segundo. Se expresa en hertz (1 Hz = 1 ciclo/s).
• Velocidad de propagación (v). Se define como el producto de la longitud de
onda por la frecuencia (v= ) y alcanza su valor máximo en el vacío. La
40d78409-8f5a-44ad-af96-811f110af4ad
velocidad de la REM en el vacío se representa por c y tiene un valor de

2.99792 x 1010 cm/s. Así para el vacío:
c=   3 x 1010 cm/s
La velocidad de la luz en el aire difiere muy poco de c (0.03 % o menos) por
lo que en la práctica esta ecuación resulta igualmente aplicable al aire y al
vacío.
Queda claro también que los parámetros frecuencia () y longitud de onda ()
son inversamente proporcionales.
• Número de onda (  ). Se define como el número de ondas por unidad de

longitud (1 cm) y no es más que el inverso de la longitud de onda siendo sus
unidades más frecuentes cm -1.
1
 =

• Potencia radiante (P). La potencia de un haz de radiación es la energía del
haz que llega a un área dada por segundo; la intensidad I es la potencia por
ángulo sólido unitario. Aunque no es rigurosamente correcto, potencia e
intensidad se utilizan a menudo como sinónimos.
Para caracterizar muchas de las propiedades de la radiación electromagnética es
conveniente adjudicar una naturaleza ondulatoria a su propagación y describir
estas ondas con los parámetros arriba relacionados (velocidad, frecuencia,
longitud de onda). Sin embargo el modelo ondulatorio no explica completamente
los fenómenos asociados con la absorción o emisión de energía radiante; para
estos procesos es necesario considerar la teoría corpuscular.
2.1.2. Propiedades de la radiación considerada como partícula.
En 1905 Einstein postuló que la energía de un haz de radiación no estaba
distribuida por el espacio en los campos eléctricos y magnéticos de una onda
electromagnética, sino que se encontraba concentrada en pequeños paquetes de
energía, a los que denominó fotones o cuantos de energía.
La energía E del fotón es proporcional a la frecuencia de la radiación según:
E= h
donde h es la constante de Planck (6.63 x 10-27 ergios/seg)
en términos de longitud de onda quedaría:
hc
E=

De aquí que la energía de un fotón es directamente proporcional a la frecuencia e
inversamente proporcional a la longitud de onda. Por consiguiente, la energía de
un fotón de rayos X (  10-8 cm) es aproximadamente 10 000 veces mayor que
la de un fotón emitido por un filamento de tungsteno caliente (  10-4 cm).
La energía de un fotón se expresa usualmente en joule (J), en J/mol o en kJ/mol.

2.2. Espectro electromagnético
En las técnicas espectroscópicas se utilizan diferentes magnitudes para
caracterizar las radiaciones, todas ellas relacionadas entre sí. La frecuencia 
(Hz), la energía asociada al fotón o mol de fotones (J, J/mol) y el número de
onda  ((cm-1) son directamente proporcionales mientras que la longitud de
onda λ (m, cm, nm) es inversamente proporcional a las anteriores. De acuerdo
con estas magnitudes se pueden clasificar a las radiaciones electromagnéticas en
diferentes regiones, de fronteras algo imprecisas, donde los procesos
moleculares asociados con la absorción o emisión son bien diferentes.
Así, el espectro electromagnético es el conjunto de radiaciones electromagnéticas
en sucesión, ordenadas de acuerdo con su frecuencia.
En la figura 2.2 y la tabla 2.1 se muestran las diferentes regiones del espectro
electromagnético y el rango de longitudes de ondas y frecuencias
correspondientes a cada una de ellas.
Figura 2.2. Regiones del espectro electromagnético.
Tabla 2.1. Características de las diferentes regiones del espectro electromagnético.
Longitud de onda 
Energía Frecuencia 
Región
(J/mol) (Hz) cm
Unidades
usuales
Rayos gamma -  3.1020  1.1010  100 Aº
Rayos X  miles kJ/mol 3.1017 – 3.1020 1.1010 – 1.107 102 – 10 Aº
Ultravioleta  decenas kJ/mol 8.1014 – 3.1017 1.107 – 4.105 1 – 200 nm
Visible  decenas kJ/mol 4.1014 – 8.1014 4.105 – 8.105 400 – 800 nm
Infrarrojo  miles J/mol 1.1012 – 4.1014 8.105 – 3.102 1 – 300 m
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Longitud de onda 
Energía Frecuencia 
Región
(J/mol) (Hz) cm
Unidades
usuales
Microondas  decenas J/mol 3.108 – 1.1012 3.102 – 100 0.03 – 100 cm
Radiofrecuencias hasta 1 J/mol 3.105 – 3.108 100 – 105 1 – 1000 m
Obsérvese que el rango de longitudes de onda del visible (únicas radiaciones

capaces de ser detectadas por el ojo humano) solo abarcan una pequeña zona
del espectro electromagnético ( 400 – 800 nm).
2.3. INTERACCIÓN DE RADIACIÓN ELECTROMAGNÉTICA CON LA MATERIA

Cuando la radiación pasa desde el vacío a la superficie de una porción de
materia, el vector eléctrico de la radiación interacciona con los átomos y
moléculas del medio. La naturaleza de esta interacción depende de las
propiedades de la materia y puede dar lugar a procesos de absorción, emisión,
refracción y desviación del plano de luz linealmente polarizada, entre otros
fenómenos.
2.3.1. Absorción de radiación electromagnética
Cuando pasa una radiación a través de una capa transparente de un sólido,
líquido o gas, parte de esta radiación, de determinada frecuencia, puede ser
absorbida por la materia. En este caso, la energía electromagnética se transfiere
a los átomos o moléculas que constituyen la muestra y como resultado, estas
partículas pasan del estado de más baja energía o estado fundamental a estados
de mayor energía o estados excitados. A temperatura ambiente la mayoría de las
sustancias se encuentran en su nivel energético más bajo, o sea en estado
fundamental. La absorción de radiación es por lo tanto una absorción de energía
que produce una transición entre el estado fundamental y estados de mayor
contenido energético (figura 2.3).
Ahora bien, los átomos, moléculas e iones tienen un número limitado de niveles
de energía; estos niveles están cuantizados y para pasar de uno a otro la
molécula experimenta un cambio brusco que implica una cantidad definida de
energía a aceptar o ceder al medio en que se encuentra; entonces para que se
produzca absorción de radiación, la energía del fotón excitante debe igualar la
diferencia de energía entre el estado fundamental (E 0) y uno de los estados
excitados (E1, E2, … En) de la especie absorbente, según:
En – E0 = ∆E = h
Esta relación es conocida como condición de frecuencia de Bohr y vincula a la

frecuencia () de la radiación capaz de inducir la transición entre los estados del
sistema con la diferencia de energía entre los mismos (figura 2.3).

Figura 2.3. Representación esquemática del proceso de absorción de radiación.
Las diferencias de energía entre los diferentes niveles energéticos son únicas
para cada especie y dependen de su estructura, ello significa que cada sustancia
absorbe radiación de diferente energía y longitud de onda. Así mismo, un estudio
de las frecuencias de radiación absorbida, ofrece un medio para caracterizar a los
constituyentes de una muestra de materia.
2.3.1.1. Espectros de absorción
Un espectro de absorción se obtiene al someter una muestra a un barrido de
radiación electromagnética de diferentes longitudes de onda. Así, un espectro de
absorción nos permite conocer como una sustancia absorbe selectivamente
radiación de diferente contenido energético (diferente frecuencia y diferente
longitud de onda), lo cual dependerá de sus niveles energéticos que a su vez
están determinados por su estructura química.
La manera más usual de representar un espectro de absorción es mediante un
gráfico en cuya abscisa (eje X) se representa una magnitud de la radiación
(frecuencia, longitud de onda, numero de onda) y en la ordenada (eje y) se
describe la intensidad de la absorción por la sustancia (Absorbancia, % de
transmitancia). La figura 2.4 Muestra los espectros de absorción de la molécula
de vitamina E y del hierro en estado atómico.
Nótese la marcada diferencia del aspecto general de ambos espectros. Mientras
el espectro de absorción molecular se caracteriza por presentarse en forma de
bandas cubriendo una amplia gama de longitudes de ondas, el espectro de
absorción atómica se presenta en forma de líneas, correspondientes a unas
pocas frecuencias. Las razones de estas diferencias se explican en los próximos
epígrafes.
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Figura 2.4. Espectros de absorción molecular y atómica en las regiones UV y visible.
2.3.1.2. Absorción atómica

Cuando se hace pasar radiación policromática ultravioleta o visible a través de un
medio formado por partículas monoatómicas, como por ejemplo vapores de
sodio, se produce absorción solo en unas pocas frecuencias bien definidas. La
relativa simplicidad de estos espectros se debe se debe a que el posible número
de estados energéticos de los átomos es pequeño. La excitación tiene lugar
solamente por procesos electrónicos, en los que uno o más de los electrones del
átomo se elevan a un nivel de energía más alto. Así por ejemplo, para el caso del
sodio la excitación del electrón 3s al estado 3p requiere una energía
correspondiente a una longitud de onda de 589.2 nm (luz amarilla), de ahí que el
espectro de absorción para el vapor de sodio conste de un pico estrecho a este
valor de .
La radiación ultravioleta y visible tiene suficiente energía para causar
transiciones de los electrones más externos, llamados también electrones de
enlace, mientras que las frecuencias de los rayos X son mas energéticas y
pueden interaccionar con los electrones más cercanos a los núcleos de los
átomos y producir espectros con picos de absorción correspondientes a
transiciones electrónicas de los electrones más interiores.
Cualquiera que sea la longitud de onda, los espectros de absorción atómica
constan de un número limitado de picos muy estrechos (espectro de líneas),
debido al reducido número de niveles energéticos de los átomos.
2.3.1.3. Absorción molecular
La absorción por moléculas poliatómicas es un proceso considerablemente más
complejo que la absorción atómica, debido al gran número de estados

energéticos que poseen las moléculas. La energía total de una molécula está
dada por:
E TOTAL =E ELECTRÓNICA +E VIBRACIONAL +E ROTACIONAL
donde
E ELECTRÓNICA describe la energía de los electrones de una molécula.
E VIBRACIONAL se refiere a la energía de la molécula relacionada con las diferentes
vibraciones de los átomos enlazados entre si y que involucran cambios en las
distancias interatómicas y n los ángulos de enlace.
E ROTACIONAL designa la energía asociada con la rotación de la molécula alrededor
de su centro de gravedad.
Para cada estado electrónico de una molécula hay normalmente varios estados
vibratorios posibles y a su vez, para cada uno de estos existen numerosos
estados rotatorios. Como consecuencia, el número de posibles niveles de energía
de una molécula es grande y por tanto es también grande el número de
diferentes longitudes de ondas que puede absorber.
En la figura 2.5 Se muestra una representación gráfica de las energías asociadas
con unos pocos estados electrónicos, vibratorios y rotatorios de una molécula.
Figura 2.5. Diagrama parcial de los niveles energéticos para una molécula.
La línea gruesa marcada E0 representa la energía electrónica de una molécula en

el estado base o fundamental) el estado de menor energía electrónica) mientras
que las líneas marcadas E1 y E2 representan las energías de dos estados
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electrónicos excitados. Nótese que cada nivel electrónico tiene asociado

numerosos niveles vibracionales (líneas finas), los cuales a su vez involucran
varios niveles rotacionales (líneas discontinuas). Obsérvese además que las
diferencias de energía entre el estado fundamental y un estado electrónicamente
excitado son mucho mayores que las existentes entre los distintos niveles
vibratorios de un estado electrónico dado.
En esta misma figura (¿?) se representan con flechas algunas de las transiciones
que se producen como consecuencia de la absorción de radiación. Así por
ejemplo, la radiación proveniente del infrarrojo (IR) medio y cercano, que es
poco energética, no resulta suficiente para producir un salto electrónico y solo
puede dar lugar a transiciones entre los distintos niveles vibratorios del estado
fundamental.
Sin embargo la radiación proveniente de las zonas del visible y el ultravioleta
(UV) son más energéticas y provocan la excitación de un electrón desde E 0 hasta
cualesquiera de los niveles vibratorios asociados con E 1 e incluso hasta E2 si se
trata de radiación UV lo suficientemente energética.
Obviamente, para producir transiciones rotatorias puras se requerirá una energía
muy pequeña correspondiente con frecuencias de las regiones de IR lejano y las
microondas. Así mismo, radiaciones fuertemente energéticas como las del UV
lejano y los rayos X pueden producir ionización de la molécula y cambios
importantes en el interior electrónico.
En la tabla 2.2 Se presenta un resumen de los principales procesos que pueden
ocurrir en moléculas y átomos por absorción de radiación de diferentes regiones
del espectro electromagnético.
Tabla 2.2. Procesos que pueden ocurrir en átomos y moléculas por absorción en
dependencia de la energía de la radiación
PROCESO ESPECIE QUE ABSORBE REGIÓN DEL ESPECTRO

Cambios en el interior
Moléculas y átomos Rayos X
electrónico
Ionización Moléculas UV lejano
Cambios en las afueras
Moléculas y átomos UV cercano y visible
electrónicas
Vibración Moléculas IR cercano y medio
Rotación Moléculas IR lejano y microondas
A diferencia de los espectros de absorción atómica que consisten en un conjunto

de líneas netas y bien definidas, los espectros moleculares en las regiones del UV
y el visible se presentan como bandas de absorción que suelen abarcar un
intervalo considerable de longitudes de onda debido al gran número de
posibilidades de transiciones electrónicas que posee una molécula, por cuanto
con cada transición electrónica se asocian varias líneas de absorción

estrechamente agrupadas por la existencia de numerosos estados vibratorios que

incluyen a su vez niveles de energía rotatoria.
En la región del infrarrojo (IR) los espectros poseen un mayor números de
bandas puesto que en esta zona se detectan los diferentes modos de vibración
de la molécula (recordar que la energía del IR no es suficiente para provocar
transiciones electrónicas y solo conducen a transiciones de los estados
vibratorios). En este caso el espectro se presenta como número de ondas
(10000-200cm-1) vs. Transmitancia.
2.3.2. Emisión de radiación electromagnética
La emisión de radiación es un fenómeno estrictamente inverso a la absorción. A
menudo se produce emisión de radiación cuando las partículas excitadas
(moléculas, átomos, iones) retornan a niveles de energía más baja o a su
estado fundamental. La excitación puede producirse por diferentes medios, entre
ellos, el bombardeo con electrones u otras partículas elementales, la exposición
a chispas de corriente alterna de alto potencial, el tratamiento térmico en una
llama o por absorción de radiación electromagnética. La figura 2.6 muestra una
representación esquemática de este proceso.
Figura 2.6. Representación esquemática del proceso de emisión de radiación
De forma análoga a como ocurre en los espectros de absorción, los espectros de

emisión atómica se presentan en forma de líneas (espectro discontinuo) mientras
las moléculas producen espectros de bandas (espectro continuo).
2.3.2.1. Fluorescencia y fosforescencia.
La fluorescencia y la fosforescencia constituyen procesos de emisión en los que
los átomos o moléculas se excitan por absorción de radiación electromagnética.
Cuando las especies excitadas retornan al estado fundamental tiene lugar la
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emisión de radiación.
La fluorescencia ocurre mucho más rápidamente que la fosforescencia y por lo
general se ha completado aproximadamente después de 10 -5 segundos (o
menos) a partir del momento de la excitación. Por su parte, la fosforescencia se
mantiene por un período mayor de tiempo y puede continuar durante varios
minutos y horas después de haber cesado la radiación excitante.
La fluorescencia de resonancia, se refiere se refiere a un proceso en el que la
radiación emitida tiene la misma frecuencia (y longitud de onda) que la radiación
absorbida. En este caso la especie se excita desde el estado base (E 0) a un
estado energético E1 o E2 por efecto de una radiación incidente de contenido
energético (E1 – E0) o (E2 – E0). Después de un breve período se produce la
emisión de radiación de idéntica energía. La fluorescencia de resonancia se
produce generalmente por átomos en estado gaseoso, debido a que los mismos
no poseen estados energéticos vibratorios asociados a los estados energéticos
electrónicos (recordar que lo átomos solo tienen estados electrónicos).
La fluorescencia no resonante se produce como resultado de la emisión de
radiación por moléculas en solución (o en estado gaseoso) y presenta la
característica de que la radiación emitida es, generalmente, de menor contenido
energético que la absorbida. Como ya se ha explicado, las moléculas poseen un
conjunto de estados vibratorios asociados a los estados electrónicos excitados.
Así, la excitación de una molécula por absorción de radiación UV-vis conduce al
tránsito hacia alguno de los diferentes niveles vibratorios de un estado
electrónico excitado (ver figura 2.5), sin embargo, los tiempos de permanencia
en estos estados vibratorios son instantáneos ( 10-15 segundos) e
inmediatamente se produce una relajación hacia un nivel vibratorio más bajo
dentro del estado electrónico excitado, en el cual la energía se pierde en forma
de calor; a partir de aquí, hay una desexcitación hasta el estado fundamental E 0
con la consecuente emisión de radiación electromagnética de menor energía y
mayor longitud de onda.
La figura 2.7 muestra un esquema de los procesos de fluorescencia resonante y
no resonante.
2.3.3. Refracción de radiación
Cuando la radiación incide con un determinado ángulo en la interfase entre dos
medios transparentes que tienen densidades diferentes, se observa un cambio
brusco en la dirección del haz como consecuencia de una diferencia en la
velocidad de la radiación en los dos medios. A esta desviación se le denomina
refracción.
Cuando el haz pasa de un medio menos denso a uno más denso, como en la
figura 2.8, la desviación se acerca a la normal. Cuando pasa de un medio más
denso a otro menos denso, se observa una desviación separándose de la normal.

Figura 2.7. Procesos de emisión. (A). Fluorescencia resonante, característica de los

procesos de emisión atómica, en la que se emite una radiación de igual frecuencia que la
absorbida. (B). Fluorescencia no resonante, característica de los procesos de emisión
molecular, en la generalmente se emite una radiación de menor frecuencia (mayor
longitud de onda) que la absorbida, debido a fenómenos de relajación vibratoria.
Figura 2.8. Refracción de la luz al pasar del medio M1 menos denso al medio M2 más
denso en el cual su velocidad es menor
El índice de refracción () de un medio es entonces una medida de su interacción

con la radiación y se define como:
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c
ηi = (2.1)
vi
donde
ηi es el índice de refracción para una frecuencia i determinada
vi es la velocidad de la radiación en el medio
c es la velocidad de la radiación en el vacío
La magnitud de la refracción viene dada por la ley de Snell:
sen θ1 η v1
= 2= (2.2)
sen θ2 η1 v2
donde v1 y v2 son las velocidades del haz de radiación en el medio 1 y en el

medio 2 respectivamente.
Si M1 en la figura 2.7 representa el vacío, vi se iguala a c (velocidad de la luz en
el vacío), y ηi es la unidad (véase ecuación 2.1); después de reordenar la
ecuación 2.2, se simplifica a:
(sen θ1 )vacío
(η2) =
vacío sen θ2
Los índices de refracción de la sustancia M2 pueden calcularse, por tanto, a partir
de las medidas de (θ1 )vacío y de θ2 . Por conveniencia, los índices de refracción se
suelen medir y escribir tomando el aire como referencia más que el vacío.
Entonces el índice de refracción viene dado por:
(sen θ1)aire
(η2) =
aire sen θ2
La mayoría de las tablas de índice de refracción proporcionan los datos con
respecto al aire y no al vacío. Dichos datos se transforman fácilmente en índices
de refracción respecto al vacío multiplicándolos por el índice de refracción del
aire respecto al vacío, o sea, ηvacío = 1,00027 ηaire pero esta conversión rara vez
se usa en la práctica debido a la similitud de los índices de refracción de las
sustancias con respecto al aire y al vacío.
Los principios de la refracción de la radiación son empleados en la aplicación de
un método instrumental conocido como refractometría, el cual será abordado con
detalle en el capítulo 7 de este texto.
2.3.4. Polarización de la radiación
La radiación electromagnética puede ser considerada como una onda transversal
donde las direcciones de los vectores vibratorios eléctricos y magnéticos deben
ser normales a la dirección de propagación.
La radiación que se propaga en una dirección dada consiste en trenes de onda
cuyos planos de vibración están orientados al azar con respecto a la dirección de
propagación. Esta radiación es no polarizada y pudiera representarse tal y como
aparece en la figura 2.9a. Por el contrario, si se logra obtener una radiación
donde el vector intensidad de campo vibre en una sola dirección, se dice que la
radiación está polarizada en un plano (figura 2.9b)
Figura 2.9. (a) Una onda transversal no polarizada que se mueve hacia el lector, vista como una
superposición al azar de muchos trenes de ondas polarizados, (b) Una onda transversal polarizada
→
en un plano. En ambas figuras se muestra solo el vector eléctrico ( E ).
La radiación electromagnética polarizada en un plano se produce en ciertas

fuentes de energía radiante. Por ejemplo, tanto las ondas de radio procedentes
de una antena como las microondas producidas por un tubo klistrón están
polarizadas en un plano. También está polarizada la radiación visible y
ultravioleta procedente de la relajación de un único átomo o molécula excitados,
pero el haz de este tipo de fuente no presenta una polarización neta, ya que está
constituido por una multitud de trenes de ondas individuales originados por un
número enorme de procesos atómicos o moleculares individuales. El plano de
polarización de estas ondas individuales es aleatorio, por lo que se anulan sus
polarizaciones individuales.
La radiación polarizada ultravioleta y visible se produce por el paso de radiación
a través de medios que absorben, reflejan o refractan de forma selectiva la
radiación que vibra en un solo plano.
Ahora bien, existen dispositivos comerciales, como las láminas polarizadoras y
los prismas de Nicol que tienen la función de producir radiación linealmente
polarizada.
En la figura 2.10 se muestra la radiación no polarizada que llega a una lámina
polarizadora, en la cual existe una cierta dirección característica de polarización,
que se muestra con las líneas paralelas. La lámina permite únicamente el paso
de aquellos componentes de la onda electromagnética cuyos vectores eléctricos (
→
E ) vibren paralelamente a esta dirección y absorben todas aquellas que vibran
perpendicularmente. Como resultado, la luz que sale del dispositivo está
→
linealmente polarizada en un plano ya que el vector eléctrico ( E ) vibra en un
solo plano, perpendicular a la dirección de propagación.
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Figura 2.10. Una lámina polarizadora transforma la luz no polarizada

en luz polarizada en un plano.
Existen sustancias capaces de desviar el plano de la luz linealmente polarizada y

se han elaborado métodos de análisis para su identificación y cuantificación
basados en este principio. Estos métodos son conocidos como métodos
polarimétricos o polarimetría y serán tratados con profundidad en el capítulo 7.
2.4. CLASIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS ÓPTICOS

Los métodos ópticos se clasifican en función de la naturaleza de la interacción de
la radiación electromagnética con la materia.
La tabla 2.3 muestra un resumen de los métodos que serán tratados en este
texto.
Tabla 2.3. Algunos métodos ópticos de amplio uso en la actualidad
Especie Región del

Proceso Método
analizada espectro
Espectrometría de
Moléculas UV-visible
absorción molecular
Absorción de radiación
Espectrometría de
Átomos UV-visible
absorción atómica
Fluorometría Moléculas UV-visible
Emisión de radiación
Emisión atómica Átomos UV-visible
Refracción de radiación Refractometría Moléculas UV-visible
Polarización de radiación Polarimetría Moléculas UV-visible
BIBLIOGRAFÍA
1. Bermejo, R; Moreno, A. (2014). Análisis Instrumental. Editorial Síntesis S. A.
Madrid.

3. Cano, B. (2018). Guía de laboratorio de Análisis Instrumental. Corporación

Universitaria Rafael Núñez.
4. Fernández, L; Rojas, L; Lapo, B. (2015). Desarrollos experimentales en
Análisis Instrumental. Ediciones UTMACH.
London.
7. Rubinson, K & Rubinson, J. (2001). Análisis Instrumental. Pearson Educación
SA. Madrid.
9. Sierra, M; Gómez, S; Morante, S; Pérez, D; Sanchez, A; Gañan, J. (2015).
Análisis Instrumental. Experiencia de Innovación Docente en la URJC. Ed.
Dykinson. Madrid.
11. Skoog, D; Holler, J; Crouch, S. (2008). Principios de análisis instrumental.
6ta ed. Cengage Learning Editores.
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3 Espectrometría de absorción molecular
ultravioleta y visible
Aunque el descubrimiento de la dispersión de la luz por Newton data de 1704 el

desarrollo de las técnicas experimentales en este campo fue muy lento. Sólo más
de un siglo después Fraunhofer creó un sistema óptico, que mediante uso de
prismas y rendija (slit), permitió detectar en el espectro de la luz solar las líneas
de absorción que llevan su nombre. El conocimiento de que cada elemento
químico posee un espectro de emisión de líneas característica se debe a Bunsen
y Kirchhoff (1859), que pueden considerarse los fundadores del análisis espectral
y los primeros que construyeron un equipo capaz de ser utilizado prácticamente.
Mientras que la Espectroscopia de Emisión Atómica poseía ya a fines del siglo XIX
aplicaciones prácticas, en especial para la determinación de metales en
minerales, la Espectroscopia de Absorción Molecular en las regiones Ultravioleta
y Visible sólo alcanzó desarrollo a partir de los años 30 del siglo XX. El desarrollo
de sistemas de detección fotoeléctrica permitió en los años 40 la sustitución de
los equipos de detección fotográfica, poco eficientes, y la generalización de esta
técnica espectroscópica.
3.1. REGIONES DEL ESPECTRO ULTRAVIOLETA-VISIBLE.

La región del espectro electromagnético que corresponde a las transiciones que
involucran a electrones de la capa de valencia se extiende por longitudes de onda
de 100 a 800 nm (regiones ultravioleta y visible), aunque no toda esta zona es
de igual utilidad para la elucidación de estructuras orgánicas. La región UV-
visible puede dividirse en tres zonas fundamentales:
Ultravioleta lejano: Se ubica desde 1 hasta 200 nm, y presenta características
que hacen complicada su utilización:
• En esta zona absorben las moléculas componentes del aire, lo que hace
imprescindible trabajar con equipos evacuados (de aquí el nombre alternativo
de la región: Ultravioleta de vacío).
• Los materiales usuales para la construcción de componentes ópticos (celdas,
lentes, elementos dispersivos), el cuarzo y el vidrio, absorben fuertemente en
esta zona. Se requiere trabajar con otros materiales, menos versátiles y más
costosos (LiF, CaF2, zafiro, utilizables hasta 115, 125 y 140 nm
respectivamente).
• Los solventes absorben fuertemente en esta región. Los hidrocarburos
saturados pueden usarse hasta 170 nm, los hidrocarburos perfluorados hasta
150 nm.
• La sensibilidad de los detectores es generalmente baja.
55
3. Espectrometría de absorción molecular ultravioleta y visible
• La absorción en esta zona es poco selectiva pues casi todos los compuestos
presentan absorción en esta región.
Ultravioleta cercano. Comprende la región entre 200 y 400nm, es de gran
utilidad en la determinación estructural de insaturación conjugada, aromaticidad
o de ciertos grupos insaturados con pares electrónicos libres (carbonilo, nitro,
etc.), sin presentar los serios inconvenientes del Ultravioleta de vacío. Se
requieren materiales ópticos de cuarzo si se quiere acceder a la zona de
longitudes de onda inferiores a 350nm, mientras que el vidrio es utilizable en el
resto de la región Ultravioleta cercana y toda la región visible.
Región Visible. Abarca de 400 hasta cerca de 800nm, es la única del espectro
electromagnético detectable por el ojo humano. Las transiciones que se
presentan en esta zona corresponden a transiciones electrónicas de muy baja
energía. Todos los compuestos coloreados absorben selectivamente en esta
región. Los compuestos fuertemente conjugados y ciertos complejos de metales
de transición absorben significativamente en la región.
Ciertas transiciones electrónicas pueden presentarse a longitudes de onda
superiores a 800 nm, pero estas no son comunes en los compuestos orgánicos.
En la figura 3.1 se muestra la región Ultravioleta Visible del espectro
electromagnético, así como sus características.
Figura 3.1. Regiones Ultravioleta y Visible del espectro electromagnético.
3.2. CARACTERÍSTICAS DE LOS ESPECTROS DE ABSORCIÓN EN LA REGIÓN

UV-VISIBLE
Las transiciones electrónicas en moléculas se presentan en forma de bandas,
como ya se vio anteriormente, con modificación simultanea de los niveles de
energía vibracionales y rotacionales. En moléculas pequeñas en fase gaseosa es
posible observar la estructura fina vibracional de las bandas electrónicas con
subestructura rotacional no bien resuelta. En moléculas más complejas la
multiplicidad de los niveles vibracionales hace que el gran número de
transiciones de similar energía produzca bandas de absorción continuas sin
estructura fina vibracional evidente. Esto es también lo usual cuando se registran
los espectros de absorción UV en fases condensadas (soluciones, sólidos).
Las principales características de una banda de absorción en el UV-Visible son: la
posición del máximo, la intensidad y la anchura.
La posición de una banda, dada por la posición del máximo de absorción,
depende de la energía de la transición (relación de Bohr) y se reporta
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usualmente como longitud de onda máxima (max), expresada en nm. El valor de

max expresa la frecuencia de radiación absorbida por un mayor número de
moléculas de la especie absorbente. En los espectros de absorción UV-vis se
presenta como uno o varios máximos en la banda de absorción.
La intensidad de una banda de absorción puede expresarse como la
absortividad molar (o coeficiente de extinción molar) en el valor de max. Esta
intensidad depende del cuadrado del momento dipolo de la transición (cambio en
la distribución de cargas eléctricas durante la transición). Se producen
absorciones intensas cuando una transición es acompañada por un gran cambio
en la distribución de cargas (max del orden de 104), mientras que las transiciones
con pequeño cambio en la distribución de cargas producen débiles bandas de
absorción (max del orden de 102 o inferiores). Dados los valores típicos de las
absortividades molares en el UV, es común trabajar con soluciones de
concentraciones 10-3 a 10-5 mol/L.
La anchura de una banda de absorción electrónica depende del número e
intensidad de los componentes vibracionales de la transición correspondiente. La
distribución de intensidades entre los componentes vibracionales de una
transición electrónica depende de los cambios en la geometría de equilibrio de los
estados base y excitados.
La figura 3.2 muestra el espectro de absorción característico de la vitamina A
Figura 3.2. Espectro de absorción del Retinol
3.3. LEYES QUE RIGEN LA ABSORCIÓN

Cuando un haz de radiación monocromática de potencia P 0 atraviesa una solución
de sustancia contenida en un recipiente, el haz de radiación emergente posee
generalmente menor potencia que el incidente. Esta disminución de potencia se
debe a la descomposición del haz incidente el cual puede experimentar

fenómenos de refracción, reflexión, dispersión y absorción por la solución de
sustancia (figura 3.3)
Figura 3.3. Fenómenos que ocurren cuando un haz de radiación electromagnética incide
sobre una solución de sustancia contenida en un recipiente (P0= Potencia
incidente, PRFL= Potencia reflejada, PRFR= Potencia refractada, PD= Potencia
dispersada, PA= Potencia Absorbida, PT= Potencia transmitida).
Así, la potencia de la radiación incidente P0 puede representarse como la suma

de la potencias de los fenómenos involucrados, según:
P0 = PREFLEJADA + PREFRACTADA + PDISPERSADA + PABSORBIDA + PTRANSMITIDA
Los fenómenos de reflexión y refracción son pequeños en comparación con la
absorción y pueden ser compensados realizando un ensayo en blanco, es decir
haciendo mediciones utilizando un recipiente idéntico que solo contiene el
disolvente de la muestra. Por otra parte, la dispersión se elimina garantizando la
ausencia de partículas dispersas en la solución de muestra.
Bajo estas condiciones, la disminución de la potencia del haz emergente Pt
(PTRANSMITIDA) en relación con el incidente P0, se debe a que la sustancia a
absorbido radiación electromagnética, es decir, como consecuencia de las
interacciones entre los fotones del haz incidente y las partículas absorbentes de
la sustancia, la potencia P0 disminuye a Pt, entonces:
P0 = PABSORBIDA + PTRANSMITIDA
A partir de esta afirmación se pueden definir los siguientes términos:
Transmitancia.
La transmitancia T de una solución es la relación entre la potencia transmitida Pt
y la incidente P0, según:
Pt
T=
P0
Por lo general la transmitancia se expresa como porcentaje y entonces

tendíamos:
Pt
%T = 100
P0
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Obviamente T puede tomar valores entre 0 y 1, y en la medida que se aleje del

valor unitario la absorción de radiación por la sustancia es mayor.
Absorbancia.
La absorbancia (también conocida como densidad óptica o extinción) de una
solución está definida por la ecuación:
P0
A = − log T = log
Pt
Estudios realizados por Lambert (1729) y Bouguer (1760) demostraron la

existencia de una relación directamente proporcional entre la absorbancia y la
longitud del paso óptico que atravesaba la radiación al incidir sobre la solución de
sustancia contenida en un recipiente. Casi un siglo más tarde, Beer y Bernard
(1852) encontraron que la potencia de la radiación monocromática transmitida
(Pt) decrecía con el aumento de la concentración, es decir la absorbancia
aumentaba de forma similar a como lo hacía al aumentar la longitud del paso
óptico.
La combinación de estas investigaciones dio lugar a la ley fundamental de la
absorción, conocida hoy como Ley de Lambert-Beer, que se expresa como:
A=abc
donde
A es la absorbancia de la sustancia y es adimensional.
a es una constante de proporcionalidad llamada absortividad, que expresa la
capacidad o poder de absorción de una sustancia y se expresa en L/cm.g.
b es la trayectoria que recorre el haz incidente dentro de la sustancia, es decir la
longitud del paso óptico y se expresa en centímetros
c es la concentración de la sustancia y se expresa en g/L
Cuando la concentración se expresa en mol/L el término a se denomina
absortividad molar o coeficiente de absorción molar y se representa por el
símbolo  expresándose en unidades de L/cm.mol. La ley de Lambert-Beer
quedaría entonces:
A=bc
que constituye la manera más usual de representarla.
Párrafo aparte merece el término  por la importancia que reviste en los procesos
de absorción molecular. El coeficiente de absorción molar , expresa como ya se
mencionó el poder de absorción de una sustancia y depende, entre otros
factores, de la naturaleza de la sustancia y de la longitud de onda. Ello significa
que un mol de diferentes sustancias absorberá diferentes cantidades de energía
dependiendo de su estructura y habrá para cada sustancia un valor diferente de
, el cual se reporta a la longitud de onda de máxima absorción.
La tabla 3.1 muestra una relación de vitaminas con sus respectivos coeficientes
de extinción mola a la longitud de onda de máxima absorción.
Tabla 3.1. Valores de  max y max de algunas vitaminas
Vitaminas  max (nm)  max (L/cm.mol)

Retinol 325 1 832
Retinal 381 1 530
-caroteno 273 383
453 2 592
481 2 268
Riboflavina 267 850
Cianocobalamina 278 115
361 307
Nótese que el -caroteno exhibe tres máximos de absorción con sus respectivos
coeficientes de extinción molar. Está claro que la determinación de esta vitamina
convendría realizarla a 453 nm por cuanto es a ese valor de  que esta sustancia
exhibe un mayor poder de absorción, por lo tanto a esta longitud de onda habrá
mayor sensibilidad puesto que podrán detectarse menores concentraciones de
esta sustancia.
3.3.1. Desviaciones de la Ley de Lambert-Beer
La ley de Lambert-Beer (A=  b c) posee una enorme importancia para el
análisis cuantitativo pues establece una relación lineal entre la absorbancia y la
concentración de la sustancia que absorbe, sin embargo frecuentemente se
producen desviaciones (figura 3.4) de la proporcionalidad directa entre la
absorbancia y la concentración que es necesario considerar.
Figura 3.4. Cumplimiento y desviaciones de la ley de Lambert-Beer.

(1) cumplimiento de la ley, (2) desviación positiva, (3) desviación negativa
La ley de Lambert-Beer es solo válida para concentraciones  a 0.01 M. En altas

concentraciones, la distancia entre las especies que causan absorción disminuye
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hasta el punto en que cada una afecta la distribución de carga de sus vecinas lo
que puede afectar su capacidad de absorber radiación a una  dada. Puesto que
el grado de interacción depende de la concentración, esto causa desviaciones en
la relación lineal entre absorbancia y concentración.
Un segundo requisito para el cumplimiento de esta ley, y que de no verificarse
representa la desviación instrumental más importante, es que la radiación
utilizada tiene que ser monocromática. Esta observación constituye una
manifestación del carácter límite de la ley de Lambert-Beer dado que rara vez se
puede utilizar en forma práctica una radiación estrictamente de una sola longitud
de onda, pues los dispositivos (monocromadores) que permiten aislar porciones
de la radiación de salida de una fuente continua usualmente también dejan pasar
una pequeña fracción de radiación contaminante de otras longitudes de onda.
Para que una radiación se considere adecuada para el cumplimiento de la ley, la
∆ de la radiación que sale del monocromador debe ser sensiblemente menor que
la anchura de las bandas de absorción de la sustancia en estudio.
Existen también desviaciones químicas que se producen como consecuencia de
asociación, disociación o reacción de la sustancia con el disolvente y provocan
cambios en los equilibrios químicos con la consecuente aparición de especies
absorbentes a distintas longitudes de onda.
Otras fuentes de errores instrumentales menos frecuentes son la fatiga de la
fotocelda, las fluctuaciones de las fuentes de radiación y la inestabilidad del
voltaje entre otros muchos factores agrupados dentro de los errores
instrumentales.
3.4. ESPECIES ABSORBENTES

La absorción de radiación ultravioleta y visible por una especie M puede
considerarse como un proceso de excitación indicado por la ecuación:
M + h → M*
donde M* representa la partícula atómica o molecular en su estado electrónico
excitado que se produce como resultado de la absorción del fotón h. Este estado
excitado tiene un tiempo de existencia muy breve (10 -8 a 10-9 segundos) y
desaparece a través de un proceso de relajación que usualmente involucra la
conversión de la energía de excitación en calor, aunque también puede existir
relajación para formar nuevas especies químicas (reacción fotoquímica) y en
menor cuantía puede producirse la emisión de radiación fluorescente y
fosforescente.
Ahora bien, resulta importante analizar cuáles son las transiciones electrónicas
más importantes que se producen por absorción de radiación electromagnética
de las zonas del UV y el visible, por cuanto ello permitirá inferir que sustancias,
en función de su estructura, son capaces de absorber y por tanto ser analizadas
por espectrometría UV-visible.

Las especies químicas absorbentes en la región del UV-Vis pueden clasificarse en

dos grupos: especies absorbentes con electrones ,  y n y especies absorbentes
que manifiestan transiciones por transferencia de carga.
3.4.1. Especies químicas absorbentes que contienen electrones ,  y n.
Las especies químicas de este grupo comprenden tanto moléculas orgánicas
como inorgánicas.
Todos los compuestos orgánicos pueden absorber radiación electromagnética
porque todos contienen electrones de valencia que pueden ser excitados a
niveles de energía más altos, sin embargo, no todos los compuestos orgánicos
pueden ser analizados por espectrometría UV-visible por cuanto la absorción en
la zona del UV lejano o de vacío, presenta los inconvenientes mencionados con
anterioridad lo que limita considerablemente su aplicación práctica.
Los electrones que contribuyen a las características de absorción de una
molécula orgánica son: 1) los electrones que participan directamente en la
formación de enlaces entre átomos (electrones  y ) y se asocian con más de un
átomo y 2) los electrones exteriores no enlazados o no compartidos (electrones
n) situados principalmente en átomos como oxígeno, halógenos, azufre y
nitrógeno.
Recordemos algunos elementos básicos de química general que ayudaran a
entender el proceso de absorción de estas especies.
En una molécula orgánica, los campos no localizados entre átomos ocupados por
electrones de enlace se llaman orbitales moleculares y pueden considerarse
como resultado de la superposición de orbitales atómicos. Cuando se combinan
dos orbitales atómicos, resulta un orbital molecular de enlace de baja energía o
un orbital molecular antienlace de alta energía. En el estado base o fundamental
de una molécula, los electrones ocupan el primero.
Los orbitales moleculares asociados con los simples enlaces de las moléculas
orgánicas se denominan orbitales sigmas () y los electrones correspondientes
son electrones . El doble enlace en las moléculas orgánicas contiene dos tipos
de orbitales moleculares: un orbital sigma () correspondiente a uno de los pares
de electrones del enlace, y un orbital molecular pi () asociado con el otro.
Además de los electrones  y  muchas moléculas orgánicas contienen electrones
que no forman enlaces. Estos electrones no compartidos se conocen como
electrones n. en la figura 3.5 Se muestra un ejemplo en el que pueden verse los
tres tipos de electrones en una molécula orgánica simple.
Por absorción de radiación electromagnética de las zonas UV-vis, se producen
transiciones de los electrones desde un orbital de enlace a un orbital antienlace
excitado. Las transiciones energéticas asociadas a estos orbitales y responsables
de la absorción, pueden ser de cuatro tipos fundamentales:  → *, n → *, n →
* y  → *.
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Figura3.5. Dos maneras de representar los diferentes tipos de electrones

en la molécula de formaldehido
Las energías necesarias para producir estas transiciones electrónicas de los

distintos tipos de orbitales moleculares difieren considerablemente. En la figura
3.6 se observa que las transiciones electrónicas de los orbitales  requieren
mayor energía que la de lo orbitales  y que los electrones n son los de menor
requerimiento energético para la excitación.
Figura 3.6. Niveles electrónicos de energía molecular.
Transiciones  → *. En este caso un electrón de un orbital de enlace  de una

molécula es excitado por absorción de radiación al correspondiente orbital
antienlace *. Se describe entonces que la molécula ha experimentado una
transición  → *. Con relación a las otras transiciones posibles. La energía
requerida para inducir una transición  → * es muy grande y corresponde a las
frecuencias de la zona del ultravioleta lejano o del vacío, por lo que desde el
punto de vista de sus aplicaciones analíticas no presenta utilidad.
Transiciones n → *. Los compuestos saturados que contienen átomos con
pares de electrones no compartidos (electrones sin enlace) pueden presentar
este tipo de transición. Generalmente estas transiciones requieren menos
energía que las del tipo  → * y pueden provocarse por radiaciones de la zona
entre 150 y 250 nm y el mayor número de picos de absorción aparecen por
debajo de los 200 nm. Las absortividades molares () asociadas con este tipo de
transición son intermedias en magnitud y varían de 100 a 3000 L/cm.mol. El
número de grupos funcionales orgánicos con transiciones n → * en la región
ultravioleta fácilmente accesible es relativamente pequeño, por lo que puede

afirmarse que esta transición es de las menos importantes en cuanto a su
ocurrencia por absorción de radiación.
Transiciones n → * y  → *. La mayoría de las aplicaciones de la
espectrometría de absorción UV-vis en compuestos orgánicos se basan en
transiciones de electrones n o electrones  al estado excitado *, porque las
energías requeridas para estos procesos producen bandas de absorción en una
zona espectral experimentalmente conveniente (200 a 700 nm). De ahí que
puede plantearse que constituyen las transiciones más importantes en la
espectrometría UV-vis.
Las absortividades molares para los picos relacionados con la excitación n → *
son por lo general bajas y suelen caer dentro del intervalo de 10 a 100
L/cm.mol; en cambio los valores para las transiciones  → *, caen normalmente
dentro del intervalo de 1000 a 10 000. Otra diferencia característica entre los dos
picos de absorción se halla en el efecto del disolvente sobre la longitud de onda.
Los picos que proceden de transiciones n → * son desplazados generalmente a
longitudes de onda más cortas al aumentar la polaridad del disolvente, lo que se
conoce como efecto hipsocrómico. Este proceso es resultado de la mayor
solvatación del par de electrones no enlazados, que reduce la energía del orbital
n, provocando que se requiera una mayor energía para alcanzar el estado
excitado *. Generalmente, pero no siempre, se observa una tendencia inversa
(efecto batocrómico) para transiciones  → *.
De cualquier modo, para que se produzca cualquiera de estas dos transiciones se
requiere la presencia en la molécula de al menos un grupo funcional insaturado
que proporcione los orbitales . A estos grupos funcionales insaturados capaces
de experimentar transiciones n → * y  → * (y principales responsables de la
absorción de radiación UV-vis) se les denomina grupos cromóforos.
En la tabla 3.2 Se muestran algunos cromóforos orgánicos comunes y la
localización aproximada de sus máximos de absorción. Los datos de localización
(max) e intensidad () de los picos pueden servir solamente como guía
aproximada para la identificación de grupos funcionales, porque la posición de los
máximos es afectada tanto por el disolvente como por los detalles estructurales.
Por otra parte, los picos suelen ser anchos debido a los efectos vibratorios, lo que
dificulta aún más la determinación precisa de la posición de los máximos.
Del análisis de esta tabla se desprende también el marcado efecto que tiene la
conjugación sobre las bandas de absorción. Nótese que en la medida en que
aumenta la conjugación las bandas de absorción se desplazan hacia longitudes
de ondas mayores, es decir que se requiere menor energía para provocar la
transición  → *. Ello se debe a que el fenómeno de conjugación conduce a un
desplazamiento de los electrones  cuyos orbitales comprenden ahora cuatro
centros atómicos o más (nube ), produciendo una reducción de los niveles de
energía del orbital *, dándole menos carácter de antienlace y disminuyendo la
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cantidad de energía necesaria para causar la excitación. Obsérvese además los

elevados valores de absortividad molar característicos en estos compuestos lo
que favorece su análisis por espectrometría UV-vis.
Tabla 3.2. Características de absorción de algunos cromóforos
Cromóforo Disolvente max  Transición
n Heptano 180 13 000  − *
178 10 000
n Hexano 196 2 000  − *
225 160
186 1 000 n −*

n Heptano
280 16 n − *
Etanol 204 41 n − *
Etanol 300 − 400  8 000 n − *
Éter etílico  300 100 n − *
Sistemas conjugados
Hexano 220 20 900  − *
Etanol 300 64 000  − *
Etanol 328 51 000  − *
217 16 000
Etanol  − *
321 20
204 7 900
Etanol  − *
256 200
207 7 000
-  − *
261 300
211 6 200
-  − *
270 1 450

Cromóforo Disolvente max  Transición
230 8 600
-
280 1 430
220 11 000
Etanol 275 5 600  − *
214 320
Párrafo aparte debe dedicarse al caso de los hidrocarburos aromáticos, cuyos

espectros UV se caracterizan por varias bandas de absorción originadas por
transiciones  → *. En la tabla 3.2 se observa que las bandas características del
benceno son afectadas por los sustituyentes del anillo. Nótese que la
incorporación del grupo OH (en el caso del fenol) y el grupo NH 2 (en la anilina)
producen un desplazamiento de los máximos de absorción con respecto al
benceno hacia longitudes de ondas más largas de menor energía (efecto
batocrómico) con un incremento de su intensidad, particularmente de la segunda
banda. Esto sucede por la presencia en estos sustituyentes de al menos un par
de electrones n, capaces de interaccionar con los electrones  del anillo
estabilizando el estado * con la consecuente reducción de su energía. Estos
grupos funcionales que no absorben radiación UV-vis por si mismos, pero que
unidos a un cromóforo tienen la capacidad de desplazar sus máximos de
absorción hacia longitud de ondas mayores se denominan grupos auxocromos.
La figura 3.7 muestra el efecto explicado para el caso de los espectros de
absorción de la tirosina y la fenilalanina
Figura 3.7. Desplazamiento de las longitudes de onda máximas por efecto de la sustitución de un
grupo OH. Nótese que las estructuras de la Tirosina y la Fenilalanina son casi idénticas. El grupo OH de la
Tirosina provoca un efecto batocrómico del espectro hacia valores mayores de longitudes de onda con respecto
a la Fenilalanina.
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Finalmente debe señalarse que dentro de las especies absorbentes se encuentran

también aniones inorgánicos que presentan picos de absorción en el ultravioleta
como consecuencia de transiciones n → *. Como ejemplo pueden mencionarse
el nitrato (313 nm), el nitrito (360 y 280 nm), el carbonato (217 nm) y el
tritiocarbonato (500 nm) (figura 3.8)
Figura 3.8. Especies absorbentes inorgánicas con transiciones n → *
3.4.2. Absorción por transferencia de carga

Para fines analíticos el tipo más importante de absorción por especies inorgánicas
es la absorción por transferencia de carga, porque las absortividades molares se
los picos son muy grandes (max  10 000). En consecuencia, estos complejos
constituyen un medio muy sensible para detectar y cuantificar las especies
absorbentes correspondientes. Muchos complejos inorgánicos exhiben este tipo
de absorción y por consiguiente se denominan complejos de transferencia de
carga.
Ejemplos comunes son el tiocianato y los complejos fenólicos de hierro (III), el
complejo ortofenantrolina de hierro (II), el complejo del yodo molecular con el
yoduro y el complejo ferro-ferricianuro.
Para que un complejo exhiba un espectro por transferencia de carga es necesario
que uno de sus componentes tenga características de donador de electrones y el
otro, propiedades de aceptor de electrones. La absorción de radiación supone
entonces la transición de un electrón del donador a un orbital asociado en gran
parte con el aceptor. Como consecuencia, el estado excitado es el producto de un
proceso interno de oxidación-reducción.
Un ejemplo muy conocido de absorción por transferencia de carga se observa en
el complejo hierro (III)-ion tiocianato. La absorción de radiación provoca la
transición de un electrón del tiocianato a un orbital asociado en gran parte con el
hierro (III). El producto es así una especie excitada que comprende
predominantemente hierro (II) y el radical tiocianato SCN.
Al aumentar la tendencia a la transferencia de electrones, se requiere menos
energía radiante para el proceso de transferencia de carga y los complejos
resultantes absorben a longitudes de ondas más largas. Por ejemplo, el ion
tiocianato es mejor donador de electrones (agente reductor) que el ion cloruro;
así, la absorción del complejo de tiocianato con hierro (III) se realiza en la región
del visible mientras que el máximo de absorción del complejo cloruro-hierro (III)
se presenta en la región ultravioleta.

En la mayoría de los complejos de transferencia de carga en que interviene el ión
metálico, el metal actúa como aceptor de electrones, sin embargo existen
excepciones como en el caso del complejo de la ortofenantrolina con hierro (II) o
con cobre (I) en los que el ligando es el aceptor y el metal es el donador.
3.5. INSTRUMENTOS DE MEDICIÓN

Los instrumentos empleados en espectrometría de absorción molecular UV-
visible miden las señales analíticas de absorbancia y transmitancia y se pueden
clasificar en dos tipos principales:
• Colorímetro o fotocolorímetro. Realizan las mediciones en la zona del visible
(400-800 nm). Se utilizan en el análisis de sustancias coloreadas.
• Espectrofotómetro: Realiza mediciones en diferentes regiones del espectro en
función del rango de longitudes de onda para las cuales han sido diseñados.
La gran ventaja de los espectrofotómetros es que permiten obtener los
espectros de absorción, sometiendo a la sustancia en estudio a un barrido
selectivo de diferentes longitudes de onda. En la actualidad es usual encontrar
espectrofotómetros UV-visible capaces de realizar mediciones de absorbancia
y transmitancia en rangos de 190 a 1000 nm.
Con independencia de su diseño de las particularidades de su diseño
constructivo, estos equipos contienen cinco componentes básicos:
1. Fuente de radiación, encargada de proporcionar la radiación incidente
policromática de potencia P0.
2. Selector de longitud de onda, cuya función es convertir la radiación
policromática emitida por la fuente en radiación monocromática de una sola
longitud de onda.
3. Cubetas, que constituyen recipientes transparentes que contienen la muestra
en disolución, la cual llega radiación monocromática de potencia P0. Una parte
de esta radiación es absorbida por la muestra (en función de su
concentración) y otra es transmitida (Pt).
4. Detector, el convierte la radiación transmitida P t, en una señal eléctrica
medible.
5. Registrador y procesador de datos, cuya función es registrar la señal en forma
de absorbancia o transmitancia. En la actualidad el registrador es un sistema
de cómputo capaz de procesar estas señales para obtener espectros y realizar
análisis cuantitativo.
La figura 3.9, muestra de forma esquemática la disposición de estos
componentes y los procesos que tienen lugar.
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Figura 3.9. Componentes básicos de los instrumentos para medir absorción de radiación.
Las características de cada uno de estos componentes se expondrán brevemente

a continuación.
3.5.1. Fuentes de radiación
Una fuente adecuada para estudios espectroscópicos debe cumplir los siguientes
requisitos:
1. Producir un haz de radiación cuya potencia P 0 sea suficiente para facilitar la
detección y medición de la señal analítica.
2. La radiación emitida debe ser continua, es decir policromática, contentiva de
todas las longitudes de onda correspondientes a la región del espectro en que
va a realizarse la medición.
3. La potencia P0 de la radiación emitida debe ser estable.
En espectrometría de absorción molecular UV-visible se emplean dos tipos de
fuentes principales en función de la región del espectro en que se requiera
trabajar.
Lámparas de Hidrógeno o Deuterio. Producen un espectro continuo en la región
del UV (160 – 375 nm) por excitación del hidrógeno o el deuterio a baja presión
con una descarga eléctrica. En la actualidad se emplean con mayor frecuencia las
lámparas de Deuterio pues cubren el mismo intervalo de longitudes de onda que
las lámparas de hidrógeno y tienen la ventaja de aportar el triple de potencia.
Otro elemento importante relacionado con las fuentes de radiación UV es que el
material de construcción debe ser el cuarzo pues el vidrio muestra una fuerte
absorción en esta zona del espectro.

Lámpara de Wolframio. Conocida comúnmente como lámpara de filamento de

tungsteno, constituye la fuente más común de radiación visible e infrarrojo
cercano. Es útil en un rango de longitudes de onda entre 320 y 2500 nm.
Los espectrofotómetros UV-visibles actuales poseen las dos lámparas (Deuterio y
Wolframio) que cambian automáticamente en función de la longitud de onda
seleccionada. Estos instrumentos cubren un rango útil de trabajo entre 190 y
1100 nm.
3.5.2. Selector de longitud de onda
Tienen la función de aislar una radiación de una sola longitud de onda, la cual
llegará al recipiente con la muestra. La radiación que llega a la muestra debe ser
monocromática debido a que:
• Aumenta la probabilidad de que el sistema absorbente cumpla con la ley de
Lambert-Beer.
• Se garantiza una mayor selectividad ya que otras sustancias presentes en la
muestra que absorban a otras longitudes de onda no deben interferir.
• Aumenta la sensibilidad del método debido a que las lecturas se realizan a la
max, en la que la especie muestra su mayor capacidad de absorción.
Debe señalarse que hasta hoy no existe ningún dispositivo capaz de aislar una
radiación de una única longitud de onda, sino que además de la banda
seleccionada dejan pasar una cierta cantidad de radiación contaminante de otras
longitudes de onda. Al intervalo de longitudes de onda que pasa a través de un
selector de  se le llama ancho de banda. Obviamente en la medida que el ancho
de banda sea menor, será menor también la radiación contaminante y
consecuentemente el selector será más eficiente.
Son numerosos los dispositivos que se emplean con el fin de producir bandas
limitadas de radiación. Los más importantes son los filtros y los
monocromadores.
A. Filtros
Son los más sencillos y menos costosos. Pueden ser de dos tipos: de absorción y
de interferencia.
Filtros de absorción. Consisten generalmente en placas de vidrio coloreado que
absorben ciertas porciones de los espectros limitando su paso a través de ellos.
Pueden utilizarse exclusivamente en la región del visible y poseen anchos de
banda efectivos entre  30 y  50 nm.
Filtros de interferencia. Se basan en la interferencia óptica para producir bandas
relativamente estrechas de radiación. Consiste en un dieléctrico transparente
(frecuentemente fluoruro de calcio o fluoruro de magnesio) que ocupa el espacio
comprendido entre dos películas metálicas semitransparentes revestidas en sus
superficies interiores con dos placas de vidrio. El espesor de la capa dieléctrica se
controla cuidadosamente y determina la longitud de onda de la radiación
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transmitida. Los filtros de interferencia proporcionan anchos de banda

considerablemente menores que los filtros de absorción (alrededor de  10 nm) y
pueden usarse tanto en el visible como en el UV.
B. Monocromadores.
Un monocromador es un dispositivo que descompone la radiación policromática
en sus longitudes de onda componentes y permite separar una banda del
espectro, generalmente más estrecha que la que proporciona un filtro. En
general un monocromador está integrado por un sistema de ranuras y lentes y
un elemento dispersante que puede ser un prisma o una rejilla de difracción.
El funcionamiento general de estos dispositivos se ilustra en la figura 3.10.
Figura 3.10. Esquema general de un monocromador. La radiación penetra por una ranura de
entrada, es colimada por un lente que produce haces de radiación paralela, los cuales llegan al
dispositivo dispersante y son dispersados por refracción (prismas) o difracción (rejillas). Los haces
de radiación monocromática son enfocados luego enfocados hacia la ranura de salida. Haciendo
girar el dispositivo dispersante, se logra que la radiación de la longitud de onda deseada atraviese
la ranura de salida.
Las ranuras de un monocromador desempeñan un papel importante en la calidad

de estos, pues cuanto más estrecha sea la ranura de salida de la radiación (luego
de que la mayoría de la radiación incidente policromática ha sido dispersada por
el prisma o la rejilla) y mayor la distancia del prisma o la rejilla, menor será el
ancho de banda y por tanto de mayor calidad será el monocromador.
Los monocromadores actuales contienen por lo general dos elementos
dispersantes, es decir dos prismas, dos rejillas o un prisma y una rejilla y poseen
una gran resolución espectral con anchos de banda de  1 nm.
3.5.3. Recipientes para la muestra
Las celdas o cubetas para la muestra deben estar construidas de un material que
permita el paso de la radiación de la región espectral que interesa. Para el
trabajo en las regiones del UV-visible se emplean dos tipos de cubetas
fundamentales:
• Cubetas de vidrio, las cuales se emplean únicamente para realizar mediciones
en la región del visible. No es posible emplearlas para trabajos en el

ultravioleta debido a que el vidrio absorbe radiación UV por debajo de 350

nm.
• Cubetas de cuarzo, empleadas tanto para lecturas en el UV como en el visible
por cuanto este material no absorbe radiación en ninguna de las dos regiones.
Las mejores celdas poseen ventanas perfectamente perpendiculares al haz de
radiación para reducir al mínimo las pérdidas por reflexión. La longitud del paso
óptico (ancho de la cubeta) más común para el trabajo en las regiones UV-vis, es
1 cm, aunque comercialmente se pueden obtener de otras dimensiones.
La calidad de los datos de absorbancia depende en gran medida de la forma en
que se manipulan y mantienen las cubetas. Las huellas dactilares, la grasa y
otros depósitos sobre la pared de la cubeta alteran notablemente sus
características de transmisión, por lo que resulta imperativa la limpieza antes y
después de su uso.
3.5.4. Detectores
El principio general de funcionamiento de un detector UV-vis consiste en su
capacidad para convertir la energía radiante en corriente eléctrica. Los requisitos
que debe cumplir un detector UV-vis son los siguientes:
• Respuesta rápida a la energía radiante de un amplio intervalo de longitudes
de onda.
• Sensibilidad a bajos niveles de potencia radiante.
• Producir una señal eléctrica que pueda ser fácilmente amplificada y medida.
• Tener un nivel de ruido relativamente bajo.
• La señal producida debe ser directamente proporcional a la potencia del haz
de radiación incidente.
Todos los detectores empleados en espectrometría UV-vis se fundamentan en el
efecto fotoeléctrico, consistente en la interacción de la radiación
electromagnética con una superficie reactiva que produce electrones
(fotoemisión) o promueve electrones a estados energéticos en los que pueden
conducir la electricidad (fotoconducción).
Los detectores fotoeléctricos pueden ser de varios tipos:
• Celdas fotovoltaicas, en las cuales la energía radiante genera una corriente
en la interfase entre una capa semiconductora y un metal.
• Fototubos, en los que la radiación produce emisión de electrones a partir de
una superficie sólida fotosensible.
• Tubos fotomultiplicadores, que contienen una superficie fotoemisora así como
varias superficies adicionales que emiten electrones en cascada cuando son
alcanzadas por los electrones de la región fotosensible.
En general los espectrofotómetros actuales poseen un sistema de barrido
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conocido como arreglo de diodos, que acopla el movimiento del elemento

dispersivo (prisma o rejillas) en el monocromador, y por lo tanto la longitud de
onda de la radiación analizada, con la salida del detector, que corresponde a la
absorción selectiva de la muestra a dicha radiación. El registro del espectro se
realiza de forma automática.
3.5.5. Registro y procesamiento de datos
El procesador de señal es por lo general un dispositivo electrónico que amplifica
la señal eléctrica generada por el detector y registra el valor de absorbancia y/o
transmitancia. Puede además modificar la señal transformándola de continua a
alterna y viceversa, así como también cambiar su fase. En la actualidad el
registro de la señal de absorbancia y la transmitancia se acopla a sistemas
computarizados que con ayuda de potentes softwares almacenan la información,
realizan cálculos cuantitativos y poseen enormes bases de datos de espectros
(también llamadas espectrotecas) de diferentes sustancias, que permiten
realizar comparaciones casi instantáneas con fines cualitativos.
La figura 3.11 muestra un modelo actual con algunas de sus especificaciones.
Rango de  190 – 1100 nm

Anchura de ranura 1 nm
Precisión de  <± 0.5 nm
Reproducibilidad de  <± 0.02 nm
Precisión fotométrica <± 0.01 A
Ruido < 0.0002 A
Estabilidad fotométrica < 0.001 A/h
Detector Arreglo de diodos
Tiempo de barrido 1.2 segundos
Figura 3.11. Espectrofotómetro UV-visible de la firma Agilent Technologies, 2006.
3.6. APLICACIONES CUALITATIVAS DE LA ESPECTROMETRÍA DE

ABSORCIÓN UV-VISIBLE
La identificación de un compuesto puro por espectrometría de absorción

molecular UV-visible se realiza teniendo en cuenta las características del espectro
de absorción (máximos, mínimos y puntos de inflexión). La manera más fiel de
realizar este procedimiento es mediante la comparación del espectro de
absorción de la muestra desconocida con el espectro obtenido para un patrón de
referencia conocido. Una estrecha semejanza entre ambos espectros constituye
un acercamiento importante a la identidad de la muestra.
La comparación del espectro de la muestra puede realizarse contra espectros

reportados en la literatura o almacenados en bases de datos computarizadas,

pero este procedimiento presenta el inconveniente de no reproducir exactamente
las condiciones experimentales (disolvente, pH, temperatura, etc) en que se
obtienen ambos espectros. Lo más aconsejable es por lo tanto obtener
experimentalmente bajo idénticas condiciones los espectros de la muestra y el
patrón de referencia a fin de hacer más exacta la comparación.
Ahora bien, la utilización de la espectrometría UV-visible en el análisis cualitativo
es limitada porque los espectros están formados por bandas anchas que carecen
de detalle y la información que brindan está relacionada solo con la presencia de
ciertos grupos funcionales (cromóforos) capaces de absorber, pero no con el
resto de la estructura. Los máximos de absorción electrónica de muchos
cromóforos no se afectan apreciablemente por las características estructurales de
los grupos no absorbentes que conforman la estructura molecular; como
consecuencia, dos sustancias de estructura diferente con iguales cromóforos
brindarán espectros de absorción muy semejantes.
No obstante, los espectros de absorción UV-visible son útiles para descubrir la
presencia de ciertos grupos funcionales que actúan como cromóforos. Por
ejemplo, una débil banda de absorción en la región de los 280 a 290 nm que se
desplaza a longitudes de onda más cortas con el aumento de la polaridad del
solvente, es una fuerte indicación de la presencia del grupo carbonilo; así mismo,
una débil banda en 260 nm con indicaciones de estructura fina vibratoria
constituye una prueba de la presencia de un anillo aromático.
La existencia de técnicas analíticas de mayor poder de identificación como la
espectroscopia infrarroja (IR), la espectrometría de masas (EM) y la
espectroscopia de resonancia magnético nuclear (RMN), unido a las limitaciones
de la espectrometría UV-visible ya señaladas, han conducido a que la aplicación
de esta última en el análisis cualitativo se realice casi únicamente con fines
corroborativos, es decir cuando se posee una fuerte sospecha de la presencia de
una determinada sustancia en una matriz dada.
Finalmente debe señalarse que para la obtención de los espectros de absorción
debe realizarse una cuidadosa preparación de la muestra que garantice el
aislamiento del compuesto a analizar, sin la presencia de otras especies
absorbentes que obviamente conducirían a alteraciones del espectro obtenido.
3.7. APLICACIONES CUANTITATIVAS DE LA ESPECTROMETRÍA UV-VISIBLE

La espectrometría de absorción molécula UV-visible, constituye una poderosa
herramienta para e análisis cuantitativo. Las características más importantes de
estos métodos pueden resumirse en las siguientes:
• Gran aplicación. Una gran variedad de especies orgánicas e inorgánicas
absorben en las longitudes de onda de las regiones ultravioleta y visible, y por
ello son susceptibles a su cuantificación. Por otra parte, muchas especies no
absorbentes pueden ser analizadas después de ser sometidas a
40d78409-8f5a-44ad-af96-811f110af4ad
transformaciones químicas para convertirlas en especies absorbentes.

• Alta sensibilidad. Las absortividades molares () de 10 000 a 40 000 son
comunes, particularmente para los complejos de transferencia de carga de las
especies inorgánicas. En consecuencia, es posible el análisis de
concentraciones en el intervalo de 10-4 10-5 mol/L.
• Adecuada selectividad. Es posible encontrar regiones de longitud de onda en
las que el único componente absorbente de una muestra sea la sustancia que
se determina.
• Alta precisión. Los espectrofotómetros actuales poseen una elevada precisión
y reproducibilidad. El error relativo de las mediciones de concentración se
encuentra entre 1 y 2 %.
• Facilidad y comodidad. Las mediciones espectrofotométricas se realizan con
rapidez empleando equipamientos instrumentales de fácil empleo y
manipulación.
3.7.1. Establecimiento de las condiciones de trabajo.
Los primeros pasos en una determinación espectrofotométrica están relacionados
con el establecimiento de ciertas condiciones de trabajo que garanticen el éxito
de la cuantificación.
3.7.1.1. Elección de la longitud de onda de trabajo
En el análisis cuantitativo la medición de la absorbancia se realiza generalmente
a la longitud de onda de máxima absorción (max) o a un valor muy cercano a
esta, por cuanto a este valor hay una mayor sensibilidad debido a que el cambio
de la absorbancia por unidad de concentración es también mayor.
Por otra parte, en el valor de max hay una menor variabilidad de los valores de
absorbancia cuando se producen variaciones en la longitud de onda, por lo que
se incrementa la precisión del método (figura 3.12).
Figura 3.12. Influencia de la

variación de la longitud de onda
sobre la medición de absorbancia.
Nótese que idéntica variación en la
longitud de onda (∆1=∆2),
sombreadas en gris, produce una
variación apreciablemente mayor en la
lectura de absorbancia (∆Abs1) cuando
la medición se realiza a una 290 nm,
alejada del máximo de absorción (325
nm) en el cual la variación de
absorbancia es despreciable (∆Abs2).

3.7.1.2. Reacciones de derivatización a considerar

En espectrometría de absorción molecular UV-visible, es común someter la
sustancia que se desea cuantificar a reacciones químicas con el objetivo de
transformarla en un derivado (generalmente un complejo coloreado) con mejores
propiedades de absorción. La reacción general que tiene lugar es:
Compuesto nativo + Reactivo derivatizador → Derivado (complejo coloreado)
Las razones para acometer este proceso pueden resumirse en los siguientes
aspectos:
• El compuesto en su estado nativo no absorbe en las zonas del UV-visible. Por
ejemplo, los azúcares no poseen grupos cromóforos y pueden hacerse
reaccionar con el reactivo de antrona-ácido sulfúrico produciendo un complejo
rojizo que cuya absorbancia se mide a 630 nm.
• El compuesto de interés absorbe en la zona del UV, pero el derivado
coloreado posee una absortividad molar varios órdenes mayores a la del
compuesto en su estado nativo, por lo que la derivatización aumenta
significativamente la sensibilidad del método. Un clásico ejemplo lo constituye
la determinación de proteínas. Todas las proteínas presentan un máximo de
absorción en el UV alrededor de los 280 nm, por lo que pudieran ser
cuantificadas en esta zona del espectro, sin embargo, se prefiere hacerlas
reaccionar con el reactivo de Lowry y formar un derivado coloreado que se
mide en el visible con una absortividad molar superior.
• En la mayoría de las muestras los compuestos a determinar están formando
parte de una matriz compleja, conjuntamente con otras especies absorbentes
que pudieran interferir en el análisis. En este caso la conversión de la
sustancia de interés en un derivado coloreado con diferente estructura
química, que se determina en otra región del espectro, permite su
diferenciación del resto de los componentes de la matriz que absorben a
longitudes de onda similares a las del compuesto de interés, en su estado
nativo.
Por ejemplo, el principio de la determinación de ácido láctico en vinos consiste
en oxidar el ácido a acetaldehído y hacer reaccionar este último con piridina
para formar un complejo violeta que se lee a 570 nm. De haber realizado esta
determinación en el UV, otros ácidos presentes en el vino (cítrico, sórbico,
málico) hubieran interferido en la determinación por cuanto todos tienen el
mismo grupo cromóforo y absorben en un rango de longitudes de onda
similar. De ahí que hubiera sido necesario realizar cuidadosos procedimientos
previos para aislar el ácido láctico del resto de los compuestos interferentes.
Sin embargo, la reacción con piridina para formar el complejo violeta es
específica para el acetaldehído proveniente del ácido láctico y al realizar la
medición en el visible (570 nm) los ácidos cítrico, sórbico y málico ya no
constituyen interferencias.
40d78409-8f5a-44ad-af96-811f110af4ad
Nótese que, en este caso, la derivatización logra aumentar la selectividad del

método y evita la realización de engorrosos tratamientos de preparación de la
muestra para aislar el componente de interés.
En el análisis de los alimentos son numerosos los procedimientos que emplean
reacciones de derivatización para la formación de complejos coloreados que se
miden en el visible. Estos métodos se agrupan bajo el nombre de colorimetría y
los reactivos derivatizadores se denominan reactivos cromogénicos o reactivos
desarrolladores de color.
3.7.1.3. Variables que influyen en la absorbancia
Algunas variables comunes que influyen en el espectro de absorción de una
sustancia, y que por tanto influyen también en la absorbancia, son la naturaleza
del disolvente, el pH de la solución, la temperatura, la concentración elevada de
electrolitos y la presencia de sustancias interferentes. Es necesario conocer los
efectos de estas variables y escoger un conjunto de condiciones analíticas
adecuadas, de tal modo que la absorbancia no sea influida perceptiblemente por
pequeñas variables de magnitud incontroladas.
3.7.1.4. El ensayo en blanco
En todos los métodos ópticos resulta obligatorio calibrar los equipos con una
solución de un blanco, es decir una solución que no contiene la muestra, pero si
los disolventes y el resto de los reactivos utilizados en la medición de la señal
analítica (absorbancia en este caso) en la muestra.
Así por ejemplo si la muestra fue sometida a una reacción de derivatización, la
solución del blanco contiene idéntica cantidad del reactivo o reactivos
derivatizadores pero sin adición de la muestra. El objetivo es eliminar las
interferencias que no provienen de la matriz, en este caso, la absorbancia
producida por los disolventes y/o reactivos derivatizadores.
El blanco es la primera solución a la cual se mide la absorbancia y a partir de la
señal obtenida se calibra el equipo a cero, por lo que, en lo adelante, el resto de
las mediciones que se realicen a la muestra y a las soluciones patrones no
consideran la absorbancia producida por los reactivos.
3.7.2. Métodos de cuantificación
El fundamento del análisis cuantitativo por espectrometría de absorción
molecular es la ley de Lambert-Beer (A=  b c), que establece una
proporcionalidad directa entre la absorbancia y la concentración.
Una particularidad de todos los métodos instrumentales de cuantificación es la
necesidad de utilizar patrones de referencia del analito que se desea cuantificar,
a los cuales se les mide la señal analítica (absorbancia en este caso) en idénticas
condiciones experimentales a como se realiza la medición en la muestra. Así, la
esencia de cualquier procedimiento de cuantificación es la comparación de la
señal brindada por el analito con la señal brindada por uno o varios patrones de

referencia de concentración exactamente conocida.

Existen dos procedimientos básicos para realizar el análisis cuantitativo: el
método del patrón externo y el método de la curva de calibración.
3.7.2.1. Método del patrón externo
El método del patrón externo es el procedimiento más sencillo de cuantificación,
aunque también es el menos exacto. Consta de los siguientes pasos:
1. Preparación de la solución de la muestra según la metodología requerida para
garantizar la ausencia de interferencias.
2. Preparación de una solución de un patrón de referencia del componente que
se desea cuantificar, a una concentración exactamente conocida, en las
mismas condiciones que a la muestra (disolvente, pH, temperatura,
derivatización, etc.).
3. Medición de la absorbancia de la solución de la muestra y de la solución del
patrón de referencia a la longitud de onda de máxima absorción.
Con los valores de absorbancia obtenidos para la muestra y el patrón de
referencia se plantea la siguiente relación:
Concentración del patrón (CPR) ------------- Absorbancia del patrón (APR)
Concentración de la muestra (CM) ------------- Absorbancia de la muestra (AM)
entonces:
CPR x AM
CM =
APR
Veamos un ejemplo
La cuantificación de nitrito de sodio (NaNO2) en productos cárnicos se
fundamenta en la reacción de los nitritos con un reactivo derivatizador (Acido
sulfanílico + Cloruro de -Naftilamina) para producir un complejo coloreado que
se mide a 520 nm.
El procedimiento analítico involucró la obtención de un extracto de la muestra del
cual se tomaron 10 mL y se añadieron 10 mL del reactivo derivatizador. La
solución se agitó y se dejó reposar durante 15 minutos al abrigo de la luz.
Para la cuantificación por el método de patrón externo se prepararon 10 mL de
solución de patrón de referencia conteniendo 2 g de NaNO2 a la cual se
añadieron igualmente 10 mL del reactivo derivatizador y se dejó reposar en
oscuridad durante 15 minutos.
A ambas soluciones se les midió la absorbancia a 550 nm, obteniéndose valores
de 0.42 y 0.47 para el patrón de referencia y la muestra, respectivamente.
entonces puede plantearse:
40d78409-8f5a-44ad-af96-811f110af4ad
2 g ------------- 0.42
g (muestra) ------------- 0.47
2 g x 0.47
g ( muestra) =
0.42
g ( muestra) = 2.24 g NaNO2
Está claro el valor de 2.24 g representa el contenido de NaNO2 en los 10 mL del
extracto tomados para el análisis. Para calcular la concentración de NaNO2 en el
producto cárnico habría que considerar las variaciones de masa o concentración
que se produjeron en el proceso de preparación de la muestra y obtención del
extracto, aspectos estos que se han obviado en la presentación de este ejemplo.
El método del patrón externo presenta la limitante de asumir que la ley de
Lambert-Beer se cumple en las condiciones experimentales empleadas y para los
valores de concentración del patrón y la muestra, lo que no necesariamente es
cierto pues como se sabe existen desviaciones químicas y físicas (ver epígrafe
3.3.1) que afectan la proporcionalidad entre la absorbancia y la concentración.
De ahí que el procedimiento del patrón externo no es del todo exacto y se
emplea únicamente en análisis rutinarios en los que se conoce aproximadamente
la concentración del analito en la muestra (nótese que la concentración a la cual
se preparó el patrón es similar a la encontrada en la muestra) y se tiene la
certeza del cumplimiento de la ley fundamental de la absorción.
El procedimiento más exacto y más ampliamente utilizado en el análisis
cuantitativo es el método de la curva de calibración.
3.7.2.2. Curva de calibración
Una curva de calibración es un procedimiento analítico que permite la
cuantificación exacta y precisa del compuesto de interés por cuanto permite
comprobar el cumplimiento de la ley de Lambert-Beer en las condiciones
experimentales en que se realiza la determinación.
Los pasos generales para la realización de una curva de calibración son los
siguientes:
1. Preparación de la solución de la muestra según la metodología requerida
para garantizar la ausencia de interferencias.
2. Preparación de una serie de soluciones de un patrón del analito a
concentraciones crecientes y exactamente conocidas en las mismas
condiciones que la muestra (disolvente, pH, temperatura, derivatización,
etc.). El número de soluciones puede estar comprendido entre 5 y 10 y las
concentraciones se seleccionan de acuerdo con las cantidades esperadas
del analito en la muestra.
3. Medición de la absorbancia de la solución de la muestra y de cada una de
las soluciones de los patrones de referencia a la longitud de onda de
máxima absorción.
Se obtiene entonces un juego de datos de concentración de las soluciones

patrones vs. absorbancia, que en concordancia con la ley de Lambert-Beer
(A=  b c), debe responder a la ecuación de una recta del tipo
y = mx + a
donde
y es la absorbancia
m es la pendiente ( b) de la recta
x es la concentración
a es el intercepto, que este caso debe ser teóricamente igual a cero, dado
que para cero concentraciones del patrón de referencia no debe obtenerse
ningún valor de absorbancia.
4. A partir de los resultados experimentales obtenidos se aplica una regresión
lineal simple con ayuda del método de los mínimos cuadrados para
obtener la ecuación de regresión y = mx + a.
Los términos m (pendiente) y a (intercepto) pueden ser calculados a través
de las siguientes expresiones matemáticas:
n n
n  xi   y i
x y i i − i =1
n
i =1
 y − m x
m= i =1 a=
n n n
 xi2 −  xi
i =1 i =1
Una vez obtenida la ecuación de la recta se sustituye el término “y” por la

absorbancia de la muestra (AM) y despejando se calcula el término “x” que es la
concentración del analito en la muestra (CM), según:
y = mx + a
AM = m C M + a
AM − a
CM =
m
Veamos un ejemplo:
Se desea determinar el contenido del aminoácido prolina en una muestra de jugo
de uvas. El principio de la determinación radica en que todos los aminoácidos al
reaccionar con una solución de ninhidrina forman un complejo coloreado
(púrpura), cuya absorbancia se lee a 517 nm.
La siguiente ecuación ilustra la reacción considerada:
40d78409-8f5a-44ad-af96-811f110af4ad
El procedimiento de determinación es el siguiente

1. Tomar 0,5 mL de una muestra diluida e introducirla en un tubo de ensayo con
tapón de rosca, añadir 0,25 ml de Acido Fórmico 98% y 1 mL de solución de
Ninhidrina al 3%. Cerrar herméticamente el tubo e introducirlo en un baño de
agua hirviendo durante catorce o quince minutos.
2. Preparar una curva de calibración con soluciones de un patrón de referencia
de prolina a concentraciones de 5, 10, 15, 20, 25 y 30 mg/L. Añadir a cada
una de las soluciones de los patrones 0,25 mL de Acido Fórmico 98% y 1 mL
de solución de Ninhidrina al 3%. Cerrar herméticamente el tubo e introducirlo
en un baño de agua hirviendo durante catorce o quince minutos.
3. Medir la absorbancia de la solución de muestra y las soluciones de los
patrones a 517 nm contra un blanco que contiene 0.25 mL de agua y el resto
de los reactivos descritos anteriormente.
Supongamos que se obtuvieron los siguientes resultados de las lecturas de la
curva de calibración:
Soluciones patrón de prolina 1 2 3 4 5 6

Concentración (mg/L) 5 10 15 20 25 30
Absorbancia 0.095 0.2 0.28 0.37 0.48 0.57
y que la absorbancia obtenida para la solución de la muestra fue 0.41
Al aplicar la regresión lineal y calcular los valores de pendiente (m) e intercepto
(a), se obtuvo la siguiente ecuación:
y = 0.0189 x + 0.002
sustituyendo el término “y” por el valor de absorbancia de la muestra (0.41) y
despejando, quedaría
0.41 − 0.002
x=
0.0189
x = 21.59 mg prolina / L
Sin embargo, el objetivo de la realización de una curva de calibración es

precisamente comprobar el cumplimiento de la ley de Lambert-Beer en el
intervalo de concentraciones seleccionado, con vistas a garantizar la
cuantificación precisa del componente objeto de determinación.
Entonces es necesario, a partir de los resultados experimentales, comprobar la

proporcionalidad existente entre la concentración y la absorbancia, para lo cual

se calcula el coeficiente de determinación (R2) empleando la siguiente expresión:
2

  xi y i − x y i i 

 n 
 
( x ) 2
2
x i
2
−
n
i
R =
( y i )2
y i
2
−
n
La importancia práctica del coeficiente de determinación (R2) puede resumirse
como sigue:
• Si R2 = 0, la regresión lineal no explica la dependencia entre X y Y, lo que
significa que ambas variables se relacionan por otra función o no se
relacionan.
• Si R2 = 1, entonces el modelo de regresión lineal se ajusta totalmente a los
datos, es decir la ecuación refleja perfectamente la dependencia entre X y Y.
• Si 0 < R2 < 1, la regresión explica parte del error y quedan errores no
explicados o residuos, lo que constituye el caso más común en la práctica.
En resumen, el coeficiente de determinación R2, mide la “bondad de ajuste” del
modelo de regresión. Mientras más cercano esté a 1, significa que hay un mejor
ajuste entre el modelo lineal y los datos experimentales. Esto implica que la
recta de regresión describe más eficientemente la relación entre las dos variables
en estudio, en este caso la absorbancia y la concentración, por lo que constituye
una medida del grado de cumplimiento de la Ley de Lambert-Beer.
Para el ejemplo considerado, se obtuvo un valor de R2 igual a 0.9984, lo que
denota la existencia de una excelente proporcionalidad entre la absorbancia y la
concentración, por cuanto la regresión explica el 99.84 % del error total.
Aunque el coeficiente de determinación es el parámetro más utilizado para
evaluar la recta de regresión, su determinación no constituye una prueba
concluyente, por lo que en una investigación rigurosa, deben realizarse otras
pruebas para confirmar el ajuste de la ecuación de regresión a los datos
experimentales.
El Test de Fisher o Anova Simple es la más importante prueba de significación
de la regresión lineal simple. Si la prueba resulta significativa, indicará que la
porción del error explicada por la regresión es significativamente mayor que la
porción no explicada. Esto asegura un buen ajuste del modelo a los datos.
En el ejemplo considerado, los resultados del Anova Simple para la regresión se
muestran en la tabla 3.3.
40d78409-8f5a-44ad-af96-811f110af4ad
Tabla 3.3. Resultados del Anova Simple para la regresión.
Grados de Suma de Promedio de los

F Valor crítico de F
libertad cuadrados cuadrados
Regresión 1 0,15604 0,15604321 2555,09 9,1665 x 10-7
Residuos 4 0,00024 6,1071 x 10-5
Total 5 0,15629
Obsérvese que el valor de F experimental es mucho mayor que el valor de F

crítico (2555,09 > 9,1665 x 10-7) por lo que puede afirmarse que el Anova es
significativo, lo que implica una buena linealidad de la recta de regresión y por
tanto un buen ajuste de los datos al modelo.
Sin embargo, estos resultados no son suficientes para afirmar que los valores
obtenidos son confiables, sino que el cumplimiento de Lambert-Beer requiere
además determinar la significación de la pendiente y del intercepto.
La prueba de significación de la pendiente brinda información acerca de la
variación (incremento o disminución) de los valores de “y” en la medida en que
aumentan los valores de “x”, es decir, si la pendiente resulta significativa quiere
decir que en la medida en que se incrementa la concentración de prolina se
incrementan también significativamente los valores de absorbancia.
En el caso del intercepto, según la ley de Lambert Beer, este debe ser igual a
cero o hablando en términos estadísticos, el intercepto debe ser no significativo,
es decir, que el valor obtenido en la ecuación de la recta (0.002 en el ejemplo
que nos ocupa) debe ser significativamente igual a cero.
En el ejemplo considerado, al realizar pruebas de hipótesis para un nivel de
confianza del 95 % (= 0.05) se obtuvieron los resultados que se muestran en la
tabla 3.4.
Tabla 3.4. Resultados de las pruebas de hipótesis (= 0,05) para la pendiente y el
intercepto
Coeficientes Error típico Estadístico t Significación

Intercepto 0,002 0,007275 0,2749 0,797
Pendiente 0,0189 0,000374 50,5479 9,17 x 10-7
Nótese que se obtuvo una significación para la pendiente de 9,17 x 10-7 ( 0.05),
corroborándose que la misma resulta significativa, mientras para el intercepto la
significación fue 0.797 ( 0.05), por lo que puede afirmarse que el mismo no
difiere significativamente del valor cero. Ambos resultados, unidos a la linealidad
demostrada por R2 y el Anova de la regresión, corroboran el cumplimiento de
la ley de Lambert-Beer y por lo tanto la ecuación de regresión obtenida puede
emplearse para el cálculo de la concentración de prolina.
Un resumen del ejemplo considerado se muestra en las figuras 3.13a y 3.13b.

Figura 3.13a. Representación esquemática del procedimiento de curva de calibración

para la determinación de prolina en jugo de uvas.
mg/L de patrón de
Absorbancia
referencia de Prolina
5 0.095
10 0.20
15 0.28
20 0.37
- Anova significativo
25 0.48
(Fexp > Fcrit)
30 0.57
- Pendiente significativa
Muestra 0.41
(texp > tcrit)
0.41 − 0.002 - Intercepto no significativo
x=
0.0189 (texp < tcrit)
x = 21.59 mg prolina / L
Figura 3.13b. Resultados obtenidos en el procesamiento de los datos experimentales de

curva de calibración por el método de regresión lineal simple para la determinación de
prolina en jugo de uvas.
En resumen, para verificar el ajuste del modelo a los resultados experimentales

(en este caso el cumplimiento de la ley de Lambert Beer) deben realizarse un
conjunto de pruebas estadísticas y solo cuando se cumplan los supuestos de las
pruebas de significación fundamentales para el análisis de regresión la ecuación
obtenida puede emplearse para la obtención de resultados confiables en el
cálculo de la concentración del analito. Un resumen de estas pruebas estadísticas
se muestra en la tabla 3.5.
40d78409-8f5a-44ad-af96-811f110af4ad
Tabla 3.5. Parámetros estadísticos a considerar para verificar el ajuste del modelo a los
resultados experimentales en una curva de calibración.
Parámetros Resultados que expresan Significado práctico de los

estadísticos el ajuste del modelo parámetros estadísticos calculados
Cercano al valor 1 Expresa linealidad. Indica la proporción
En la práctica científica se entre el error explicado por la regresión
Coeficiente de
plantea que para métodos con respecto al error total.
determinación (R2)
espectrofotométricos R2 debe
ser ≥ 0,99
Expresa linealidad. Indica la proporción
Anova simple de la
Significativo entre el error explicado por la regresión
regresión
con respecto al error no explicado.
Expresa la variación significativa de la
señal analítica (Absorbancia, Transmitan-
Prueba de hipótesis
Pendiente significativa cia, Fluorescencia, etc) con el incremento
para la pendiente
de la concentración de los patrones de
referencia.
Prueba de hipótesis Expresa que la recta parte del origen, es
Intercepto no significativo
para el intercepto decir, que el intercepto es igual a cero.
Finalmente debe señalarse que en la actualidad se emplean para estos cálculos

programas estadísticos especializados que realizan estas y otras muchas
operaciones con gran velocidad y eficiencia. Entre los más populares se
encuentra Microsoft Excel, del paquete Microsoft Office, en cualquiera de sus
versiones y uno de los más potentes es el software SPSS for Windows por la gran
variedad de pruebas estadísticas que puede realizar.
3.8. APLICACIONES EN EL ANÁLISIS DE LOS ALIMENTOS

La espectrometría de absorción molecular UV-visible presenta múltiples
aplicaciones en el análisis de un gran número de compuestos en los alimentos
constituyendo una poderosa herramienta para el análisis cuantitativo. En la tabla
3.6, se relacionan algunas de estas aplicaciones con las condiciones de trabajo
más importantes.
Tabla 3.6.
Algunas aplicaciones de la espectrometría UV-vis en el análisis de alimentos.
Analito Alimentos Condiciones experimentales  trabajo
Absorción de la radiación ultravioleta por el

Nitratos Aguas 275 nm
ión nitrato.
Formación de un complejo amarillo-pardo

rojizo I(NH2)Hg que se obtiene cuando se
mezcla el reactivo de Nessler (I2Hg.2IK) con
Amonio Aguas una solución acuosa conteniendo ión amonio. 410 nm
La intensidad del color es función del ión
amonio presente, y se determina por
colorimetría.
Determinación de la cantidad de boro,

Boro Aguas mediante espectrofotometría, previa reacción 410 nm
con azometino.

Oxidación del alcohol metílico a formaldehído

por potasio permanganato en presencia de
Bebidas ácido fosfórico y medida espectrofotométrica
Metanol 575 nm
alcohólicas de la reacción coloreada del formaldehído con
ácido cromotrópico. Coloración violeta
específica del formaldehído.
Extracción de azúcares simples con etanol

caliente 80%, permaneciendo el almidón. El
residuo de almidón se solubiliza con ácido
Almidón Cereales perclórico diluido, y medida 630 nm
espectrofotométrica del color desarrollado al
calentarlo con el reactivo antrona-ácido
sulfúrico.
El SO2 se destila en medio ácido y se lleva a

una solución tamponada de DTNB (Ditiobis-
Anhídrido Acido Nitrobenzoico) por medio de una
Cerveza 415 nm
sulfuroso corriente de nitrógeno. El producto formado
en la reacción se mide por espectrofoto-
metría.
Formación de óxido cuproso por reacción de

los azúcares con cobre (II) en medio alcalino.
Compotas,
Azúcares Reacción del óxido cuproso con ácido
mermeladas y 550 nm
reductores jaleas
arsenomilíbdico y medición
espectrofotométrica del ácido
arsenomolibdoso resultante de la reacción.
Determinación cuantitativa de la prolina por

Prolina Jugo de uvas 517 nm
reacción con ninhidrina en medio ácido.
La actividad de la fosfatasa de la leche en
polvo se determina por el poder de la
fosfatasa de liberar el fenol de fenilfosfato
Actividad
Leche disódico. Se mide la cantidad de fenol 610 nm
fosfatasa liberado en las condiciones prescritas, por la
medida espectrofotométrica de la coloración,
desarrollada con el reactivo de Gibbs.
Previa hidrólisis en medio ácido de las
Productos proteínas y oxidación de la hidroxiprolina. El
Hidroxiprolina 560 nm
Cárnicos derivado formado con el p-dimetilamino-
benzaldehído se valora colorimétricamente.
Reacción de los nitritos con ácido sulfanílico y

Productos -naftilamina, y lectura de la intensidad de la
Nitritos 520 nm
Cárnicos coloración obtenida mediante espectrofoto-
metría.
Transformación del fósforo en ácido

Productos
pirofosfórico, posterior hidrólisis del mismo y
Fósforo Cárnicos, 436 nm
medida del color producido al añadirle el
Cereales, Lácteos
reactivo molibdato-vanadato.
Reacción cuantitativa de los ésteres con

hidroxilamina en solución alcalina, formación
Esteres Rones de ácido hidroxámico, acidificación, formación 525 nm
de un complejo coloreado con iones férricos y
medida del color desarrollado
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Destilación y posterior medida espectrofoto-

Furfuraldehído Rones 277 nm
métrica.
El etanal se determina en la sidra, previa-

mente decolorada con carbón, midiendo la
Etanal Sidra 570 nm
coloración verde o violeta que da con el sodio
nitroprusiato y la piperidina.
El sodio dietilditiocarbamato reacciona con el

cobre (reacción de Delepine), dando la sal
Cobre Varios correspondiente a este metal y coloración 420 nm
amarilla oro, cuya intensidad se mide por
colorimetría o espectrofotometría.
El hierro oxidado por el agua oxigenada se

combina con el ion sulfociánico en medio
Hierro Varios 508 nm
clorhídrico. El color rojo se mide por
espectrofotometría.
El 2,3-butanodiol separado del vino, previa

defecación, por extracción con acetona, se
oxida con ácido peryódico a acetaldehído. La
2,3 butanodiol Vinos
reacción coloreada del acetaldehído con el
270 nm
sodio nitroprusiato y la piperidina permite la
determinación espectrofotométrica.
Extracción por el éter del ácido benzoico

presente en el vino. Tratamiento del extracto
por la mezcla nitro-sulfúrica y formación del
Ácido benzoico Vinos ácido 3,5- dinitrobenzoico, que es extraído 570 nm
con éter y después recogido por la mezcla
acetona-alcohol. La adición de hidróxido de
sodio da origen a una coloración violeta.
En la destilación del vino para la

determinación de la acidez volátil el ácido
sórbico pasa casi en su totalidad al destilado
junto con el ácido acético, falseando el
Ácido sórbico Vinos resultado del análisis. Para valorar este ácido 256 nm
sórbico se parte de una muestra de 0,5 ml de
destilado (lo que no supone un error
sensible) y se valora por espectrofotometría
en el ultravioleta.

1. Consulte los apéndices B-1, B-3, B-4, B-5 y B-6, en los que aparece
un resumen del presente capítulo. Céntrese en los elementos
relacionados con la absorción molecular UV-Vis.
2. Resuelva los ejercicios 1, 2 y 3 que aparecen en el Capítulo 14 /
epígrafe 14.1. Ejercicios propuestos, así como el ejercicio 9 del
mismo epígrafe, centrándose en este último caso en el análisis de las
técnicas 1 y 2 (Determinación de anhídrido sulfuroso en cerveza y
determinación de almidón en productos cárnicos).
3. Resuelva el ejercicio 1 que aparece en el Capítulo 14 / epígrafe
14.3. Análisis de documentación científica.
BIBLIOGRAFÍA
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consumo público y aguas de bebidas envasadas. Ed. Panreac Química SA,
1999.
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cárnicos. Ed. Panreac Química SA, 1999
3. Analíticos en Alimentaria. Métodos Oficiales de Análisis. Cereales, derivados
de cereales y cerveza. Ed. Panreac Química SA, 1999
4. Analíticos en Alimentaria. Métodos Oficiales de Análisis. Leche y productos
lácteos. Ed. Panreac Química SA, 1999
5. Analíticos en Alimentaria. Métodos Oficiales de Análisis. Productos derivados
de la uva, aguardientes y sidra. Ed. Panreac Química SA, 1999.
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8. Polo, J. C. (2009). Regresión lineal simple. Comunicación personal. Instituto
de Farmacia y Alimentos. Universidad de La Habana. Cuba.
SA. Madrid
Dykinson. Madrid.
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4 Espectrometría de absorción atómica
La espectroscopia atómica estudia la absorción o emisión de radiación

electromagnética por las partículas atómicas. Si se suministra una determinada
cantidad de energía a un átomo que se encuentra en su estado fundamental de
energía, E0, esta energía es absorbida por el átomo saltando un electrón situado
en la capa electrónica exterior a un nivel energético superior, alcanzando el
átomo un nuevo estado energético E 1.
La cantidad de energía para pasar del estado E0 al estado E1 se conoce como
energía de excitación y puede suministrarse térmicamente, eléctricamente,
por inducción electromagnética, por radiaciones de diversa naturaleza, etc.
Cuando el átomo vuelve al estado fundamental cede una cantidad de energía
idéntica a la de excitación, emitiendo radiaciones de una determinada longitud de
onda (figura 4.1).
Figura 4.1. Procesos de absorción y emisión atómica.
En el análisis de los alimentos se emplean dos técnicas fundamentales para

trabajar en espectroscopia atómica: absorción atómica y emisión atómica. En
absorción atómica se mide la energía absorbida por los átomos para pasar del
estado fundamental al estado excitado mientras que en emisión se mide la
energía liberada al pasar de estados excitados al estado fundamental. Existe una
tercera aplicación conocida como espectroscopia de fluorescencia atómica, que
se produce cuando la radiación absorbida, de una determinada frecuencia, por
los átomos en el estado fundamental, es parcialmente reemitida como radiación
de fluorescencia, es decir, la radiación emitida es menor que la absorbida, pero
en este texto solo se abordarán las dos primeras.
En este capítulo se considerarán los principios generales y aplicaciones analíticas
fundamentales de la espectrometría de absorción atómica.
89
4. Espectrometría de absorción atómica
4.1. PRINCIPIOS GENERALES DE LA ESPECTROMETRÍA DE ABSORCIÓN

ATÓMICA
La espectroscopia de absorción atómica (a menudo llamada EAA) es un método

instrumental de la Química Analítica que determina una gran variedad de
elementos metálicos, siendo capaz de detectar y determinar cuantitativamente la
mayoría de los elementos del sistema periódico. Sus campos de aplicación son,
por tanto, muy diversos. Se emplea en el análisis de aguas, análisis de suelos,
bioquímica, toxicología, medicina, industria farmacéutica, industria alimentaria,
industria petroquímica, etc.
La concentración del analito se determina a partir de las medidas de absorción
producidas por los átomos libres de un elemento en particular, a la longitud de
onda de absorción específica de este elemento. La conversión del analito en
átomos neutros se logra cuando la muestra es quemada en una llama o en un
horno de grafito.
En otras palabras, la espectrometría de absorción atómica se basa en la
absorción de energía radiante de las zonas de UV o el visible por átomos libres o
neutros en estado gaseoso del elemento que se analiza, producidos por la
energía térmica de una llama o de una superficie sólida con alta temperatura.
A fin de explicar los principios generales de la absorción atómica, partamos de
los componentes fundamentales de un espectrómetro de absorción atómica y de
los procesos fundamentales que ocurren en el mismo.
Los instrumentos para espectrometría de absorción atómica (EAA) constan de
manera general de una fuente de radiación, un sistema de atomización de la
muestra, consistente en una llama o en un horno de grafito, un selector de
longitud de onda, un detector y un procesador de la señal y de la lectura de
salida.
La muestra, convenientemente preparada y generalmente en disolución, es
introducida en el sistema de atomización en el cual, por acción de las altas
temperaturas de la llama o del horno electrotérmico, se vaporiza y se convierte
en átomos libres correspondientes a todos los elementos presentes inicialmente
en ella.
Sobre el vapor atómico originado se hace incidir radiación electromagnética
proveniente de una fuente que emite radiación monocromática de potencia Po de
la misma longitud de onda del elemento que se pretende analizar, provocando
que los átomos del analito absorban parte de esta radiación en función de su
concentración y se exciten pasando a un estado energético superior.
La potencia no absorbida Pt llega a un selector de longitud de onda en el que se
ha seleccionado la longitud de onda correspondiente a la línea de absorción de
analito (que es idéntica a la emitida por la fuente). La función de este dispositivo
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es eliminar las interferencias producidas por la emisión de radiación de la llama,

evitando que éstas lleguen al detector y falseen la determinación.
A continuación del selector de longitud de onda se coloca un detector,
generalmente un tubo fotomultiplicador, capaz de transformar, en relación
proporcional, las señales de intensidad de radiación electromagnética en señales
eléctricas o de intensidad de corriente, las cuales llegan al procesador de señal,
que es por lo general un dispositivo electrónico que amplifica la señal eléctrica
generada por el detector y registra el valor de absorbancia y/o transmitancia.
De forma análoga a lo explicado para los procesadores de señales en absorción
molecular, en la actualidad el registro de la señal de absorbancia y la
transmitancia se acopla a sistemas computarizados que con ayuda de potentes
softwares almacenan la información y realizan cálculos cuantitativos entre otras
funciones.
La figura 4.2 muestra un esquema general del equipo y de los procesos
fundamentales que ocurren en el mismo.
Figura 4.2. Componentes básicos y procesos en un espectrómetro de absorción atómica.
Teniendo en cuenta la significativa importancia que reviste el proceso de

atomización de la muestra y las particularidades en la construcción y
características de la fuente de radiación empleada en la espectrometría de
absorción atómica se profundizará a continuación en estos dos aspectos.

4.2. TÉCNICAS DE ATOMIZACIÓN DE LA MUESTRA

Existen dos métodos fundamentales de atomización de la muestra: la
atomización con llama y la atomización electrotérmica con un horno de grafito.
4.2.1. Atomización con llama
En un atomizador de llama, la
disolución de la muestra es
nebulizada mediante un flujo de gas
oxidante, mezclado con el gas
combustible, y se transporta a una
llama donde se produce la
atomización. Como se muestra en la
figura 4.3, una serie compleja de
procesos encadenados tiene lugar en
la llama. El primero es la
desolvatación, en el que se evapora
el disolvente hasta producir un
aerosol molecular sólido finamente
dividido. Luego ocurre la disociación
de la mayoría de estas moléculas y
se produce un gas atómico. La
mayoría de los átomos así formados
se ionizan originando cationes y
electrones. Indudablemente se
producen también otras moléculas y
átomos en la llama como resultado
de las interacciones del gas
combustible con el gas oxidante y
Figura 4.3. Procesos que tienen lugar
con las distintas especies de la
durante la atomización
muestra. Como se indica en la figura
4.3 una fracción de las moléculas, átomos e iones también se excita por el calor
de la llama, produciéndose así espectros de emisión moleculares, atómicos e
iónicos. Produciéndose tantos procesos complejos, no es sorprendente que la
atomización sea la etapa más crítica en la espectroscopia de llama y la que limita
la precisión de dichos métodos. Debido a la naturaleza crítica de la etapa de
atomización, es importante comprender las características de las llamas y las
variables que afectan a dichas características.
Tipos de llamas
En la tabla 4.1 se enumeran los combustibles y oxidantes más comunes
utilizados en espectroscopia de llama y los intervalos aproximados de
temperatura alcanzados con cada una de estas mezclas. Hay que destacar que
cuando se utiliza el aire como oxidante se obtienen temperaturas de 1700 a
2400 °C con varios combustibles. A estas temperaturas sólo las muestras que se
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descomponen fácilmente se atomizan. Para la mayoría de las muestras

refractarias, se debe emplear oxígeno u óxido nitroso como oxidante. Estos
oxidantes producen temperaturas de 2500 a 3100 °C con los combustibles
habituales.
Tabla 4.1. Propiedades de las llamas
Velocidad de combustión
Combustible Oxidante Temperaturas (ºC)
máxima (cm/s)
Gas natural Aire 1700 – 1900 39 – 43
Gas natural Oxígeno 2700 – 2800 370 – 390
Hidrógeno Aire 2000 – 20100 300 – 440
Hidrógeno Oxígeno 2550 – 2700 900 – 1400
Acetileno Aire 2100 – 2400 158 – 266
Acetileno Oxígeno 3050 – 3150 1100 – 2480
Acetileno Óxido nitroso 2600 – 2800 285
Las velocidades de combustión indicadas en la cuarta columna de la tabla 4.1

son de considerable importancia, porque las llamas sólo son estables en ciertos
intervalos de caudal. Si el caudal no sobrepasa la velocidad de combustión, la
llama se propaga hacia el interior del quemador dando un fogonazo. Cuando el
caudal aumenta, la llama sube hasta alcanzar un punto por encima del quemador
donde el caudal y la velocidad de
combustión son iguales. En esta región es
donde la llama es estable. A caudales más
elevados, la llama sube y al final alcanza
un punto donde se aparta del mechero y se
apaga. Estas consideraciones ponen de
relieve la importancia de controlar el caudal
de la mezcla combustible/oxidante. Este
caudal depende mucho del tipo de
combustible y de oxidante utilizados.
Estructura de la llama
Como se muestra en la figura 4.4 las
regiones más importantes de la llama son
la zona de combustión primaria, la región
interconal y la zona de combustión
secundaria. El aspecto y el tamaño relativo
de estas regiones varían Figura 4.4. Regiones en una llama
considerablemente con la relación
combustible-oxidante, así como con el tipo de combustible y de oxidante. La
zona de combustión primaria en una llama de hidrocarburos se reconoce por su
coloración azul que proviene de los espectros de bandas de C 2, CH y otros

radicales. En general, en esta zona no se alcanza el equilibrio térmico y, por ello,

esta zona rara vez se utiliza en espectrometría de llama.
La región interconal, que es relativamente estrecha en llamas de hidrocarburo
estequiométricas puede alcanzar varios centímetros de altura con fuentes ricas
en combustible de acetileno/oxígeno o acetileno/óxido nitroso. La zona es
frecuentemente rica en átomos libres y es la parte de la llama más ampliamente
utilizada en espectroscopia. En la zona de combustión secundaria, los productos
formados en la región interior se
convierten en óxidos moleculares
estables que se dispersan por los
alrededores.
El perfil de la llama proporciona
información útil respecto a los procesos
que tienen lugar en las distintas partes
de la llama; es una representación de
contornos que muestra las regiones de
la llama donde una variable de interés
tiene valores similares. Algunas de
estas variables son la temperatura, la
composición química, la absorbancia y
la intensidad radiante.
Perfiles de temperatura.
La figura 4.5 muestra el perfil de
temperatura de una llama característica
para espectroscopia atómica. La
temperatura máxima se localiza
aproximadamente 1 cm por encima de
Figura 4.5. Perfiles de temperatura en
la zona de combustión primaria de la
ºC en una llama de gas natural / aire
llama. Es importante, especialmente en
los métodos de emisión, enfocar la misma parte de la llama con la rendija de
entrada en todas las medidas analíticas y de calibración.
Perfiles de absorbancia de la llama.
Los perfiles de absorción de diferentes elementos difieren también en función de
la zona de la llama en que se encuentres. Así, por ejemplo, el magnesio presenta
un máximo de absorbancia aproximadamente a la mitad de la llama debido a dos
efectos opuestos. Primeramente, ocurre un aumento inicial de la absorbancia a
medida que la distancia a la base de la llama aumenta, lo que se debe al gran
número de átomos de magnesio producidos por el mayor tiempo de exposición al
calor de la llama, sin embargo, al acercarse a la zona secundaria de combustión
comienza una apreciable oxidación del magnesio; este proceso origina el
consiguiente descenso de la absorbancia, ya que las partículas de óxido formadas
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no absorben a la longitud de onda empleada. Por ello, para obtener la máxima

sensibilidad analítica, la llama debe ajustarse con respecto al haz hasta obtener
una absorbancia máxima.
El comportamiento de otros metales es bastante diferente, así por ejemplo, la
plata, la cual no se oxida fácilmente evidencia un aumento continuo del número
de átomos y por tanto de la absorbancia desde la base hasta la periferia de la
llama. Por el contrario, el cromo, que forma óxidos muy estables, muestra una
disminución continua de la absorbancia desde una zona próxima al extremo del
mechero, lo que sugiere que la formación de óxidos predomina desde el
principio. Obviamente, para el análisis de cada uno de estos elementos se
debería utilizar una zona distinta de la llama. De ahí que el ajuste de la posición
de la llama respecto a la rendija de entrada es, por tanto, una operación crítica
que determina en gran medida los resultados del análisis.
Atomizadores de llama
Los atomizadores de llama se emplean en espectroscopia de emisión y absorción
atómica. La figura 4.6 muestra el diagrama de un típico mechero de flujo laminar
de fabricación comercial que emplea un nebulizador de tubo concéntrico. El
aerosol, formado por el flujo del gas oxidante, se mezcla con el combustible y
pasa a través de una serie de deflectores que eliminan las gotitas de disolución
que no sean muy finas. Como consecuencia de la acción de estos deflectores la
mayor parte de la muestra se recoge en el fondo de la cámara de mezcla, donde
se drena hacia un contenedor de desechos. El aerosol, el oxidante y el
combustible se queman pues en un mechero provisto de una ranura que produce
una llama que generalmente mide entre 5 y 10 cm de longitud.
Figura 4.6. Mechero de flujo laminar

Los mecheros de flujo laminar proporcionan una llama relativamente estable y

larga. Estas propiedades tienden a aumentar la sensibilidad y la reproducibilidad.
La cámara de mezcla en este tipo de mechero contiene una mezcla
potencialmente explosiva, que se puede prender por cl retroceso de la llama, si
su caudal es demasiado bajo. Obsérvese que, por esta razón, el mechero de flujo
laminar mostrado en la figura 4.6 está equipado con unas válvulas para disminuir
la presión.
Reguladores de combustible y oxidante.
En la espectroscopia de llama los caudales de oxidante y de combustible
constituyen variables importantes que requieren un control preciso. Es deseable
poder variar cada uno de ellos en un intervalo amplio para poder encontrar
experimentalmente las condiciones óptimas para la atomización. Por lo general,
el combustible y el oxidante se combinan aproximadamente en una proporción
estequiométrica.
Sin embargo, en la determinación de metales que forman óxidos estables es más
conveniente el empleo de una llama que contenga un exceso de combustible. Los
caudales se controlan, por lo general, por medio de reguladores de presión del
doble diafragma seguidos de válvulas de agujas situadas en el instrumento. El
sistema de medida de caudal más empleado es el rotámetro, que consiste en un
tubo cónico, graduado y transparente montado verticalmente con su extremo
más estrecho hacia abajo. El flujo de gas levanta un flotador liviano, cónico o
esférico, cuya posición vertical está determinada por el caudal de gas.
Características de funcionamiento de los atomizadores de llama.
En términos de reproducibilidad la atomización con llama resulta ser superior a
todos los demás métodos que se han desarrollado hasta ahora para la
introducción de muestras líquidas. Sin embargo, en términos de eficacia en la
introducción de la muestra y, por ello, de sensibilidad, otros métodos de
atomización son claramente mejores. Pueden citarse dos razones para la menor
eficacia de la introducción de la muestra en la llama. En primer lugar, una gran
porción de la muestra se pierde por el drenaje. En segundo lugar, el tiempo de
residencia de los átomos individuales en el camino óptico en la llama es breve
(aproximadamente 10-4 s).
4.2.2. Atomización electrotérmica
Los atomizadores electrotérmicos, que aparecieron por primera vez en el
comercio aproximadamente en 1970, proporcionan generalmente una mayor
sensibilidad debido a que toda la muestra se atomiza en un período muy corto y
el tiempo promedio de permanencia de los átomos en el camino óptico es de un
segundo o más. Los atomizadores electrotérmicos se utilizan para las medidas de
absorción atómica, pero por lo general, no se han aplicado para la obtención
directa de espectros de emisión. Sin embargo, se están empezando a utilizar
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para vaporizar las muestras para la introducción de las mismas en

espectroscopia de emisión en plasma de acoplamiento inductivo.
En los atomizadores electrotérmicos, unos pocos microlitros de muestra se
evaporan primero a baja temperatura y luego se calcinan a una temperatura algo
más alta en un tubo de grafito, similar al de la figura 4.7b, o cubeta de grafito
calentado eléctricamente. Tras la calcinación, la corriente se incrementa
rápidamente a varios cientos de amperios, lo que eleva la temperatura a unos
2000 o 3000 °C; la atomización de la muestra se produce en un período de
tiempo de unos pocos milisegundos a segundos. En estas condiciones, se mide la
absorción de las partículas atomizadas en la zona situada inmediatamente por
encima de la superficie calentada.
Figura 4.7. (a) Sección transversal de un horno de grafito, (b) Plataforma de L´vov y su
posición en el horno de grafito.

Atomizadores electrotérmicos
La figura 4.7a representa una sección transversal de un atomizador
electrotérmico comercial. En este sistema, la atomización tiene lugar en un tubo
cilíndrico de grafito abierto por ambos extremos y que tiene un orificio central
para la introducción de la muestra mediante una micropipeta. El tubo es de unos
5 cm de largo y tiene un diámetro interno de algo menos de 1 cm. El tubo
intercambiable de grafito se ajusta perfectamente a un par de contactos
eléctricos de grafito cilíndricos que se ubican en los dos extremos del tubo. Estos
contactos se mantienen dentro de una caja metálica refrigerada por agua.
Existen dos corrientes de gas inerte. La corriente externa previene la entrada de
aire exterior y la consiguiente incineración del tubo. La corriente interna fluye por
entre los dos extremos del tubo y sale por el orificio central del compartimento
de muestra. Esta corriente no sólo elimina el aire, sino que sirve también para
desalojar los vapores generados a partir de la matriz de la muestra durante las
dos primeras etapas de calentamiento.
La figura 4.7b ilustra la denominada plataforma de L’vov, que se utiliza con
frecuencia en los hornos de grafito, como el que se muestra en la figura 4.7a. La
plataforma también es de grafito y se encuentra debajo del orificio de entrada de
la muestra. La muestra se evapora y se calcina sobre esta plataforma de la
manera usual. Sin embargo, cuando la temperatura del tubo se eleva
rápidamente la atomización se retrasa, ya que la muestra no está el tiempo
suficiente en contacto directo con la pared del horno. Por tanto, la atomización
tiene lugar en un medio en el que no se produce un cambio tan rápido de
temperatura. De este modo se obtienen picos más reproducibles.
Características de funcionamiento de los atomizadores electrotérmicos
Los atomizadores electrotérmicos ofrecen la ventaja de su elevada sensibilidad
para pequeños volúmenes de muestra. En general, se utilizan volúmenes de
muestra entre 0,5 y 10 L; en estas condiciones los límites de detección
absolutos se encuentran normalmente en el intervalo de 10 -10 y 10-13 g de
analito.
La precisión relativa de los métodos sin llama se encuentra generalmente en el
intervalo del 5 al 10 % en comparación con el 1 % o menos que se puede
esperar en la atomización con llama o plasma. Además, los métodos de horno
son lentos, requiriendo habitualmente varios minutos por elemento. Otra
desventaja es que el intervalo analítico es pequeño siendo por lo general menor
de dos órdenes de magnitud. Por todo ello, la atomización electrotérmica se
aplica normalmente sólo cuando la atomización con llama o plasma proporcionan
límites de detección inadecuados.
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4.3. FUENTES DE RADIACIÓN

Los métodos analíticos basados en la absorción atómica son potencialmente muy
específicos, ya que las líneas de absorción atómica son considerablemente
estrechas (de 0,002 a 0,005 nm) y las energías de transición electrónica son
únicas para cada elemento. Por otro lado, las limitadas anchuras de línea crean
un problema que generalmente no se encuentra en la espectroscopia de
absorción molecular. Se sabe que para que exista una relación lineal entre la
señal analítica (absorbancia) y la concentración, es decir, que se cumpla la ley de
Lambert-Beer, es necesario que la anchura de banda de la fuente sea estrecha
respecto a la anchura de un pico de absorción. Sin embargo, incluso los
monocromadores de buena calidad tienen anchuras de banda efectivas que son
significativamente mayores que la anchura de las líneas de absorción atómica. En
consecuencia, al hacer medidas de absorbancia atómica utilizando un
espectrofotómetro normal equipado con una fuente de radiación continua,
inevitablemente se obtienen curvas de calibrado no lineales. Además, las
pendientes de las curvas de calibrado obtenidas con dicho equipo son pequeñas,
porque sólo una pequeña fracción de la radiación procedente de la rendija del
monocromador es absorbida por la muestra; consecuentemente se obtienen
sensibilidades bajas.
El problema creado por la limitada anchura de los picos de absorción atómica se
ha resuelto empleando fuentes de líneas con anchura de banda aún más
estrechas que los picos de absorción. Por ejemplo, si se elige la línea del sodio de
589,6 nm para el análisis de absorción de este elemento, se utiliza la radiación
correspondiente a un pico de emisión del sodio a esta misma longitud de onda.
En este caso, la línea se produce con el empleo una lámpara de vapor de sodio
en la que los átomos de sodio se excitan con una descarga eléctrica para
inmediatamente después emitir radiación electromagnética correspondiente a la
longitud de onda del sodio, la cual es absorbida en la zona de la llama u horno de
grafito por los átomos de sodio que forman parte de la nube atómica de la
muestra.
Dicho de forma más simple, en espectrometría de absorción atómica se emplean
fuentes de radiación construidas del mismo elemento que se desea analizar con
vistas a garantizar la emisión de radiación monocromática correspondiente a la
longitud de onda de absorción del analito. Para tal propósito se construyen las
llamadas lámparas de cátodo hueco.
Lámparas de cátodo hueco
La fuente más común para las medidas de absorción atómica es la lámpara de
cátodo hueco, como la que se muestra en la figura 4.8. Ese tipo de lámpara
consiste en un ánodo de wolframio y un cátodo cilíndrico cerrados
herméticamente en un tubo de vidrio lleno con gas neón o argón a una presión

de 1 a 5 torr. El cátodo está construido con el metal que se desea analizar, o

bien, sirve de soporte para una capa de dicho metal.
Figura 4.8. Sección transversal de una lámpara de cátodo hueco.
Cuando se aplica un potencial del orden de 300 V entre los electrodos se produce
la ionización del gas inerte, lo que da lugar a una corriente de aproximadamente
5 a 15 mA al tiempo que los iones y electrones migran hacia los electrodos. Si el
potencial es lo suficientemente grande, los cationes gaseosos adquieren la
suficiente energía cinética como para arrancar algunos de los átomos metálicos
de la superficie del cátodo y producir una nube atómica: a este proceso se le
denomina chisporroteo. Una parte de los átomos metálicos desprendidos se
encuentran en estado excitado y de este modo al volver al estado fundamental
emiten su radiación característica. Al final, los átomos metálicos se vuelven a
depositar difundiendo de nuevo hacia la superficie del cátodo o hacia las paredes
de vidrio del tubo.
La configuración cilíndrica del cátodo tiende a concentrar la radiación en una
región limitada del tubo metálico: este diseño aumenta también la probabilidad
de que la redeposición sea en el cátodo más que sobre las paredes de vidrio.
La eficacia de la lámpara de cátodo hueco depende de su geometría y del
potencial aplicado. Los potenciales elevados y, por consiguiente, las corrientes
elevadas originan intensidades de radiación mayores. Esta ventaja se neutraliza
en parte por el hecho de que las corrientes mayores provocan un aumento del
número de átomos no excitados en la nube. Los átomos no excitados, a su vez,
son capaces de absorber la radiación emitida por los átomos excitados. Esta auto
absorción reduce la intensidad, sobre todo en el centro de la banda de emisión.
En el comercio existe una gran variedad de lámparas de cátodo hueco. En
algunos casos los cátodos están constituidos por una mezcla de varios metales,
lo que permite el análisis de más de un elemento.
De cualquier modo, un inconveniente de esta técnica de absorción atómica es la
necesidad de utilizar una lámpara diferente para el análisis de cada elemento.
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Modulación de la fuente
En un instrumento de absorción atómica típico es necesario eliminar las
interferencias producidas por la emisión de radiación de la llama. La mayor parte
de la radiación que emite la llama se elimina mediante el monocromador. Sin
embargo, la radiación emitida correspondiente a la longitud de onda seleccionada
por el monocromador está inevitablemente presente en la llama, debido a la
excitación y emisión de los átomos del analito. A fin de eliminar los efectos de la
emisión en la llama, es necesario modular la salida de la fuente para que su
intensidad oscile a una frecuencia constante. De este modo, el detector recibe
dos tipos de señal, una alterna, proveniente de la fuente y otra continua que
proviene de la llama. Estas señales se convierten en las correspondientes
respuestas eléctricas. Para eliminar la señal de corriente continua no modulada y
dejar pasar la señal de corriente alterna para su amplificación, se puede utilizar
un simple dispositivo electrónico conocido como filtro RC de paso alto cuya
descripción y funcionamiento no es objetivo de este texto.
Otra forma sencilla y muy efectiva de modular la emisión de la fuente es
interponer en el haz, entre la fuente y la llama, un disco metálico circular, o
cortador, al que de forma alterna se le han eliminado cuadrantes para permitir el
paso de luz. La rotación del disco a velocidad constante y conocida proporciona
un haz intermitente cortado a la frecuencia deseada. Como alternativa, el
alimentador de la fuente puede diseñarse para funcionar con corriente alterna o
de manera intermitente, para que la fuente se encienda y se apague a una
frecuencia constante deseada.
4.4. INTERFERENCIAS EN ESPECTROSCOPIA DE ABSORCIÓN ATÓMICA

En los métodos de absorción atómica se presentan dos tipos de interferencias:
las interferencias espectrales y las interferencias químicas. Las interferencias
espectrales se producen cuando la absorción o emisión de una especie
interferente se solapa o aparece muy próxima a la absorción o emisión del
analito, de modo que su resolución por el monocromador resulta imposible. Las
interferencias químicas se producen como consecuencia de diversos procesos
químicos que ocurren durante la atomización y que alteran las características de
absorción del analito.
4.4.1. Interferencias espectrales
Dado que las líneas de emisión de las fuentes de cátodo hueco son muy
estrechas, es rara la interferencia debida a la superposición de las líneas. Para
que exista esta interferencia, la separación entre las dos líneas tendría que ser
menor de aproximadamente 0.1 A.
Por ejemplo, la línea del vanadio a 3082,11 A interfiere en los análisis en que
está involucrada la línea de absorción del aluminio a 3082,15 A. Sin embargo,
esta interferencia se evita fácilmente utilizando la línea del aluminio a 3092,7 A
en lugar de aquélla.
Las interferencias espectrales también se producen debido a la presencia de

productos de combustión que poseen bandas de absorción anchas, o de
productos en forma de partículas que dispersan la radiación. Ambos disminuyen
la potencia del haz transmitido y dan lugar a errores analíticos positivos.
Cuando la procedencia de estos productos es la mezcla de combustible y
oxidante se puede realizar fácilmente la corrección midiendo la absorbancia de
un blanco pero cuando la absorción o dispersión se debe a la matriz de la
muestra, entonces el problema es más complicado.
En este caso, la potencia del haz transmitido, Pt, se reduce por la presencia de
los componentes de la matriz, mientras que la potencia del haz incidente. P0 no
resulta afectada; por ello, se produce un error positivo en la absorbancia y por
consiguiente, en la concentración. Un ejemplo de una posible interferencia de
matriz debida a la absorción, se produce en la determinación de bario en mezclas
de elementos alcalinotérreos, como por ejemplo CaOH que actúa como
interferencia de absorción. En este caso en particular, se elimina fácilmente la
interferencia sustituyendo el aire por óxido nitroso como oxidante, que produce
una llama de mayor temperatura capaz de descomponer el CaOH y eliminar su
absorción.
La interferencia espectral debida a la dispersión por los productos de la
atomización se produce más frecuentemente cuando se aspiran en la llama
disoluciones concentradas que contienen elementos tales como Ti, Zr y W, que
forman óxidos refractarios. En estos casos se forman partículas de óxidos
metálicos, cuyos diámetros son mayores que la longitud de onda de la luz, lo que
origina una dispersión del haz incidente. La interferencia debida a la dispersión
también puede ser un problema cuando la muestra contiene especies orgánicas o
cuando se utilizan disolventes orgánicos para disolver la muestra. En este caso,
la combustión incompleta de la matriz orgánica deja panículas carbonosas que
son capaces de dispersar la luz.
Afortunadamente, en la atomización con llama, las interferencias espectrales que
provienen de los componentes de la matriz no siempre se producen y con
frecuencia se pueden evitar modificando los parámetros analíticos, como la
temperatura y la relación combustible/oxidante. De una forma alternativa, si se
conoce la causa de la interferencia, se puede añadir un exceso de la sustancia
interferente tanto a la muestra como a los patrones. Si el exceso añadido a la
muestra patrón es grande con respecto a su concentración en la matriz de la
muestra, la contribución de esta última será insignificante. La sustancia añadida
se denomina a veces amortiguador de radiación.
4.4.2. Interferencias químicas
Las interferencias químicas son más comunes que las espectrales.
Frecuentemente sus efectos pueden minimizarse escogiendo las condiciones de
trabajo adecuadas.
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Existen evidencias teóricas y experimentales que indican que muchos de los

procesos que suceden en el seno de la llama están próximos al equilibrio.
Consecuentemente, es posible considerar a los gases que se queman como un
medio disolvente, al que se puede aplicar cálculos termodinámicos. Los
equilibrios de mayor interés son la formación de compuestos de baja volatilidad,
las reacciones de disociación y las de ionización.
Formación de compuestos poco volátiles
EI tipo más común de interferencia es probablemente el producido por aniones
que forman compuestos de baja volatilidad con el analito y reducen así su
velocidad de atomización: lo que origina resultados menores que los esperados.
Como ejemplo puede citarse la disminución de la absorbancia del calcio
observada a medida que aumenta la concentración de sulfato o fosfato. Así, para
una concentración fija de calcio, la absorbancia disminuye de forma casi lineal
con el aumento de las concentraciones de sulfato o fosfato hasta que la relación
anión/calcio es de aproximadamente 0,5; en estas condiciones la absorbancia es
aproximadamente del 30 al 50 % de su valor original y se hace independiente de
la concentración del anión.
También se han encontrado ejemplos de interferencias de cationes. Así, el
aluminio hace disminuir los resultados en la determinación de magnesio,
aparentemente como consecuencia de la formación de un compuesto
termoestable de aluminio y magnesio (quizás un óxido).
En muchas ocasiones pueden eliminarse o atenuarse las interferencias debidas a
la formación de especies poco volátiles aumentando la temperatura. También se
pueden emplear agentes liberadores, que son cationes que reaccionan
preferentemente con la interferencia e impiden su interacción con el analito. Por
ejemplo, la adición de un exceso de iones estroncio o lantano minimiza la
interferencia del fosfato en la determinación del calcio. Estas mismas especies
químicas se han utilizado también como agentes liberadores para la
determinación del magnesio en presencia de aluminio. En algunos casos el
estroncio o el lantano reemplazan al analito en los compuestos que forma con la
especie interferente.
Los agentes protectores impiden las interferencias formando con él analito
especies estables volátiles. Existen tres reactivos que por lo general se utilizan
con este fin, son el EDTA, la 8-hidroxiquinolina y cl APDC (la sal de amonio del
ácido l-pirrolidinacarboditioico. Se ha demostrado que la presencia del EDTA
elimina las interferencias del aluminio, silicio, fosfato y sulfato en la
determinación del calcio. De manera semejante, la 8-hidroxiquinolina elimina la
interferencia del aluminio en la determinación del calcio y del magnesio.
Equilibrios de disociación
En el medio gaseoso y caliente de una llama o de un horno, numerosas
reacciones de disociación y asociación provocan la conversión de los
constituyentes metálicos a su estado elemental. Parece probable que al menos

algunas de estas reacciones sean reversibles y que se les pueda aplicar las leyes
de la termodinámica. En consecuencia, debería ser posible formular equilibrios
como
MO = M + O
M(OH)2 = M + 2OH
donde M representa los átomos del analito.
En la práctica, no se conoce lo suficiente sobre la naturaleza de las reacciones
químicas que suceden en la llama como para realizar un tratamiento cuantitativo
similar al que se hace en disolución acuosa. En su lugar, debe confiarse en las
observaciones empíricas.
Las reacciones de disociación en las que intervienen óxidos e hidróxidos
metálicos juegan un papel importante en la determinación de la naturaleza de los
espectros de emisión o absorción de un elemento. Por ejemplo, los óxidos de los
elementos alcalinotérreos son relativamente estables, con energías de
disociación mayores de 5 eV. Las bandas moleculares que se producen por la
presencia de óxidos o hidróxidos metálicos en la llama constituyen una
característica importante de sus espectros. Excepto a temperaturas muy altas,
estas bandas son más intensas que las líneas de los átomos o iones. Por el
contrario, los óxidos e hidróxidos de los metales alcalinos se disocian mucho más
fácilmente, por lo que las intensidades de las líneas de estos elementos son
elevadas. Incluso a temperaturas relativamente bajas.
Por otra parte, parece probable que los equilibrios de disociación en los que
intervienen aniones distintos del oxígeno puedan tener también influencia en la
absorción y emisión de llama. Por ejemplo, la intensidad de la línea del sodio se
reduce notablemente por la presencia de HCl. Una posible explicación es que los
átomos de cloro que se forman a partir del HCl añadido disminuyen la
concentración de átomos de sodio y por tanto la intensidad de la línea.
Equilibrios de ionización
En las mezclas de combustión que contienen aire como oxidante, la ionización de
los átomos y moléculas es pequeña y, por lo general, puede despreciarse. Sin
embargo, en las llamas de temperaturas más elevadas en las que el oxidante es
el oxígeno o el óxido nitroso, la ionización es más importante, y hay una
concentración notable de electrones libres como consecuencia del equilibrio
M = M+ +e-
donde M representa a un átomo o molécula neutros y M + a su ion.
La presencia de tales equilibrios entre iones y átomos en las llamas tiene algunas
consecuencias importantes en la espectroscopia de llama, Por ejemplo, la
intensidad de las líneas de absorción o emisión atómicas de los metales alcalinos,
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en particular del potasio, rubidio y cesio, está afectada de forma compleja por la
temperatura. Las temperaturas elevadas provocan un aumento de la población
de átomos excitados, sin embargo, contrarrestando este efecto, hay una
disminución de la concentración de átomos como resultado de la ionización. Por
tanto, en determinadas circunstancias, en las llamas más caloríficas se puede
observar una disminución de la absorción o emisión. Por esta razón, suelen
utilizarse temperaturas de excitación más bajas para el análisis de los metales
alcalinos.
Los efectos de los desplazamientos de los equilibrios de ionización con frecuencia
se pueden eliminar con la adición de un supresor de ionización, el cual
proporciona una concentración relativamente alta de electrones en la llama y
como consecuencia se suprime la ionización del analito.
4.5. TÉCNICAS ANALÍTICAS DE ABSORCIÓN ATÓMICA

4.5.1. Preparación de la muestra
Una desventaja de los métodos espectroscópicos de llama es el requisito de que
la muestra se ha de introducir en disolución, por lo general acuosa.
Desafortunadamente, muchos materiales de interés, tales como suelos, tejidos
animales, plantas, derivados del petróleo y minerales, no son directamente
solubles en los disolventes habituales, y con frecuencia requieren un tratamiento
previo laborioso para obtener una disolución del analito adecuada para la
atomización. De hecho, las etapas de descomposición y disolución a menudo
consumen más tiempo e introducen más errores que la propia medida
espectroscópica.
La descomposición de materiales como los citados requiere por lo general
tratamientos drásticos de la muestra a altas temperaturas con la consiguiente
pérdida potencial de analito por volatilización o en forma de aerosoles en el
humo. Además, los reactivos utilizados en la descomposición de la muestra, con
frecuencia introducen los tipos de interferentes químicos y espectrales que se
han discutido anteriormente, y por otra parte el analito puede estar presente en
estos reactivos como una impureza. De hecho, si no se tiene mucho cuidado, no
es extraño encontrar en el análisis de trazas que los reactivos introduzcan más
elementos de interés que las propias muestras, una situación que puede conducir
a serios errores incluso con correcciones del blanco.
De cualquier manera, en general el objetivo central de la etapa de preparación
de la muestra es la eliminación del material orgánico, con vistas a que el mismo
no interfiera en el complejo proceso de formación de átomos neutros en la llama
o en el horno.
Los métodos que con mayor frecuencia se emplean en el proceso de preparación
de la muestra son los siguientes:

Descomposición seca: Consiste en la descomposición de la muestra por

incineración en mufla a altas temperaturas (500 – 550 ºC) y posterior disolución
de las cenizas obtenidas en ácidos fuertes.
Digestión húmeda: Consiste en el tratamiento de la muestra con ácidos
minerales en caliente, generalmente ácido sulfúrico, nítrico o perclórico, los
cuales oxidan la materia orgánica resultando una disolución contentiva del
material inorgánico.
Digestión por interacción con microondas: La muestra es mezclada con
ácidos minerales u oxidantes fuertes y se introduce en un horno de microondas.
La energía de la radiación de microondas interactúa con la muestra y ocurre
digestión de la materia orgánica.
Sonicación: La muestra mezclada con ácidos fuertes se coloca en un baño de
ultrasonido. Hay formación de OH* y de H2O2 ocurriendo digestión de la materia
orgánica.
Debe señalarse que en algunas ocasiones se realiza la atomización directa de la
muestra sin previo tratamiento como es el caso de la determinación de cobre en
cerveza, determinación de cobre y zinc en vinagres, determinación de hierro y
aluminio en aguas, entre otros. De modo general puede prescindirse de la etapa
de preparación de la muestra cuando se analizan matrices de bajo contenido de
materia orgánica, siempre y cuando se tenga garantía de la no existencia de
interferencias en la llama.
Una de las ventajas de la atomización electrotérmica es que algunos materiales
pueden atomizarse directamente evitando de esta manera la etapa de disolución.
Por ejemplo, las muestras líquidas como sangre, derivados del petróleo y
disolventes orgánicos pueden pipetearse y transferirse directamente al homo
para su calcinación y atomización. Las muestras sólidas, como hojas de plantas,
tejidos animales o algunas sustancias inorgánicas, pueden pesarse directamente
en atomizadores tipo cubeta o en navecillas de tántalo para su introducción en
hornos tipo tubo. Sin embargo, por regla general, la calibración es difícil y
requiere de patrones que se aproximen a la composición de la muestra.
4.5.2. Análisis Cualitativo
La aplicación de la espectrometría de absorción atómica (EAA) en la identificación
de elementos metálicos se encuentra limitada por la necesidad instrumental de
utilizar una lámpara de cátodo hueco construida del mismo metal que se analiza.
Este hecho imposibilita la identificación de varios elementos simultáneamente en
una misma muestra, por cuanto resulta obligado cambiar la lámpara cada vez
que se analice un elemento en particular.
No obstante, la EAA puede utilizarse como método corroborativo si se desea
conocer la presencia de unos pocos metales en particular, siempre y cuando se
posean las lámparas adecuadas.
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4.5.3. Análisis Cuantitativo

Las aplicaciones fundamentales de la EAA se encuentran precisamente en el
análisis cuantitativo. Los métodos más empleados para estos fines son las curvas
de calibración (ver epígrafe 3.7.2.2), el método del patrón externo (ver epígrafe
3.7.2.1) y el método de adición de patrón.
Curvas de calibración y patrón externo
En teoría, la absorción atómica debería cumplir la ley de Lambert Beer, siendo la
absorbancia directamente proporcional a la concentración. Sin embargo, se
encuentran con frecuencia desviaciones de la linealidad, y es arriesgado realizar
un análisis por absorción atómica sin determinar experimentalmente si existe o
no una relación lineal. Por consiguiente, se debería preparar periódicamente una
curva de calibrado que cubra el intervalo de concentraciones correspondiente a la
muestra. Además, en la atomización y en la medida de la absorbancia existen un
gran número de variables incontrolables que justifican la medida de una
disolución patrón cada vez que se realiza un análisis. Es por ello que el método
del patrón externo solo se emplea cuando se tiene la certeza del cumplimiento
de la ley de Lambert Beer.
Método de la adición de patrón
El método de la adición de patrón, se utiliza ampliamente en espectroscopia de
absorción atómica con objeto de contrarrestar parcialmente o por completo las
interferencias químicas y espectrales introducidas por la matriz de la muestra.
El método de la adición patrón es especialmente útil para analizar muestras
complejas en las que la probabilidad de que se produzcan efectos debidos a la
matriz es considerable.
En este método varias alícuotas idénticas Vx de la disolución de muestra
problema con una concentración cx desconocida, se transfieren a matraces
aforados de volumen Vt. A cada uno de ellos, se le añade un volumen variable y
creciente (Vp) de una disolución patrón de referencia del analito que tiene una
concentración exactamente conocida y luego se enrasan los matraces hasta el
aforo. De esta forma se obtienen diferentes soluciones que contienen la misma
cantidad de muestra y concentraciones crecientes y exactamente conocidas del
patrón de referencia del analito. Debe señalarse que a una de las réplicas de la
solución de muestra problema no se le añade patrón de referencia. Con
posterioridad se atomizan en el equipo cada una de las disoluciones por separado
y se obtienen las señales de absorbancia correspondientes. La figura 4.9 ilustra
este procedimiento.
Una vez realizadas las lecturas de absorbancia se obtiene un juego de datos de
concentración de los patrones de referencia (PR) del analito vs. sus respectivos
valores de absorbancia (tabla 4.2). Obviamente el valor más pequeño de
absorbancia se corresponderá con la disolución de muestra problema a la cual no
se ha adicionado patrón de referencia y a partir de este valor, las restantes
lecturas irán incrementándose en la medida en que se incrementa la cantidad de

patrón de referencia añadido.
Figura 4.9. Procedimiento de preparación y lectura de una curva de adición de patrón.
Tabla 4.2. Juego de datos obtenidos una vez determinada la señal de cada disolución.
Concentración de PR Absorbancia
0 Am(1)
C1 A1
C2 A2
C3 A3
C4 A4
Am(1): Absorbancia de la disolución de muestra

problema sin adición de patrón de referencia
Los resultados experimentales obtenidos se procesan mediante regresión lineal

simple con ayuda del método de los mínimos cuadrados para obtener la ecuación
de regresión y = mx + a
Resulta evidente que en el caso de una curva de adición de patrón el intercepto
de la recta de regresión (a) no parte de cero, por cuanto el primer punto de la
curva correspondiente a cero concentraciones del patrón (y, por lo tanto, el valor
del intercepto (a) es precisamente el valor de absorbancia de la disolución de
muestra problema Am sin adición de patrón de referencia (tabla 4.2 y figura
4.10a)
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Figura 4.10. (a) Comportamiento gráfico de una curva de adición de patrón,

(b) Extrapolación de la curva hacia la zona negativa del eje x para el cálculo
de la concentración de la disolución de muestra problema c M.
Para el cálculo de la concentración de la disolución de la muestra problema c M a

partir del gráfico de regresión, se extrapola la recta hacia el eje “x” y el módulo
del valor resultante |cM| cuando la recta toque el eje negativo “x” es la
concentración de la disolución de muestra problema (figura 4.10b).
Obviamente, en la práctica no se emplea este método gráfico sino que se hace
uso de la ecuación de regresión obtenida. La figura 4.10b muestra que al valor
del módulo de la concentración de la muestra |c M| obtenida por extrapolación le
corresponde un valor de absorbancia igual cero. De ahí que al emplear la
ecuación de regresión se sustituye “y” por el valor cero y despejando se calcula
la concentración de la muestra problema, es decir:
y = mx + a
donde: y= 0
m es la pendiente
a es el intercepto, cuyo valor debe ser muy cercano a la absorbancia de la
muestra
x es la concentración de la muestra (su valor modular)
despejando entonces quedaría:
0−𝑎
𝑥= | |
𝑚
Para comprobar el ajuste del modelo de regresión a los datos experimentalmente
obtenidos, con vistas a conocer la confiabilidad de los resultados obtenidos de la
ecuación de regresión se realizan las pruebas estadísticas explicadas en el
epígrafe 3.7.2.2, las cuales son válidas para el caso de una curva de calibración y
de una curva de adición de patrón.
Un resumen de estas pruebas, así como su interpretación práctica para estos
métodos ce cuantificación se relaciona en la tabla 4.3.

Tabla 4.3.
Parámetros estadísticos a considerar para verificar el ajuste del modelo a los resultados
experimentales en una curva de calibración y en una curva de adición de patrón.
Parámetros Resultados que expresan Significado práctico de los parámetros

estadísticos el ajuste del modelo estadísticos calculados
Cercano al valor 1 Curva de calibración y Adición de
En la práctica científica se patrón: Expresa linealidad. Indica la
Coeficiente de proporción entre el error explicado por la
plantea que para métodos
determinación (R2) regresión con respecto al error total.
espectrofotométricos R2 debe
ser ≥ 0,99
Curva de calibración y Adición de
Anova simple de la patrón: Expresa linealidad. Indica la
Significativo
regresión proporción entre el error explicado por la
regresión con respecto al error no explicado.
Curva de calibración y Adición de
patrón: Expresa la variación significativa de
Prueba de hipótesis la señal analítica (Absorbancia,
Pendiente significativa
para la pendiente Transmitancia, Fluorescencia, etc.) con el
incremento de la concentración de los
patrones de referencia.
Curva de calibración: La significación se
calcula con respecto a cero. Expresa que la
recta parte del origen, es decir, que el
intercepto es estadísticamente igual a cero.
Prueba de hipótesis
Intercepto no significativo Adición de patrón: La significación se
para el intercepto
calcula con respecto al valor de absorbancia
de la muestra (Am). Expresa que la recta
parte del valor de Am, es decir, que el
intercepto es estadísticamente igual a Am.
4.6. APLICACIONES DE LA ESPECTROMETRÍA DE ABSORCIÓN ATÓMICA

La espectrometría de absorción atómica constituye un medio sensible para la
determinación cuantitativa de más de 60 elementos metálicos o metaloides. Las
líneas de resonancia de los elementos no metálicos se localizan en general por
debajo de los 200 nm y sólo es posible su determinación con espectrofotómetros
que operan al vacío.
Límites de detección
En la tabla 4.4 se indican los límites de detección por absorción atómica de llama
y electrotérmica para algunos de los elementos más comunes.
Para muchos elementos, los límites de detección en espectroscopia de absorción
atómica de atomización con llama se encuentran en el intervalo de 1 a 20 ng/mL
o 0.001 a 0.020 ppm; con atomización electrotérmica los valores
correspondientes son 0.002 a 0.01 ng/mL o 2 x 10-6 a 1 x 10-5 ppm En algunos
casos se hallan límites de detección muy alejados de estos intervalos.
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Tabla 4.4.
Límites de detección para algunos elementos en atomización por llama y atomización
electrotérmica.
Límite de detección (ng/mL)

Elemento
EAA por llama EAA electrotérmica
Aluminio 30 0,005
Arsénico 100 0,02
Calcio 1 0,02
Cadmio 1 0,0001
Cromo 3 0,01
Cobre 2 0,002
Hierro 5 0,005
Mercurio 500 0,1
Magnesio 0,1 0,00002
Manganeso 2 0,0002
Molibdeno 30 0,005
Sodio 2 0,0002
Níquel 5 0,02
Plomo 10 0,002
Estaño 20 0,1
Vanadio 20 0,1
Zinc 2 0,00005
Exactitud
En condiciones normales, el error relativo asociado con el análisis de absorción
con llama es del orden del 1 al 2 %. Cuando se toman precauciones especiales
esta cifra se puede reducir a unas pocas décimas por cien. Por lo general, los
errores que se obtienen con la atomización electrotérmica son de 5 a 10 veces
mayores que los de la atomización con llama.
4.6.1. Aplicaciones en el análisis de los alimentos
La espectrometría de absorción atómica presenta múltiples aplicaciones en la
determinación de un gran número de elementos minerales en los alimentos
constituyendo una poderosa herramienta para el análisis cuantitativo.
La cuantificación de minerales en los alimentos reviste gran importancia debido a
que estos micronutrientes desempeñan importantes funciones nutricionales y por
otra parte otros pueden resultar tóxicos a determinadas concentraciones.

Así por ejemplo, metales como el calcio (Ca), magnesio (Mg), hierro (Fe), fósforo
(P), cobalto (Co), cromo (Cr), silicio (Si) y vanadio (V) son inocuos a las
concentraciones habituales en que se encuentran en los alimentos, sin embargo
el sodio (Na), potasio (K), flúor (F), cobre (Cu), zinc (Zn), manganeso (Mn),
molibdeno (Mb), níquel (Ni), selenio (Se), litio (Li) y germanio (Ge), si bien son
inocuos a bajas concentraciones, un exceso de los mismos debido a fenómenos
de contaminación pueden ser perjudiciales para la salud.
Un grupo particularmente importante es aquel que incluye metales tóxicos aun
en muy bajas concentraciones por lo es necesario realizar un estricto control de
su presencia en los alimentos. Tal es el caso del mercurio (Hg), plomo (Pb),
cadmio (Cd), estaño (Sn), tantalio (Ta) y arsénico (As), entre otros.
La presencia de minerales en los alimentos puede deberse a múltiples factores,
entre los que pueden citarse:
• La composición natural de los alimentos naturales y elaborados: En los
primeros, el contenido de minerales está influenciado por la variedad, la
especie, la alimentación animal y la composición de los suelos de cultivo,
entre otros factores. En el caso de los alimentos elaborados el aporte mineral
de los ingredientes utilizados en las formulaciones es el factor más
importante.
• La contaminación no deseada de productos naturales y elaborados: En este
caso la contaminación ambiental y las malas prácticas agroquímicas son la
principal fuente de contaminación de los alimentos naturales, en tanto la
contaminación durante los procesos de elaboración y el tránsito de los
metales del envase a los productos constituyen las vías más usuales de
adulteración de los productos elaborados.
En la tabla 4.5, se relacionan algunas aplicaciones de la espectrometría de
absorción atómica (EAA) en el análisis de alimentos
Tabla 4.5. Algunas aplicaciones de la EAA en el análisis de alimentos.
Preparación de la
Elemento Alimento Sistema de atomización  trabajo
muestra
Aluminio Aguas Aspiración directa Horno de grafito 309,3 nm
Aguas Aspiración directa Horno de grafito
Vinos Descomposición seca Llama

Hierro 248,3 nm
Lácteos Descomposición seca Llama
Cárnicos Descomposición seca Llama
Manganeso Aguas Aspiración directa Horno de grafito 279,5 nm
Aguas Aspiración directa Llama Aire-Acetileno

Cobre 324,7 nm
Cereales Descomposición seca Llama Aire-Acetileno
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Preparación de la
Elemento Alimento Sistema de atomización  trabajo
muestra
Cervezas Aspiración directa Llama Aire-Acetileno
Vinos Descomposición seca Llama Aire-Acetileno
Rones Descomposición seca Llama Aire-Acetileno
Aguas Aspiración directa Llama Aire-Acetileno
Cervezas Aspiración directa Llama Aire-Acetileno
Zinc Vinos Descomposición seca Llama Aire-Acetileno 213,8 nm
Vinagres Aspiración directa Llama Aire-Acetileno
Cereales Descomposición seca Llama Aire-Acetileno
Vinos Descomposición seca Llama Aire-Acetileno

Plomo 283 nm
Cárnicos Descomposición seca Llama Aire-Acetileno
Llama óxido nitroso-

Vinos Digestión húmeda
acetileno
Estaño 286 nm
Llama óxido nitroso-
Cárnicos Digestión húmeda
acetileno
Cadmio Arroz Digestión húmeda Llama Aire-Acetileno 228,8 nm
un resumen del presente capítulo. Céntrese en la comparación de los
métodos de absorción molecular y absorción atómica.
2. Resuelva los ejercicios 4 y 5 que aparecen en el Capítulo 14 /
epígrafe 14.1. Ejercicios propuestos, así como el ejercicio 9 del
mismo epígrafe, centrándose en este último caso en el análisis de la
técnica 3 (Determinación de cobre en pastas alimenticias).
BIBLIOGRAFÍA
1. Analíticos en Alimentaria. Métodos Oficiales de Análisis. Aguas potables de
consumo público y aguas de bebidas envasadas. Ed. Panreac Química SA,
1999.
2. Analíticos en Alimentaria. Métodos Oficiales de Análisis. Carne y productos

cárnicos. Ed. Panreac Química SA, 1999
3. Analíticos en Alimentaria. Métodos Oficiales de Análisis. Cereales, derivados
de cereales y cerveza. Ed. Panreac Química SA, 1999
Madrid.
London.
9. Polo, J. C. (2009). Regresión lineal simple. Comunicación personal. Instituto
SA. Madrid.
Dykinson. Madrid.
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5 Espectrometría de emisión atómica
5.1. PRINCIPIOS GENERALES DE LA ESPECTROMETRÍA DE EMISIÓN

ATÓMICA
La espectroscopia de emisión atómica (también llamada EEA) es un método

instrumental de la Química Analítica que determina una gran variedad de
elementos metálicos, siendo capaz de detectar y determinar cuantitativamente la
mayoría de los elementos del sistema periódico. Sus campos de aplicación son,
por tanto, muy diversos. Se emplea en el análisis de aguas, análisis de suelos,
bioquímica, toxicología, medicina, industria farmacéutica, industria alimentaria,
industria petroquímica, etc.
En este caso la concentración del analito se determina a partir de las medidas
de potencia emitida (PE) por los átomos libres de un elemento en particular, a la
longitud de onda de emisión específica de este elemento. La conversión del
analito en átomos neutros se logra cuando la muestra es calentada en una llama,
un plasma, una chispa o un arco eléctrico (tabla 5.1).
Tabla 5.1. Tipos de atomizadores utilizados en espectroscopia de emisión atómica
Métodos de Temperatura de atomización

Tipo de atomizador
atomización característica (ºC)
Aspiración de la solución
Llama de la muestra dentro de 1700 - 3150
una llama.
Plasma de Argón de
acoplamiento inductivo (ICP) Muestra calentada en un
4000 - 6000
Plasma de Argón de corriente plasma de argón.
continua (DCP)
Muestra calentada en un
Arco eléctrico 4000 - 5000
arco eléctrico.
Muestra excitada en una
Chispa eléctrica 4000
chispa de alto voltaje.
A diferencia de la espectrometría de absorción atómica, en los métodos de

emisión atómica los atomizadores citados en la tabla 5.1 no sólo transforman los
componentes de las muestras en átomos o iones elementales sencillos, sino que
también, durante el proceso, excitan una parte de estas especies a estados
electrónicos superiores. La rápida relajación de las especies excitadas y su
regreso al estado fundamental va acompañada de la emisión de radiación
electromagnética y la producción de espectros de líneas ultravioleta y visible que
son útiles para el análisis cualitativo y cuantitativo de los elementos.
115
5. Espectrometría de emisión atómica
En resumen, la espectrometría de emisión atómica se basa en la emisión de

energía radiante de las zonas del UV o el Visible por átomos libres o neutros en
estado gaseoso, del elemento que se analiza, los cuales han sido previamente
excitados por energía térmica.
A fin de explicar los principios generales de la emisión atómica, partamos de los
componentes fundamentales de un equipo de emisión atómica y de los procesos
Los instrumentos para espectrometría de emisión atómica (EEA) constan de
manera general de un sistema de atomización de la muestra, consistente en una
llama, un plasma de argón, un arco o una chispa eléctrica, un selector de
longitud de onda, un detector y un procesador de la señal y de la lectura de
salida.
La muestra, convenientemente preparada y generalmente en disolución, es
introducida en el sistema de atomización en el cual, por acción de las altas
temperaturas, se vaporiza el disolvente, se disocian las moléculas y se
convierten en átomos libres correspondientes a todos los elementos presentes
inicialmente en ella.
Como ya se ha mencionado, en espectrometría de emisión atómica no se
requiere de una fuente de radiación externa sino que el sistema de atomización
es a la vez la fuente de excitación. Así, los átomos en estado de vapor se excitan
por la energía térmica producida por la llama, el plasma, el arco o la chispa y al
desexcitarse, emiten radiación electromagnética de potencia P E a una longitud de
onda característica.
La potencia emitida PE llega a un selector de longitud de onda en el que se ha
seleccionado la longitud de onda correspondiente a la línea de emisión del
elemento que se desea determinar. La función de este dispositivo es eliminar las
interferencias producidas por la emisión del resto de los elementos presentes en
la muestra que se encuentran excitados en el sistema de atomización, dejando
pasar únicamente la línea de emisión correspondiente a la longitud de onda del
analito.
A continuación del selector de longitud de onda se coloca un detector,
generalmente un tubo fotomultiplicador, capaz de transformar, en relación
proporcional, las señales de potencia de radiación electromagnética emitida en
señales eléctricas o de intensidad de corriente, las cuales llegan al procesador de
señal, que es por lo general un dispositivo electrónico que amplifica la señal
eléctrica generada por el detector y registra el valor de potencia emitida PE. De
forma análoga a lo explicado para los procesadores de señales en absorción
molecular y atómica, en la actualidad el registro de la señal de PE se acopla a
sistemas computarizados que con ayuda de potentes software almacenan la
información y realizan cálculos cuantitativos entre otras funciones.
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La figura 5.1 muestra un esquema general del equipo y de los procesos

Figura 5.1. Componentes básicos y procesos en un espectrómetro de emisión atómica
Históricamente, la espectroscopia de emisión atómica requería la atomización y

excitación mediante llama, arco eléctrico y chispa eléctrica. Estos métodos
todavía tienen aplicaciones importantes para el análisis de elementos metálicos.
Sin embargo, actualmente las fuentes de plasma se han convertido en las más
importantes y más ampliamente utilizadas en espectrometría de emisión
atómica, en especial las fuentes de plasma de acoplamiento inductivo.
La espectrometría de emisión de plasma, arco y chispa ofrece varias ventajas
con respecto a los métodos de absorción de llama y electrotérmico considerados
en el capítulo 4. Entre sus ventajas está la menor interferencia entre elementos,
que es una consecuencia directa de sus temperaturas más elevadas. En segundo
lugar, se obtienen buenos espectros de emisión para la mayoría de los elementos
en unas mismas condiciones de excitación; en consecuencia, se pueden registrar
simultáneamente espectros para docenas de elementos. Esta propiedad tiene
especial importancia en el análisis cualitativo multielemental de muestras muy
pequeñas. Desde este punto de vista, las fuentes de llama son menos
satisfactorias, porque las condiciones óptimas de excitación varían mucho de un
elemento a otro; se necesitan altas temperaturas para la excitación de algunos

elementos y bajas para otros; por último, la región de la llama que permite
obtener intensidades óptimas de la línea analítica es distinta de un elemento a
otro. Otra ventaja de las fuentes de plasma, más energéticas, es que permiten la
determinación de bajas concentraciones de elementos que tienden a formar
compuestos refractarios (es decir, compuestos que son muy resistentes a la
descomposición térmica, tales como óxidos de boro, fósforo. wolframio. uranio,
circonio y niobio). Además, las fuentes de plasma permiten la determinación de
no metales como cloro, bromo, yodo y azufre. Finalmente, los métodos con
fuentes de plasma tienen generalmente unos intervalos lineales de concentración
que abarcan varias decenas de órdenes de magnitud, a diferencia de los métodos
de absorción descritos en el capítulo anterior que sólo abarcan dos o tres
órdenes.
Los espectros de emisión obtenidos utilizando fuentes de plasma, arco o chispa
con frecuencia son más complejos, están constituidos por cientos, e incluso miles
de líneas. Esta cantidad de líneas, que es muy ventajosa cuando se busca
información cualitativa, aumenta la probabilidad de interferencias espectrales en
el análisis cuantitativo. Consecuentemente, la espectroscopia de plasma, arco y
chispa requiere equipos ópticos de mayor resolución y más caros que los de
absorción atómica de llama o electrotérmica.
A pesar de sus diversas ventajas, es poco probable que los métodos de emisión
que utilizan fuentes de alta energía desplacen por completo alguna vez a los
procedimientos de absorción atómica de llama y electrotérmicos. De hecho, los
métodos de absorción y emisión atómicos resultan ser complementarios. Entre
las ventajas de los procedimientos de absorción atómica se encuentran las de
requerir equipos más simples y menos caros, menores costos de operación, una
precisión algo mayor (al menos hasta el momento), y que para obtener
resultados satisfactorios no se necesita una gran habilidad por parte del
operador.
Teniendo en cuenta la importancia que revisten las diferentes fuentes de
excitación se profundizará a continuación en las características generales de
cada una de ellas.
5.2. ESPECTROSCOPIA DE EMISIÓN CON FUENTES DE PLASMA

Por definición un plasma es una mezcla gaseosa conductora de la electricidad
que contiene una concentración significativa de cationes y electrones (la
concentración de ambos es tal que la carga neta se aproxima a cero). En el
plasma de argón empleado frecuentemente en los análisis de emisión, los iones
de argón y los electrones son las principales especies conductoras, aunque los
cationes de La muestra también estén presentes en menor cantidad. Una vez
que se han formado los iones de argón en un plasma, son capaces de absorber la
suficiente energía de una fuente externa como para mantener la temperatura a
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un nivel tal que la posterior ionización sustente el plasma indefinidamente; así, la

temperatura puede llegar a ser de 10000 K.
Existen dos tipos de plasma de alta temperatura: el plasma de acoplamiento
inductivo (ICP) y el plasma de corriente
continua (DCP), los cuales serán tratados
con detalle a continuación.
5.2.1. La fuente de plasma de
acoplamiento inductivo
La figura 5.2 muestra un esquema de
una fuente típica de plasma de
acoplamiento inductivo denominada
antorcha. Consiste en tres tubos
concéntricos de cuarzo a través de los
cuales fluyen corrientes de argón.
Dependiendo del diseño de la antorcha,
la velocidad de consumo total de argón
es de 5 a 20 L/min. El diámetro del tubo
más grande es de aproximadamente 2.5
cm. Rodeando la parte superior de este
tubo se encuentra una bobina de
inducción refrigerada por agua, que está
alimentada por un generador de
radiofrecuencia capaz de producir una
potencia de 0.5 a 2 kW a unos 27 ó 41
Figura 5.2. Típica fuente de plasma de
MHz. La ionización del argón que fluye se
acoplamiento inductivo
inicia por medio de una chispa que
proviene de una bobina Tesla. Los iones resultantes y sus electrones asociados
interaccionan entonces con el campo magnético oscilante (indicado como H en la
figura 5.2) producido por la bobina de inducción. Esta interacción hace que los
iones y los electrones dentro de la bobina se muevan en trayectorias circulares,
representadas en la figura 5.2; el calentamiento óhmico es consecuencia de la
resistencia que presentan los iones y electrones a este movimiento.
La temperatura del plasma así formado es lo suficientemente elevada como para
hacer necesario el aislamiento térmico del cilindro exterior de cuarzo. Para
lograrlo, se hace fluir argón de forma tangencial alrededor de las paredes del
tubo, como indican las flechas en la figura 5.2; este flujo enfría las paredes
interiores del tubo central y centra el plasma radialmente.
Hay que considerar que el caudal de argón a través de una antorcha típica es lo
suficientemente elevado y supone un costo significativo (varios miles de dólares
al año).

Introducción de la muestra
Las muestras se introducen dentro de la antorcha mostrada en la figura 5.2
mediante un flujo de argón de 0,3 a 1,5 L/min a través del tubo central de
cuarzo. Las muestras se introducen en el flujo de argón generalmente en forma
de disoluciones y menos frecuentemente como una suspensión de un polvo
finamente dividido en un líquido. Con frecuencia, la mayor fuente de ruido en un
método de ICP radica en la etapa de
introducción de la muestra.
Los dispositivos más utilizados para la
inyección de la muestra son los
nebulizadores neumáticos, los cuales
transforman el líquido en una fina niebla o
aerosol. La figura 5.3 ilustra una típica
disposición del mismo. En este caso, la
muestra se nebuliza mediante un
nebulizador de flujo cruzado con una
comente de argón, y las gotitas finamente
divididas resultantes se introducen dentro
del plasma.
Otro método para la introducción de
muestras líquidas y sólidas en un plasma
es la vaporización electrotérmica. En este
caso. La muestra se vaporiza en un horno
similar a los descritos para la atomización Figura 5.3. Típico nebulizador
electrotérmica en epígrafe 4.2.2. Sin neumático para la inyección de la
muestra en una fuente de plasma.
embargo para las aplicaciones de plasma,
el horno se utiliza únicamente para La introducción de la muestra y no para la
atomización de la muestra. La vaporización se produce sobre una barra de grafito
abierta y a continuación el vapor se conduce hasta la antorcha de plasma
mediante un flujo de argón. La vaporización electrotérmica acoplada a una
antorcha de plasma ofrece las ventajas de los hornos electrotérmicos de poder
analizar micromuestras y de poseer bajos límites de detección, a la vez que
mantiene el amplio intervalo lineal de trabajo, la ausencia de interferencias y la
aptitud para el análisis multielemental del ICP.
Los dispositivos de introducción de muestras sólidas también son comercializados
por varios fabricantes de instrumentos de ICP. Con estos sistemas de
introducción de la muestra, la nube de vapor y partículas sólidas producida por la
interacción de la muestra con un arco eléctrico, una chispa eléctrica o un haz de
láser se transportan mediante un flujo de argón al interior de la antorcha, donde
posteriormente se producirá la atomización y excitación.
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Aspecto del plasma y espectros

Un plasma característico tiene un núcleo no transparente, blanco brillante y muy
intenso, coronado por una cola en forma de llama. El núcleo, que sobresale
algunos milímetros por encima del tubo, consiste en una emisión continua a la
que se superpone el espectro atómico del argón. El origen de la emisión continua
proviene aparentemente de la recombinación de los electrones con el argón y
otros iones. En la zona situada entre 10 y 30 mm por encima del núcleo, la
emisión continua se desvanece y el plasma es ópticamente transparente. Las
observaciones espectrales por lo general se hacen a una altura de 15 a 20 mm
por encima de la bobina de inducción. En esta zona la radiación de fondo está
libre de las líneas del argón y resulta adecuada para el análisis, Muchas de las
líneas analíticas más sensibles en esta zona del plasma provienen de iones, como
Ca+, Ca2+, Cd+, Cr2+ y Mn2+.
Atomización e ionización de los analitos
La figura 5.4 muestra las temperaturas en varias zonas del plasma. En el
momento en que los átomos de la muestra alcanzan el punto de observación
habrán permanecido unos 2 ms temperaturas comprendidas entre 4000 y 8000
K. Estos tiempos y temperaturas son aproximadamente dos o tres veces
mayores que los que se encuentran en las llamas de combustión más caloríficas
(acetileno-óxido nitroso) utilizadas en los métodos de llama. En consecuencia, la
atomización es más completa y hay menos problemas de interferencias químicas.
Sorprendentemente, los efectos de interferencia por ionización son pequeños o
inexistentes, debido probablemente a que La concentración de electrones que
provienen de la ionización del argón es grande, comparada con la que resulta de
la ionización de los componentes de la muestra.
Figura 5.4. Temperaturas en una fuente característica de plasma de acoplamiento

inductivo

Las fuentes de plasma presentan otras ventajas. Primero, la atomización se

produce en un medio inerte desde el punto de vista químico, lo que tiende a
aumentar el tiempo de vida del analito al evitar la formación de óxidos. Además,
y a diferencia del arco, la chispa y la llama, la temperatura en la sección
transversal del plasma es relativamente uniforme; como consecuencia no se
producen efectos de autoabsorción y autoinversión. Así pues, suelen obtenerse
curvas de calibrado lineales que cubren varios órdenes de magnitud de
concentración del analito.
5.2.2. La fuente de plasma de corriente continua
El plasma de corriente continua se describió por primera vez en los años veinte y
fue investigado sistemáticamente como fuente para la espectroscopia de emisión
durante varias décadas. Sin embargo, hasta los años setenta no se diseñó una
fuente de este tipo que pudiera competir con éxito con las fuentes de llama y de
plasma de acoplamiento inductivo en términos de reproducibilidad.
La figura 5.5 muestra el esquema de una fuente de plasma de corriente continua
comercial que resulta adecuada para la excitación de los espectros de emisión de
una gran variedad de elementos. Esta fuente de chorro de plasma consiste en
tres electrodos dispuestos en una configuración de “Y” invertida. Un ánodo de
grafito se localiza en cada brazo de la “Y” y un cátodo de wolframio en la base
invertida. El argón fluye desde los dos bloques anódicos hasta el cátodo. El
chorro de plasma se forma al contactar momentáneamente el cátodo con los
ánodos. Se ioniza el argón y se desarrolla una corriente (≈ 14 A) que genera
iones adicionales que mantienen la corriente indefinidamente. La temperatura en
el núcleo del arco es de unos 10000 K y en La zona de observación, de 5000 K.
La muestra se aspira dentro del área entre los dos brazos de la “Y”, donde se
atomiza, excita y examina.
Figura 5.5. Fuente de plasma de corriente continua de tres electrodos
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Los espectros producidos por un plasma de este tipo tienden a tener menos
líneas que los producidos por un plasma de acoplamiento inductivo, y las líneas
que aparecen provienen en su mayor parte de átomos más que de iones. La
sensibilidad que se consigue con el plasma de corriente continua cubre un
intervalo que va desde un orden de magnitud menor hasta aproximadamente la
misma que la que se alcanza con el plasma de acoplamiento inductivo. La
reproducibilidad de los dos sistemas es semejante. En el plasma de comente
continua se requiere bastante menos argón, y la fuente de alimentación auxiliar
es más sencilla y más barata. Por otra parte los electrodos de grafito se han de
sustituir cada pocas horas, mientras que la fuente de plasma de acoplamiento
inductivo requiere poco o ningún mantenimiento.
5.2.3. Aplicaciones de las fuentes de plasma
Las fuentes de plasma son ricas en líneas de emisión características, lo que hace
que sean útiles para el análisis elemental tanto cualitativo como cuantitativo.
Resulta incuestionable que las fuentes de plasma de acoplamiento inductivo y de
corriente continua proporcionan datos analíticos cuantitativos mucho mejores
que otras fuentes de emisión. La calidad de estos resultados radica en su gran
estabilidad, bajo ruido, poca radiación de fondo y la ausencia de interferencias
cuando se trabaja en unas condiciones experimentales apropiadas. Con respecto
a los límites de detección, el funcionamiento de la fuente de plasma de
acoplamiento inductivo es algo mejor que el de la fuente de plasma de corriente
continua. Sin embargo, esta última cuesta menos comprarla y mantenerla, y
para muchas aplicaciones analíticas resulta totalmente satisfactoria.
Preparación de la muestra
La espectroscopia de emisión de plasma de acoplamiento inductivo se utiliza
principalmente para el análisis cualitativo y cuantitativo de muestras que están
disueltas o en suspensión en disolventes acuosos u orgánicos. Los métodos para
La preparación de dichas disoluciones son similares a los descritos en el capítulo
4, epígrafe 4.5.1 para los métodos de absorción atómica de llama. Sin embargo,
con los de emisión de plasma, existe la posibilidad de analizar directamente
muestras sólidas utilizando procedimientos de vaporización electrotérmica.
Elementos susceptibles de determinación
En principio, se pueden determinar todos los elementos metálicos por
espectrometría de emisión de plasma. Para la determinación de boro, fósforo,
nitrógeno, azufre y carbono se necesita un espectrómetro de vacío, porque las
líneas de emisión de estos elementos se encuentran por debajo de 180 nm, zona
en que absorben los componentes atmosféricos. Su utilidad para el análisis de
metales alcalinos se encuentra limitada por dos razones: (1) las condiciones de
trabajo que pueden adaptarse para la determinación de la mayoría de los otros
elementos no son adecuadas para los metales alcalinos, y (2) las líneas más
intensas del Li, K, Rb y Cs se sitúan en longitudes de onda del infrarrojo cercano,

lo que conduce a problemas de detección en muchos espectrómetros de plasma

que están diseñados principalmente para la radiación ultravioleta. Debido a esta
clase de problemas, la espectroscopia de emisión de plasma generalmente se
limita a la determinación de aproximadamente 60 elementos.
Selección de la línea analítica
La mayoría de los elementos tienen varias líneas significativas que se pueden
utilizar para su identificación y cuantificación. En varias publicaciones se puede
encontrar, para más de 70 elementos, información sobre las líneas más
significativas, indicando su longitud de onda con tres cifras decimales y su
intensidad. Generalmente se puede encontrar una línea adecuada para la
determinación de cualquier elemento. La selección dependerá de los elementos
que se hallen en la muestra y de la posibilidad de solapamiento de líneas.
Análisis cualitativo
La espectrometría de emisión atómica con fuentes de plasma de argón tiene una
gran utilidad desde el punto de vista cualitativo superando en este aspecto a la
espectrometría de absorción atómica, por cuanto no es necesario emplear una
lámpara diferente para la identificación de cada elemento y por lo tanto pueden
realizarse identificaciones simultáneas haciendo un barrido a diferentes
longitudes de onda, con la consecuente obtención de un espectro de líneas
correspondientes a los diferentes elementos presentes en la muestra problema.
Análisis cuantitativo
Los procedimientos usados para el análisis cuantitativo son fundamentalmente
las curvas de calibración y las curvas de adición de patrón, ya explicados con
anterioridad en los epígrafes 3.7.2.2 (capítulo 3) y 4.5.3 (capítulo 4).
Las curvas de calibración o calibrado en espectrometría de emisión de plasma
consisten la mayoría de las veces en una representación gráfica de la intensidad
de corriente o de la tensión de salida del detector en función de la concentración
del analito.
Con frecuencia, las curvas de calibrado son lineales, sin embargo, se encuentran
desviaciones de la linealidad cuando se cubren intervalos grandes de
concentración. La principal causa de la no linealidad es la autoabsorción, en la
que la señal de salida disminuye como consecuencia de la absorción por parte de
átomos no excitados del medio. La autoabsorción sólo comienza a ser evidente a
elevadas concentraciones del analito y origina que la curva de calibrado se curve
hacia el eje de abscisas. La no linealidad surge también de correcciones de fondo
erróneas y de respuestas no lineales de los sistemas de detección.
Como en espectroscopia de absorción atómica, uno o más patrones deberían
introducirse periódicamente para corregir los efectos de deriva instrumental. De
forma general, la precisión se mejora cuando se miden concentraciones elevadas
de analito.
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En espectrometría de emisión se utiliza también con cierta frecuencia un tercer

procedimiento de cuantificación conocido como patrón interno.
El método del patrón interno consiste en añadir a todas las muestras, blancos y
patrones de referencia una cantidad fija de una sustancia que no esté presente
en la muestra la cual se denomina patrón interno. El patrón interno deberá dar
una señal similar a la del analito en la mayoría de los casos pero lo
suficientemente diferente como
para que ambas señales sean
claramente diferenciables por el
instrumento.
Una vez añadido el patrón interno
a la muestra y a los patrones de la
curva de calibración, se mide en el
equipo la potencia de la energía
radiante emitida PE por el analito
(y sus patrones de referencia), así
como la del patrón interno
presente en todas las disoluciones. Figura 5.6. Gráfico de calibración por el método
Estas lecturas pueden realizarse del patrón interno. PE (PR) es la potencia
emitida de los patrones de referencia y P (PI)
simultáneamente mediante un es la potencia emitida del patrón interno. E
sistema de detección binario o de
manera independiente por examen sucesivo a las longitudes de onda
correspondientes al analito y al patrón interno.
En este caso se obtiene un juego de valores de concentración de los patrones de
referencia vs. el cociente entre la señal de los patrones de referencia y la señal
del patrón interno. Estos datos se procesan por regresión lineal obteniéndose una
ecuación del tipo y= mx + a.
El cálculo de la concentración del analito se realiza sustituyendo “y” por el
cociente entre la señal del analito y la señal del patrón interno en la muestra. La
figura 5.6 muestra un típico gráfico obtenido por el método del patrón interno.
El tratamiento estadístico para comprobar el ajuste del modelo a los datos
experimentales es idéntico al explicado para una curva de calibración en el
epígrafe 3.7.2.2 (capítulo 3).
Si se elige y se usa adecuadamente un patrón interno, se pueden compensar
algunos errores aleatorios o sistemáticos. Así, si las señales del analito y del
patrón interno tienen una respuesta proporcional al error aleatorio instrumental y
a las fluctuaciones del método debido a que la relación entre dichas señales es
independiente de dichas fluctuaciones. Si ambas señales se modifican de la
misma forma por el efecto de la matriz, también se compensan en ambas dichos
efectos.

La mayor dificultad para aplicar el método del patrón interno es encontrar la

sustancia adecuada que sirva a estos efectos, así como para incorporarla a las
muestras y a los patrones de forma reproducible. Se debe asegurar la ausencia
de patrón interno en la matriz de la muestra de tal forma que la única
procedencia del patrón sea la cantidad añadida. Por ejemplo, el litio es un patrón
interno adecuado para las determinaciones de sodio o potasio en suero
sanguíneo, debido a que el comportamiento químico del litio es similar al de
ambos analitos pero no aparece de forma natural en la sangre.
Así, el método del patrón interno se utiliza, con frecuencia, para la determinación
de elementos traza en metales por espectroscopia de emisión.
Interferencias
En las fuentes de plasma, las interferencias químicas y de matriz son
significativamente menores que con otros atomizadores, tal como se ha
subrayado anteriormente. Sin embargo, a concentraciones bajas de analito, la
emisión de fondo debida a la recombinación de iones de argón con electrones es
lo suficientemente intensa como para requerir correcciones cuidadosas. Hoy en
día muchos instrumentos de espectrometría de emisión en plasma están
equipados con elementos ópticos que permiten realizar estas correcciones.
Límites de detección
Por lo general, los límites de detección obtenidos con la fuente de plasma de
acoplamiento inductivo son comparables o mejores que los que proporcionan
otros procedimientos espectrales atómicos. En la tabla 5.2 se comparan estos
límites con las de algunos de esos métodos. Es de destacar que para niveles de
diez partes por billón (ppb) o menos se pueden detectar más elementos
mediante excitación con plasma que con otros métodos de emisión o absorción.
Tabla 5.2. Comparación de los límites de detección de varios métodos espectrales
atómicos
Número de elementos detectados a una concentración de

Método
< 1 ppb 1–10 ppb 11–100 ppb 101–500 ppb > 500 ppb
Emisión atómica de plasma (ICP) 9 32 14 6 0

Emisión atómica de llama 4 12 19 6 19
Absorción atómica de llama 1 14 25 3 14
5.3. ESPECTROSCOPIA DE EMISIÓN CON FUENTES DE ARCO Y CHISPA

Las espectroscopias con fuentes de arco y de chispa fueron los primeros métodos
instrumentales más utilizados en el análisis. Estás técnicas, que empezaron a
sustituir en los años veinte a los métodos gravimétricos y volumétricos clásicos
para el análisis elemental, están basadas en la obtención mediante excitación del
espectro de emisión de los elementos por medio de arcos eléctricos o chispas
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eléctricas. Estos espectros permiten la determinación cualitativa y cuantitativa de

elementos metálicos en varios tipos de muestras, incluyendo metales,
aleaciones, suelos, alimentos, fármacos, minerales y rocas. Las fuentes de arco y
chispa todavía encuentran un uso considerable en análisis cualitativo y
semicuantitativo, sin embargo, en análisis cuantitativos han sido notablemente
desplazados por los métodos de plasma.
En las fuentes de arco y chispa, la excitación de la muestra se produce en el
pequeño espacio existente entre un par de electrodos. El paso de electricidad
entre los electrodos a través de este pequeño espacio proporciona la energía
necesaria para atomizar la muestra y producir átomos o iones en estado
electrónico excitado.
Actualmente, los métodos con fuentes de arco o de chispa se aplican
principalmente al análisis elemental de muestras sólidas, ya que las muestras
liquidas o gaseosas se manipulan mucho mejor por espectrometría de emisión de
plasma, que ya se ha descrito en los epígrafes anteriores.
5.3.1. Espectroscopia de emisión con fuente de arco
La fuente de arco usual para un análisis espectroquímico está constituida por un
par de electrodos de grafito o de metal separados unos pocos milímetros. El arco
se enciende mediante una chispa de baja intensidad de corriente que provoca la
formación momentánea de iones que transforman en conductor el espacio entre
los electrodos; una vez iniciado el arco, la ionización térmica mantiene la
corriente. Alternativamente, puede iniciarse el arco juntando los electrodos para
producir el calor necesario para la ionización y luego se separan a la distancia
deseada.
En un arco característico, se utilizan intensidades de comente de 1 a 30 A. Una
fuente de corriente continua tiene por lo general una tensión de circuito abierto
de unos 200 V; y una fuente de arco de corriente alterna trabaja en un intervalo
de alta tensión de 2200 a 4400 V o en un intervalo de baja tensión de 100 a 400
V. En ambos tipos, el arco se extingue al final de cada mitad del ciclo. En el tipo
de alta tensión, el arco se vuelve a encender espontáneamente mientras que en
el arco de baja tensión, se vuelve a encender por medio de la descarga de una
chispa de baja intensidad de corriente.
Características de las fuentes de arco
La electricidad se produce en un arco mediante el movimiento de los electrones
y los iones que se forman por ionización térmica; la elevada temperatura que se
produce es el resultado de la resistencia de los cationes a este movimiento en el
espacio donde se produce el arco. Por tanto, la temperatura del arco depende de
la composición del plasma, que a su vez depende de la velocidad de formación
de partículas atómicas a partir de la muestra y de los electrodos. La temperatura
característica del plasma es de 4000 a 5000 K.

Los espectros obtenidos en un típico arco son ricos en líneas intensas en el caso
de átomos y contienen un número menor de líneas en el caso de especies
iónicas. Es de destacar que en las colecciones de datos de líneas espectrales, las
longitudes de onda van seguidas con frecuencia por I. II y III para indicar la
fuente de la línea, cuyo significado es: átomo neutro, ion con una sola carga e
ion con dos cargas, respectivamente.
Velocidad de emisión.
Sc ha demostrado experimentalmente que la velocidad a la que las especies se
volatilizan y se excitan difiere considerablemente de unas a otras. Los espectros
de algunas especies aparecen pronto y después desaparecen a medida que la
muestra se consume; los espectros de otras especies alcanzan su máxima
intensidad a tiempos mayores. Por ello, es necesario integrar las señales de
emisión durante un minuto o más. Para muestras pulverizadas, la señal para las
líneas de varios elementos generalmente surge rápidamente durante este
período y luego disminuye hasta cero cuando las especies desaparecen por la
vaporización. Debido a este comportamiento, las muestras pulverizadas a
menudo se queman hasta que se consumen por completo; las señales de salida
integradas sirven como variables analíticas.
Aplicaciones de las fuentes de arco
Las fuentes de arco son particularmente útiles para el análisis cualitativo y
semicuantitativo de muestras no metálicas, como suelos, muestras vegetales,
alimentos, fármacos, rocas y minerales. Normalmente, los tiempos de excitación
y las corrientes del arco se ajustan de tal manera que se produzca la
volatilización completa de la muestra, siendo habituales las corrientes de 5 a 30
A durante 20 a 200 s. Normalmente de 2 a 50 mg de muestra en forma de polvo,
pequeños trozos, molienda o limaduras, se mezclan con una cantidad pesada de
grafito y se introducen en la cavidad de los electrodos de grafito. Generalmente,
el electrodo portamuestras hace de ánodo y el segundo contraelectrodo de
grafito actúa de cátodo.
En análisis cualitativo y semicuantitativo de muestras no rutinarias, todavía se
utiliza de manera habitual el registro fotográfico. Se pueden obtener varios
espectros en una placa moviendo verticalmente la cámara tras cada excitación.
Generalmente, se registran también uno o más espectros del hierro, para alinear
la placa o la película con una placa maestra que muestra la localización de las
líneas características.
Se han descrito numerosos métodos espectrográficos semicuantitativos que
proporcionan datos de concentración fiables dentro del intervalo del 30 al 200
por 100 respecto a la cantidad real de un elemento presente en la muestra.
Dichos métodos son útiles cuando la preparación de buenos patrones es cara.
Algunos de estos procedimientos se basan en la vaporización completa en el arco
de una cantidad medida de muestra (1 a 10 mg). La estimación de la
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concentración se establece conociendo la cantidad mínima necesaria de un

elemento para provocar la aparición de las distintas series de líneas. En otros
métodos, se mide el ennegrecimiento de las líneas elementales y se compara con
la línea de un material añadido a la matriz o con el fondo.
La excitación con arco también se utiliza para análisis cuantitativo. Sin embargo,
la precisión obtenida con el arco es significativamente más pobre que con la
chispa y mucho más pobre que con el plasma o la llama. Además, las
intensidades de emisión de las muestras sólidas dependen en gran medida de la
muestra. Como consecuencia, es necesario igualar la matriz en los patrones y en
las muestras para obtener resultados satisfactorios. Para solucionar parcialmente
este problema, siempre se utiliza el método de adición de patrón.
5.3.2. Fuentes de chispa y espectros de chispa
Se han desarrollado diversos circuitos que producen chispas de alta tensión para
espectroscopia de emisión. Se ha comprobado que una chispa intermitente que
siempre se propaga en la misma dirección proporciona mayor precisión y menor
deriva de la emisión radiante. Por este motivo, a menudo la tensión de la línea
de corriente alterna se rectifica antes de subirla de 10 a 50 kV en una bobina. Se
utiliza un conjunto de circuitos de estado sólido para el control de la frecuencia y
la duración de la chispa. Por lo general, con una corriente de 60 Hz se producen
cuatro descargas de chispa por cada semiciclo.
Con una chispa de alta tensión, la corriente promedio es generalmente bastante
menor que en un arco típico, siendo del orden de unas pocas décimas de
amperio. Por otra parte, en la fase inicial de la descarga, la corriente instantánea
puede sobrepasar los 1000 A; en este caso, la electricidad circula por un canal
estrecho que ocupa una minúscula parte del espacio total en el que se produce la
chispa. La temperatura en esta región puede llegar a ser de 4000 K. Así,
mientras que la temperatura media de una fuente de chispa es mucho menor
que la de un arco, la energía en el pequeño volumen del canal puede ser varias
veces mayor. Como consecuencia, los espectros de iones son más pronunciados
en una chispa de alta tensión que en un arco. Por ello, los espectroscopistas a
menudo denominan a las líneas emitidas por los iones “líneas de chispa”.
Aplicaciones de la espectroscopia con fuente de chispa
Los análisis cuantitativos con chispa requieren el control preciso de muchas
variables que intervienen en la preparación y excitación de la muestra, y también
en el procesado de la película en los espectrógrafos. Además, las medidas
cuantitativas requieren la preparación cuidadosa de una serie de patrones para el
calibrado; los cuales deberán aproximarse lo más posible a la composición y
propiedades físicas de las muestras a analizar. Generalmente los análisis por
fuente de chispa se basan en la relación de la intensidad de la línea del analito
respecto a la de una línea del patrón interno (normalmente la línea de un
componente principal de la muestra). En condiciones ideales, se pueden obtener

desviaciones estándar relativas de pequeño porcentaje en las medidas

espectrales con fuente de chispa.
Actualmente, la principal aplicación de la espectroscopia de emisión con fuente
de chispa es la identificación y análisis de metales y otros materiales
conductores. Cuando hay que evitar disolver la muestra por razones de tiempo,
se escoge esta técnica antes que la espectrometría de plasma. La detección se
realiza normalmente con un policromador equipado con tubos
fotomultiplicadores. De hecho, algunos espectrómetros modernos van equipados
con fuentes intercambiables, que permiten excitar por medio de plasmas, arcos,
chispas, descarga luminiscente y láseres.
5.4. FUENTES DE EMISIÓN DE LLAMA

Durante muchos años, las llamas se han utilizado para obtener los espectros de
emisión por excitación de diversos elementos, y los más modernos
espectrómetros de absorción atómica están adaptados para trabajar en la
modalidad de emisión de llama. Sin embargo, las llamas no se utilizan mucho
para esto, ya que la modalidad de absorción proporciona resultados tan buenos o
mejores en cuanto a exactitud, conveniencia y límites de detección para la
mayoría de las determinaciones de un único elemento.
Para análisis multielemental las fuentes de plasma son bastante superiores a las
llamas en la mayoría de los aspectos. Por ello, la espectrometría de emisión de
llama actualmente tiene poca utilidad, excepto en la determinación de metales
alcalinos y ocasionalmente, de calcio. Estos elementos se excitan a temperaturas
relativamente bajas para dar espectros que son notablemente sencillos y exentos
de interferencias de otras especies metálicas. Los espectros de metales alcalinos
constan de unas pocas líneas bastante intensas, muchas de las cuales se
encuentran en la región del visible y que permiten perfectamente cuantificar las
medidas de emisión.
Debido a esta simplicidad espectral, los fotómetros de filtros sencillos son
generalmente suficientes para las determinaciones rutinarias de metales
alcalinos y alcalinotérreos. Se utilizan llamas frías para eliminar la excitación de
la mayoría de los oros metales. Como consecuencia, los espectros son sencillos,
y se pueden utilizar filtros de interferencia para aislar la línea de emisión
deseada.
Los métodos de preparación de muestras son similares a los descritos en el
capítulo 4, epígrafe 4.5.1 para los métodos de absorción atómica de llama. Así
mismo los procedimientos usados para el análisis cuantitativo son
fundamentalmente las curvas de calibración y las curvas de adición de patrón, ya
explicados con anterioridad en los epígrafes 3.7.2.2 (capítulo 3) y 4.5.3 (capítulo
4).
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1. Consulte los apéndices B-2, B-3, B-4, B-5 y B-6, en los que
aparece un resumen del presente capítulo. Céntrese en la
comparación de los métodos de absorción molecular, absorción
atómica y emisión atómica.
14.1. Ejercicios propuestos, centrándose en el análisis de la
técnica 4 (Determinación de potasio en zumo de uvas).
BIBLIOGRAFÍA
Madrid.
5. Rubinson, K y Rubinson, J. (2001). Análisis Instrumental. Pearson Educación
S.A. Madrid.
Dykinson. Madrid.

6 Espectrometría de fluorescencia molecular
6.1. TEORÍA DE LA FLUORESCENCIA

La fluorescencia tiene lugar en sistemas químicos gaseosos, líquidos y sólidos,
tanto sencillos como complejos. El tipo más sencillo de fluorescencia es el que
presentan los vapores atómicos diluidos. Por ejemplo, los electrones 3s de los
átomos de sodio vaporizados pueden ser excitados al estado 3p mediante la
absorción de radiación de longitudes de onda de 589,6 y 589,0 nm. Después de
10-8 a 10-5 s, los electrones vuelven al estado fundamental emitiendo radiación
de estas dos mismas longitudes de onda en todas las direcciones. Este tipo de
fluorescencia, en la cual la radiación absorbida es reemitida sin cambio de
frecuencia, es decir la energía emitida es igual a la absorbida, se conoce como
radiación de resonancia o fluorescencia de resonancia.
Muchas especies moleculares también presentan fluorescencia de resonancia. Sin
embargo, es mucho más frecuente encontrar bandas de fluorescencia molecular
centradas en longitudes de onda más largas que la línea de resonancia, es decir
que la energía emitida es menor que la absorbida. Este desplazamiento hacia
longitudes de onda más largas, o menores energías, se denomina
desplazamiento Stokes.
6.1.1. Diagrama de niveles de energía para las moléculas fluorescentes
La figura 6.1 es un diagrama de niveles de energía parcial para una molécula
fluorescente característica. La línea horizontal gruesa que se encuentra en la
parte inferior de la figura representa la energía del estado fundamental de la
molécula, y se designa E0. A temperatura ambiente, este estado representa la
energía de prácticamente todas Las moléculas en una disolución.
Las dos líneas gruesas superiores representan los estados electrónicos excitados
primero (E1) y segundo (E2), en tanto las líneas horizontales más delgadas son
los niveles de energía de los estados vibracionales fundamentales asociados a los
dos estados electrónicos excitados.
Como muestra la figura 6.1, la excitación de esta molécula se puede producir por
la absorción de dos bandas de radiación, una centrada alrededor de la longitud
de onda 1 (E0 — E1) y la segunda alrededor de la longitud de onda más corta 2
(E0 — E2). Obsérvese que el proceso de excitación da como resultado la
conversión de la molécula a cualquiera de los diversos estados excitados
vibracionales asociados a los niveles electrónicos excitados.
132
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6. Espectrometría de fluorescencia molecular
Velocidades de absorción y de emisión

La velocidad a la cual se absorbe un fotón de radiación es enorme y el proceso
requiere del orden de 10-15 a 10-14 s. Por otro lado, la emisión fluorescente tiene
lugar a una velocidad significativamente más lenta. El tiempo de vida del estado
excitado se relaciona inversamente con la absortividad molar del pico de
absorción correspondiente al proceso de excitación. Por tanto, para
absortividades molares comprendidas entre 103 y 105, los tiempos de vida del
estado excitado son de 10-9 a 10-7 s. Para sistemas débilmente absorbentes,
donde la probabilidad del proceso de transición es más pequeña, los tiempos de
vida pueden ser tan largos como de 10-6 a 10-5 s.
Figura 6.1. Diagrama de energía parcial para un sistema fluorescente
6.1.2. Procesos de desactivación

Una molécula excitada puede volver a su estado fundamental mediante una
combinación de varias etapas. Como muestran las flechas verticales de puntas
negras de la figura 6.1, el fenómeno de fluorescencia conlleva la emisión de un
fotón de radiación. Las otras etapas de desactivación, indicadas por flechas
onduladas o pequeñas flechas de punta abierta, son procesos no radiantes. El
camino más propicio hacia el estado fundamental es aquel que minimiza el
tiempo de vida del estado excitado. Por ello, si la desactivación por fluorescencia
es más rápida que los procesos no radiantes, se observa tal emisión, mientras
que si la desactivación no radiante tiene una constante de velocidad más
favorable, la fluorescencia desaparece o es menos intensa.
La fluorescencia está limitada a un número relativamente pequeño de sistemas
que incorporan características estructurales y ambientales que hacen que la
velocidad de los procesos de relajación o desactivación no radiantes se hagan tan
lentos hasta el punto en el que la reacción de emisión puede competir
cinéticamente con ellos. La información referente a los procesos de emisión es
suficientemente completa para permitir un cálculo cuantitativo de estas
velocidades. Sin embargo, la comprensión de los otros caminos de desactivación
no radiantes es, en el mejor de los casos, rudimentaria para estos procesos y
sólo se pueden realizar afirmaciones o especulaciones cualitativas sobre las
velocidades y los mecanismos. No obstante, la interpretación de la fluorescencia
requiere la consideración de estos otros caminos.
Relajación vibracional
Como ya se ha mencionado, y se muestra en la figura 6.1, una molécula puede
promocionarse a cualquiera de los diversos niveles vibracionales durante el
proceso de excitación electrónico. Sin embargo, en disolución, el exceso de
energía vibracional se pierde inmediatamente como consecuencia de las
colisiones entre las moléculas de las especies excitadas y las del disolvente; el
resultado es una transferencia de energía y un incremento minúsculo de la
temperatura del disolvente. Este proceso de relajación se conoce como relajación
vibracional y es tan eficaz que el tiempo de vida medio de una molécula excitada
vibracionalmente es 10-12 s o menor, lo que representa un período
significativamente más corto que el tiempo de vida medio de un estado excitado
electrónicamente. Como consecuencia, la fluorescencia de la disolución, siempre
incluye una transición desde el nivel vibracional más bajo de un estado
electrónico excitado. Sin embargo, se producen varios picos muy próximos ya
que el electrón puede volver a cualquiera de los niveles vibracionales del estado
fundamental (figura 6.1) y después caerá rápidamente al nivel vibracional más
bajo del estado electrónico fundamental mediante una nueva relajación
vibracional.
El fenómeno de relajación vibracional conduce entonces a la pérdida de parte de
energía radiante absorbida en forma de calor, y es el principal responsable de
que la banda de fluorescencia para una transición electrónica dada se desplace
hacia menores frecuencias o longitudes de onda más largas respecto a la banda
de absorción (desplazamiento Stokes); es decir, que la energía emitida sea
menor que la absorbida. En la figura 6.1 la longitud de onda de la radiación
absorbida que produce el pico de resonancia r, se representa como r .
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Conversión interna
El término conversión interna describe los procesos intermoleculares por los
cuales la molécula pasa a un estado electrónico de más baja energía sin emisión
de radiación. Estos procesos ni están bien definidos ni se entienden bien, pero es
evidente que suelen ser muy eficaces, ya que son relativamente pocos los
compuestos que presentan fluorescencia.
La conversión interna parece ser particularmente eficaz cuando dos niveles de
energía electrónicos están lo suficientemente próximos como para que haya un
solapamiento de los niveles de energía vibracional. Esta situación es la que
presentan los dos estados excitados (E1 y E2) en la figura 6.1. Como muestran
los solapamientos, las energías potenciales de los dos estados excitados son
idénticas; esta igualdad permite, aparentemente, una transición eficaz. La
conversión interna a través de los niveles vibracionales solapados es
normalmente más probable que la pérdida de energía por fluorescencia desde un
estado excitado más alto.
Así, refiriéndonos de nuevo a la figura 6.1, la excitación producida por la banda
de radiación centrada en 2 (E0 – E2), provoca normalmente una banda de
fluorescencia centrada en una longitud de onda 3 (E1 – E0), y sin embargo no
aparece la banda que resultaría de una transición E2 – E0. En este caso la
molécula excitada pasa del estado electrónico más alto E2 al estado vibracional
más bajo del estado electrónico excitado más bajo E1 por una serie de
relajaciones vibracionales, una conversión interna y nuevas relajaciones
posteriores hasta E0. En estas circunstancias, la fluorescencia tiene lugar sólo a
3, independientemente de que las radiaciones de longitud de onda 1 y 2 sean
las responsables de la excitación.
Los mecanismos del proceso de conversión interna E1 — E0 que se muestra en la
figura 6.1 no se entienden bien, pero sin duda ocurren con rapidez. Los niveles
vibracionales del estado fundamental E0 se pueden solapar con los del primer
estado electrónico excitado; bajo tales circunstancias la desactivación ocurrirá
rápidamente por el mecanismo antes descrito. La desactivación por transferencia
de energía a través de los niveles vibracionales solapados tiene lugar tan
rápidamente que no hay tiempo para que tenga lugar la fluorescencia.
La conversión interna puede también dar lugar al fenómeno de la predisociación.
En este caso, el electrón se mueve desde un estado electrónico más alto hacia un
nivel vibracional superior de un estado electrónico más bajo en el que la energía
vibracional es lo suficientemente grande como para provocar la ruptura de un
enlace. En una molécula grande, hay una probabilidad apreciable de que existan
enlaces con fuerzas menores que la energía de excitación electrónica de los
cromóforos. La ruptura de estos enlaces puede ocurrir como consecuencia de la
absorción por un cromóforo, seguida de la conversión interna de la energía
electrónica a la energía vibracional, asociada con el enlace débil.

La predisociación se diferenciaría de la disociación en que en esta última, la

radiación absorbida excita al electrón de un cromóforo directamente a un nivel
vibracional suficientemente alto para provocar la ruptura del enlace del grupo
cromóforo y no incluye la conversión interna. Los procesos de disociación
también compiten con los procesos de fluorescencia.
Conversión externa
La desactivación de un estado electrónico excitado puede incluir la interacción y
la transferencia de energía entre la molécula excitada y el disolvente u otros
solutos. Estos procesos se llaman conversión externa o amortiguación colisional.
La evidencia de la conversión externa incluye el marcado efecto que ejerce el
disolvente sobre la intensidad de fluorescencia; además, aquellas condiciones
que tienden a reducir el número de colisiones entre partículas (baja temperatura
y elevada viscosidad) tienden, generalmente, a aumentar la fluorescencia. Debe
aclararse que los detalles de los procesos de conversión externa no se conocen
bien.
Las transiciones no radiantes al estado fundamental desde los estados excitados
más bajos (figura 6.1) incluyen, probablemente, conversiones externas al igual
que conversiones internas.
6.2. VARIABLES QUE AFECTAN A LA FLUORESCENCIA.

Tanto la estructura molecular como el entorno químico van a influir en que una
sustancia sea o no fluorescente, así como también determinan la intensidad de
emisión cuando tiene lugar la fluorescencia. A continuación se considerarán
brevemente los efectos de algunas de estas variables.
6.2.1. Rendimiento cuántico
El rendimiento cuántico, o la eficacia cuántica, de fluorescencia () es

simplemente la relación entre el número de moléculas que emiten fluorescencia
respecto al número total de moléculas excitadas. Para moléculas altamente
fluorescentes como la fluoresceína, la eficacia cuántica, bajo determinadas
condiciones, se aproxima a la unidad, mientras que las especies químicas que no
presentan una fluorescencia apreciable tienen eficacias que se aproximan a cero.
Número de moléculas que emiten fluorescencia
∅=
Número total de moléculas excitadas
La figura 6.1 y la discusión sobre los procesos de desactivación sugieren que el
rendimiento cuántico de fluorescencia () para un compuesto se puede calcular a
partir de las constantes de velocidad relativas kX de los procesos por los que el
estado excitado más bajo se desactiva, es decir: fluorescencia (kF), conversión
interna (kCI), predisociación (kPD), disociación (kD) y conversión externa (kCE).
Estas relaciones se puede expresar por la ecuación:
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kF
∅ = (7.1)
KF + KCI + KPD + KD + KCE
donde los términos k son las constantes de velocidad respectivas para los
diversos procesos antes enumerados.
Esta ecuación permite una interpretación cualitativa de muchos de los factores
estructurales y del entorno que influyen en la intensidad de fluorescencia.
Aquellas variables que conducen a valores altos para la constante de velocidad
de la fluorescencia kF y a valores bajos para los otros términos de k exaltan la
fluorescencia. En otras palabras cuando los procesos de conversión interna,
predisociación, disociación y conversión externa experiementen constantes de
velocidad menores que el proceso de emisión de energía radiante, la molécula
tendrá una alta probabilidad de fluorescer. La magnitud de kF, la constante de
velocidad de la predisociación kPD y la constante de velocidad de la disociación kD
dependen principalmente de la estructura química; el resto de constantes están
fuertemente influenciadas por el entorno y en menor medida por la estructura.
6.2.2. Tipos de transiciones en fluorescencia
Es importante resaltar que la fluorescencia rara vez es consecuencia de la
absorción de radiación ultravioleta de longitud de onda menor de 250 nm, ya que
tal radiación es suficientemente energética como para producir la desactivación
de los estados excitados por predisociación o disociación. Por ejemplo, una
radiación de 200 nm corresponde a aproximadamente 140 kcal/mol y la mayoría
de las moléculas tienen al menos algún enlace que se puede romper con energías
de esta magnitud. Como consecuencia, rara vez se observa fluorescencia debida
a transiciones * →  , en cambio, este tipo de emisión está asociada a los
procesos menos energéticos * →  y * → n.
Como ya se ha dicho, una molécula en su estado electrónico excitado
normalmente pasa a su estado excitado más bajo mediante una serie de
relajaciones vibracionales rápidas y conversiones internas que no producen
emisión de radiación. De esta manera, la fluorescencia surge, generalmente, de
una transición desde el nivel vibracional más bajo del primer estado electrónico
excitado a uno de los niveles vibracionales del estado electrónico fundamental.
Así, para la mayoría de los compuestos fluorescentes, la radiación se produce por
una transición n → * o  → *, dependiendo de cuál de ellas sea la menos
energética.
6.2.3. Eficacia cuántica y tipo de transición
Empíricamente se observa que la fluorescencia se encuentra con más frecuencia
en los compuestos en los que la transición de más baja energía es del tipo  →
* que en aquellos compuestos en los que la transición de menor energía es del
tipo n → *, es decir, la eficacia cuántica es mayor para las transiciones * → .
La mayor eficacia cuántica asociada a la transición  → * se puede explicar por
el hecho de que la absortividad molar de una transición  → * es normalmente
de 100 a 1000 veces superior que a la de un proceso n → * y este valor

representa una medida de la probabilidad de la transición en ambas direcciones.
Así, el tiempo de vida inherente asociado con una transición  → * es más
corto (10-9 a 10-7 s) comparado con 10-7 a 10-5 s para una transición n → * y kF
en la ecuación 7.1 es mayor.
En resumen, la fluorescencia está más asociada con transiciones  → *, ya que
tales transiciones presentan tiempos de vida medios más cortos (k F es mayor) y
porque es menos probable que tengan lugar los procesos de desactivación que
compiten con la fluorescencia.
6.2.4. Fluorescencia y estructura
La fluorescencia más intensa y la más útil es la que presentan los compuestos
que contienen grupos funcionales aromáticos con transiciones  → * de baja
energía. Los compuestos que contienen grupos carbonilo en estructuras alifáticas
y alicíclicas o estructuras con dobles enlaces altamente conjugados también
pueden presentar fluorescencia, pero el número de estos compuestos es pequeño
comparado con el número de sistemas aromáticos.
La mayoría de los hidrocarburos aromáticos no sustituidos son fluorescentes en
disolución, la eficacia cuántica normalmente aumenta con el número de anillos y
con su grado de condensación. Los heterociclos sencillos, como la piridina, el
furano, el tiofeno y el pirrol, no presentan fluorescencia; en tanto las estructuras
condensadas con éstas normalmente sí la presentan. En los heterociclos con
nitrógeno, se cree que la transición electrónica de más baja energía implica a un
sistema n → *, que rápidamente se transforma en un estado triplete e impide la
fluorescencia. Sin embargo, la condensación de anillos bencénicos para dar
núcleos heterocíclicos, da lugar a un aumento en la absortividad molar del pico
de absorción. En estas estructuras, el tiempo de vida del estado excitado es más
corto y se observa fluorescencia en compuestos como la quinolina, la isoquinolina
y el indol. La figura 6.2 ilustra lo explicado.
Figura 6.2. Efecto de la condensación estructural en la fluorescencia
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La sustitución en el anillo bencénico provoca desplazamientos en la longitud de

onda de los máximos de absorción y los correspondientes cambios en los picos
de fluorescencia. Además, la sustitución afecta frecuentemente a la eficacia de la
fluorescencia; alguno de estos efectos se ilustran con los datos de los derivados
bencénicos de la tabla 6.1.
Tabla 6.1. Efecto de los sustituyentes en la fluorescencia del benceno
Longitud de onda de Intensidad de

Compuesto Fórmula
fluorescencia, nm fluorescencia relativa
Benceno C 6H 6 270-310 10
Tolueno C6H5CH3 270-320 17
Propilbenceno C6H5C3H7 270-320 17
Fluorobenceno C 6H 5F 270-320 10
Clorobenceno C6H5Cl 275-345 7
Bromobenceno C6H5Br 290-380 5
Yodobenceno C 6H 5I - 0
Fenol C6H5OH 285-365 18
Ion fenolato C6H5O- 310-400 10
Anisol C6H5OCH3 285-345 20
Anilina C6H5NH2 310-415 20
Ion anilinio C6H5NH3+ - 0
Acido benzoico C6H5COOH 310-390 3
Benzonitrilo C6H5CN 280-360 20
Nitrobenceno C6H5NO2 - 0
6.2.5. Efecto de la rigidez estructural

Empíricamente se encuentra que la fluorescencia se ve particularmente
favorecida en moléculas que poseen estructuras rígidas. Por ejemplo, las
eficacias cuánticas para el fluoreno y el bifenilo son próximas a 1,0 y 0,2,
respectivamente, bajo condiciones de medida similares. La diferencia en el
comportamiento parece ser, en gran medida, el resultado de un aumento en la
rigidez proporcionado por el puente que forma el grupo metileno en el fluoreno
(figura 6.3).
Figura 6.3. Efecto de la rigidez estructural en la fluorescencia

También se ha recurrido a la influencia de la rigidez estructural para explicar el

aumento de la fluorescencia de ciertos agentes quelantes orgánicos cuando están
formando un complejo con un ion metálico. Por ejemplo, la intensidad de
fluorescencia de la 8-hidroxiquinolina es mucho menor que la de su complejo con
cinc (figura 6.4).
Figura 6.4. Complejo de la 8-hidroxiquinolina con el Cinc.
La falta de rigidez de una molécula probablemente provoca un aumento de la

velocidad de conversión interna (KCI en la Ecuación 7.1) y el correspondiente
aumento en la probabilidad de desactivación no radiante. Una parte de una
molécula no rígida puede sufrir vibraciones de baja frecuencia respecto a sus
otras partes y tales movimientos indudablemente explican ciertas pérdidas de
energía.
6.2.6. Efectos de la temperatura y del disolvente
La eficacia cuántica de fluorescencia disminuye en la mayoría de las moléculas al
aumentar la temperatura, ya que al aumentar la frecuencia de las colisiones
cuando la temperatura es elevada aumenta la probabilidad de desactivación por
conversión externa. Una disminución en la viscosidad del disolvente también
aumenta la probabilidad de la conversión externa y conduce al mismo resultado.
La fluorescencia de una molécula se reduce en presencia de disolventes que
contienen átomos pesados o de solutos con dichos átomos en su estructura;
como por ejemplo, el tetrabromuro de carbono y el yoduro de etilo.
6.2.7. Efecto del pH en la fluorescencia
La fluorescencia de un compuesto aromático con sustituyentes ácidos o básicos
en el anillo depende normalmente del pH. Tanto la longitud de onda como la
intensidad de emisión son, probablemente, diferentes para las formas ionizada y
no ionizada del compuesto. La tabla 7.1 ilustra este efecto con datos para el
fenol y la anilina. Los cambios en la emisión de los compuestos de este tipo
surgen del distinto número de especies resonantes asociadas con las formas
acidas y básicas de las moléculas. Por ejemplo, la anilina tiene varias formas
resonantes mientras que el ion anilinio sólo una (figura 6.5).
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Figura 6.5. Efecto del pH en la fluorescencia.
Cuanto mayor es el número de formas resonantes, mayor es la estabilidad del

primer estado excitado y la consecuencia es una fluorescencia en la región
ultravioleta.
Estas observaciones sugieren que los procedimientos analíticos basados en las
medidas de fluorescencia frecuentemente requieren un control minucioso del pH.
6.2.8. Efecto del oxígeno disuelto
La presencia de oxígeno disuelto suele reducir la intensidad de fluorescencia de
una disolución. Este efecto puede ser el resultado de una oxidación de las
especies fluorescentes inducida fotoquímicamente. Sin embargo, con más
frecuencia la amortiguación tiene lugar como consecuencia de las propiedades
paramagnéticas del oxígeno molecular, que favorecen el cruce entre sistemas y
la conversión de Las moléculas excitadas al estado triplete. Otras especies
paramagnéticas también tienden a amortiguar la fluorescencia.
6.2.9. Efecto de la concentración en la intensidad de fluorescencia
La relación de la potencia de la emisión fluorescente F con la concentración
puede escribirse según:
F = Kc
Así, la representación gráfica de la potencia fluorescente de una disolución frente
a la concentración de las especies emisoras debería ser lineal a bajas
concentraciones. Cuando la concentración es tan elevada que la absorbancia es
mayor que aproximadamente 0,05, ocurren desviaciones y la linealidad se
pierde; entonces F toma un valor inferior al obtenido en la extrapolación de la
línea recta de la representación gráfica.
Otros dos factores, responsables también de las desviaciones negativas de la
linealidad a elevadas concentraciones, son la autoamortiguación y la
autoabsorción.
El primero es el resultado de colisiones entre moléculas excitadas. La
transferencia de energía por vía no radiante sucede, quizás, de una manera
análoga, a como ocurre la transferencia de energía a las moléculas del disolvente
en una conversión externa. Se puede esperar que la autoamortiguación aumente

con la concentración debido a la mayor probabilidad de que tengan lugar
colisiones.
Por su parte, la autoabsorción tiene lugar cuando la longitud de onda de emisión
se solapa con un pico de absorción; la fluorescencia, entonces, disminuye porque
la radiación emitida atraviesa la disolución y es reabsorbida por otras moléculas
fluorescentes.
Los efectos de estos fenómenos son tales que pueden hacer que aparezca un
máximo en la representación gráfica de la potencia fluorescente frente a la
concentración.
Es por ello que es necesario el control de la concentración con vistas a garantizar
la relación lineal entre esta y la emisión de fluorescencia.
6.3. INSTRUMENTOS PARA LA MEDIDA DE LA FLUORESCENCIA

Los distintos componentes de los instrumentos para la medida de la
fotoluminiscencia son similares a los que se encuentran en los fotómetros o
espectrofotómetros ultravioleta-visibles. La figura 6.6 muestra una configuración
característica de estos componentes en los fluorómetros y los
espectrofluorímetros.
Figura 6.6. Componentes de un fluorómetro o un espectrofluorímetro.
Casi todos los instrumentos de fluorescencia utilizan ópticas de doble haz tal
como se muestra en la figura 6.6, para compensar las fluctuaciones en la
potencia de la fuente. El haz de la muestra pasa primero a través de un filtro o
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un monocromador de excitación, que transmite la radiación que provocará la

fluorescencia pero excluye o limita la radiación de la longitud de onda de la
emisión fluorescente. La fluorescencia se propaga desde la muestra en todas las
direcciones pero lo más conveniente es observar la que forma un ángulo recto
(90º) con el haz de excitación; a otros ángulos, la dispersión producida en la
disolución y en las paredes de las cubetas aumenta y se pueden cometer grandes
errores en la medida de la intensidad. La radiación emitida llega a un
fotodetector después de haber pasado por un segundo filtro o monocromador
que aísla la longitud de onda máxima de fluorescencia para su medida.
El haz de referencia pasa a través de un atenuador que reduce su potencia a
aproximadamente la de la radiación fluorescente (normalmente la potencia se
reduce en un factor de 100 o más). Las señales procedentes del fotomultiplicador
de la muestra y del de referencia se dirigen a un amplificador diferencial cuya
salida se visualiza en un medidor o en un registro. Algunos instrumentos de
fluorescencia son de tipo nulo; esta condición se consigue con atenuadores
ópticos o eléctricos. Los instrumentos más modernos utilizan un circuito divisor
analógico o un sistema de adquisición de datos digital seguido del tratamiento de
los datos para obtener la relación entre la intensidad de la emisión fluorescente y
la intensidad de la fuente de radiación.
Los verdaderos espectrofluorímetros son instrumentos especializados equipados
con dos monocromadores; uno de ellos permite fijar la longitud de onda de
excitación y el otro permite variar la longitud de onda de emisión para obtener
un espectro de fluorescencia.
6.3.1. Componentes de los fluorómetros y de los espectrofluorímetros
Los componentes de los fluorómetros y de los espectrofluorímetros difieren sólo
en detalles de los que componen los fotómetros y los espectrofotómetros UV-vis,
por lo que sólo es necesario considerar estas diferencias.
Fuentes
En la mayoría de las aplicaciones se necesitan fuentes más intensas que las
lámparas de wolframio o deuterio utilizadas en las medidas de absorción. De
hecho, la magnitud de la señal de salida y, por tanto, la sensibilidad, es
directamente proporcional a la potencia de la fuente P0.
Lámparas.
La lámpara más común para los fluorómetros de filtro es la lámpara de arco de
mercurio a baja presión equipada con una ventana de sílice fundida. Esta fuente
emite líneas útiles para producir la excitación previa a la fluorescencia a 254,
302, 313, 546, 578, 691 y 773 nm. Las líneas individuales se pueden aislar con
filtros de interferencia o absorción adecuados. Ya que, en la mayoría de los
compuestos fluorescentes, la fluorescencia se puede inducir con distintas
longitudes de onda, al menos una de las líneas del mercurio suele resultar
adecuada.
Para los espectrofluorímetros, en donde se requiere una fuente de radiación

continua, normalmente se utiliza una lámpara de arco de xenón de alta presión,
de 75 a 450 W. Estas lámparas requieren una fuente de alimentación potente,
capaz de producir corrientes continuas de 5 a 20 A y de 15 a 30 V. El espectro de
una lámpara de arco de xenón es continuo desde aproximadamente 300 a 1300
nm. En algunos instrumentos, se obtienen destellos espaciados regularmente en
el tiempo mediante la descarga de un condensador a través de la lámpara a
frecuencia constante; de esta manera se producen impulsos de luz de gran
intensidad. Además, las señales de Salida de los detectores son, así, señales de
corriente alterna, que pueden ser fácilmente amplificadas y procesadas.
Filtros y monocromadores
Tanto los filtros de interferencia como los de absorción se han utilizado en los
fluorómetros para la selección de la longitud de onda del haz de excitación y de
la radiación fluorescente resultante. La mayoría de los espectrofluorímetros están
equipados con al menos uno y a veces dos monocromadores de red.
Detectores
La señal de fluorescencia típica es de baja intensidad, por ello, para su medida se
necesitan ganancias de amplificador elevadas. Los tubos fotomultiplicadores son
los detectores más utilizados en instrumentos de fluorescencia sensibles. Suelen
trabajar en la modalidad de recuento de fotones para mejorar la relación
señal/ruido. También se utiliza, a veces, la refrigeración de los detectores para
mejorar la relación señal/ruido. También se han propuesto, para los
espectrofluorímetros, los detectores de diodos en serie y de transferencia de
carga. Este tipo de detectores permite el registro rápido de los espectros de
excitación y de emisión y particularmente son útiles en cromatografía y en
electroforesis.
Cubetas y compartimentos para las cubetas
Para medidas de fluorescencia se utilizan tanto cubetas cilíndricas como
rectangulares, fabricadas con vidrio o con sílice. Se debe tener cuidado en el
diseño del compartimento de la cubeta para reducir la cantidad de radiación
dispersada que llega hasta el detector. Con este propósito, a menudo, se
introducen deflectores en el compartimento, incluso más importante que en las
medidas de absorbancia, es evitar dejar las huellas dactilares en las cubetas, ya
que la grasa de la piel con frecuencia fluoresce.
6.4. APLICACIONES DE LOS MÉTODOS FLUORESCENTES

Es inherente a los métodos fluorescentes el ser aplicables a intervalos de
concentración más bajos que las medidas espectrofotométricas de absorción y se
encuentran entre las técnicas analíticas más sensibles de las que puedan
disponer los científicos. El aumento de sensibilidad surge del hecho de que el
parámetro relacionado con la concentración en fluorimetría F se puede medir
independientemente de la potencia de la fuente P0. Por el contrario, una medida
40d78409-8f5a-44ad-af96-811f110af4ad
de absorbancia requiere la evaluación de P0 y de P, ya que la absorbancia, que es

proporcional a la concentración, depende de la relación entre estas dos
cantidades. La sensibilidad de un método fluorimétrico puede mejorarse
aumentando P0 o mediante la amplificación adicional de la señal de fluorescencia.
Por el contrario, en espectrofotometría, un aumento en P 0 da lugar a un cambio
proporcional en P y, por ello, no afecta a la absorbancia. Por tanto, los métodos
fluorimétricos tienen, generalmente, sensibilidades que son de uno a tres
órdenes de magnitud superiores a los correspondientes de absorción. Por otro
lado, la precisión y la exactitud de los métodos fluorescentes son habitualmente
más pobres que las de los procedimientos espectrofotométricos en un factor
entre dos y cinco.
Análisis cualitativo
El análisis cualitativo se realiza a través de los espectros de fluorescencia, los
cuales se obtienen realizando la excitación a una longitud de onda fija mientras
se varía selectivamente la longitud de onda de emisión; se registra entonces la
intensidad de emisión en función de la longitud de onda.
Varios compuestos de importancia en los alimentos experimentan el fenómeno
de fluorescencia, ya sea en su estado nativo o como resultado de una reacción
de derivatización. Tal es el caso de las vitaminas, los colorantes, los plaguicidas y
sustancias tóxicas como las aflatoxinas. Así mismo, varias combinaciones
aromáticas consideradas carcinogénicas, como los derivados del 3, 4
benzopireno, muestran fuerte fluorescencia y su presencia puede ser detectada
por métodos fluorimétricos.
Análisis cuantitativo
Los métodos más empleados para el análisis cuantitativo son las curvas de
calibración (ver epígrafe 3.7.2.2), el método del patrón externo (ver epígrafe
3.7.2.1) y el método de adición de patrón (ver epígrafe 4.5.3).
En la tabla 6.2, se relacionan algunas aplicaciones cuantitativas de la
fluorometría en el análisis de alimentos
Tabla 6.2. Algunas aplicaciones de la fluorometría en el análisis cuantitativo.
Sustancia Condiciones  excitación  emisión
Estado nativo
A 340 nm 490 nm
Extracción con n-butanol
Oxidación a Tiocromo con
B1 (Tiamina) 365 nm 435 nm
ferrocianuro
Vitaminas B2 (Riboflavina) Estado nativo (pH= 7) 450 nm 545 nm
B6 (Piridoxina) Estado nativo (pH= 6,75) 340 nm 400 nm
Hidrólisis ácida
B12 (Cianocobalamina) Disolución en HAc 0,1 285 nm 380 nm
mol/L

Sustancia Condiciones  excitación  emisión
Guthión Hidrólisis 400 nm 455 nm

Pesticidas Malvín HCl, NaNO2 366 nm 490 nm
Potasan Metanol 320 nm 385 nm
un resumen del presente capítulo. Céntrese en la comparación de los
métodos ópticos de absorción y emisión estudiados hasta el
momento.
14.1. Ejercicios propuestos.
BIBLIOGRAFÍA
Madrid.
SA. Madrid.
5. Rubinson, K y Rubinson, J. (2001). Análisis Instrumental. Pearson Educación
S.A. Madrid.
Dykinson. Madrid.
6ta ed. Cengage Learning Editores
40d78409-8f5a-44ad-af96-811f110af4ad
7 Refractometría y Polarimetría
La refractometría y la polarimetría constituyen métodos ópticos que si bien son

importantes y presentan algunas aplicaciones de interés en el campo del análisis
de los alimentos, su empleo en la práctica es menos habitual que los métodos
espectrométricos.
Los principios más generales de los fenómenos de refracción y polarización de la
radiación ya fueron tratados en el capítulo 2, epígrafes 2.3.3 y 2.3.4 de este
texto. A continuación se abordarán brevemente las características generales de
los métodos refractométricos y polarimétricos, así como sus aplicaciones más
importantes.
7.1. REFRACTOMETRÍA
La luz viaja a diferentes velocidades a través de medios distintos y, cuando un
rayo de luz cruza la interfaz entre dos sustancias, cambia de dirección. El rayo
emergente se conoce como rayo refractado y el fenómeno se denomina
refracción (ver figura 2.7, epígrafe 2.3.3. capítulo 2).
El índice de refracción () de una sustancia es una medida de la velocidad de la
luz a través de la sustancia y se define como la razón entre la velocidad de la luz
en la sustancia y la velocidad de la luz en el vacío. Para fines prácticos, se usa la
velocidad de la luz en el aire y no en el vacío, siendo la diferencia muy pequeña
(ver epígrafe 2.3.3. capítulo 2).
Índice de refracción de una sustancia determinada (η) =

Velocidad de la luz en el vacío
Velocidad de la luz en la sustancia
7.1.1. Variables que afectan las mediciones del índice de refracción

La temperatura, la longitud de onda y la presión son las variables más comunes
que pueden controlarse experimentalmente y afectan el índice de refracción.
Temperatura. La temperatura influye en el índice de refracción de un medio
principalmente por el cambio en su densidad. Normalmente, un aumento de la
temperatura da lugar a una disminución de la densidad y la luz viaja más rápido
a través de un medio de densidad más baja. Por lo tanto, el índice de refracción
tiende a disminuir al aumentar la temperatura.
De lo anterior se deduce que para realizar mediciones precisas del índice de
refracción debe controlarse la temperatura. Para un líquido promedio las
fluctuaciones de temperatura deben ser menores de  0,2 ºC si se requiere una
precisión de cuatro lugares, y  0,02 ºC para mediciones con cinco cifras.
147
7. Refractometría y Polarimetría
Longitud de onda. El índice de refracción de un medio transparente disminuye

gradualmente al aumentar la longitud de onda; este efecto se conoce con el
nombre de dispersión normal.
Los fenómenos de dispersión hacen que sea esencial especificar la longitud de
onda empleada cuando se reporta un índice de refracción. La línea D de una
lámpara de vapor de sodio (= 589 nm) se usa más comúnmente como fuente
de radiación en refractometría y el correspondiente índice de refracción se
designa 𝜂𝐷 (a menudo se indica también la temperatura en ºC por un
superíndice, por ejemplo, 𝜂𝐷20 ). Otras líneas usadas para mediciones del índice de
refracción son las líneas C y F de una fuente de hidrógeno (= 656 nm y 486 nm,
respectivamente) y la línea G del mercurio ((= 436 nm).
Presión. El índice de refracción de una sustancia aumenta con la presión debido
al consecuente aumento de la densidad. Sin embargo, la variación de la presión
atmosférica solo es importante en la medición del índice de refracción en los
gases; en las mediciones en líquidos y sólidos su efecto es despreciable.
7.1.2. Instrumentos para medir el índice de refracción
Existen diversos tipos de refractómetros, los cuales pueden clasificarse en
instrumentos óptico-mecánicos y los actuales instrumentos digitales que brindan
mayor precisión. La figura 7.1 muestra un resumen de la clasificación de los tipos
de refractómetros que se abordarán en este texto.
Figura 7.1. Clasificación de los refractómetros
Todos estos refractómetros se basan en el efecto del ángulo crítico, que define el
punto de equilibrio, el punto de sombra o límite, entre la refracción y el reflejo
interno total de la luz en una interface prisma – muestra.
El ángulo crítico es el ángulo formado por la perpendicular a la cual el haz cambia
desde la luz transmitida en el líquido a la luz totalmente reflejada en la superficie
del líquido. A ángulos más pequeños que el crítico la luz se transmite en el
líquido. El ángulo crítico no depende sólo de la composición de la disolución sino
del material del prisma (figura 7.2).
40d78409-8f5a-44ad-af96-811f110af4ad
Figura 7.2. Representación esquemática del ángulo crítico
El índice de refracción de la muestra se deriva de la geometría de la vía óptica y

del índice de refracción del material del prisma.
El principal hecho destacable de esta técnica es que el índice de refracción se
mide en la superficie de la muestra. Como la superficie de reflexión no requiere
penetración del rayo en la muestra, este instrumento puede ser usado para
muestras bastante opacas y suspensiones además de muestras transparentes.
A continuación se describirán brevemente las características generales de cada
tipo de refractómetro.
7.1.2.1. Refractómetros óptico-mecánicos
El principio de medición del índice de refracción es básicamente un sistema
óptico que busca medir el ángulo que se ha desviado la radiación, utilizando para
ello dos prismas: uno fijo de iluminación sobre el cual se deposita la muestra y
uno móvil de refracción. Los prismas están rodeados de una corriente de agua
termostatizada, ya que, como se ha planteado con anterioridad, la temperatura
es una de las variables que afecta la medida.
El diseño de los refractómetros óptico-mecánicos no ha variado notablemente
desde el original planteado por Abbé (1874) y Pulfrich (1887). Se basa en
observar el reflejo de la luz a través de una muestra colocada sobre un prisma,
la refracción y el reflejo interno total de la luz en la interface (el punto de
contacto entre la muestra y el prisma) permite que se genere un punto de
sombra que establece el valor del índice de refracción o su equivalente en la
escala en la cual se trabaja. Este tipo de instrumento, puede entregar lecturas
poco precisas ya que, está sujeta a la apreciación de una persona, es decir, la
medición se visualiza por medio ocular obteniéndose el valor cuando el límite
hace intersección con la escala.
Refractómetro de Abbe.
Este refractómetro, basado también en el principio del ángulo límite, está ideado
para realizar la operación con comodidad y rapidez. Requiere sólo cantidades
muy pequeñas de la muestra (apenas unas gotas) y da una precisión del orden
de 2 x 10-4. La escala está graduada directamente en índices de refracción para

las líneas D de sodio a 20°C. En su forma usual se puede usar con luz de sodio o
con luz blanca. Los modelos de alta precisión se limitan en general al uso de luz
de sodio, aunque los fabricantes suministran tablas de corrección para las líneas
C y F con una lámpara de hidrógeno.
La figura 7.3 muestra un refractómetro de Abbe comercial con control de
temperatura.
Figura 7.3. Refractómetro de Abbe con control de temperatura
En este instrumento, se mantiene una capa fina del líquido que se mide contra la
hipotenusa de un prisma de refracción, mediante un prisma auxiliar, cuya
hipotenusa está finamente esmerilada. Se ilumina el prisma auxiliar y la luz que
se difunde en la superficie esmerilada choca en ángulos diversos sobre el límite
entre el líquido y el prisma principal. Esta luz entra en el prisma de refracción en
ángulos que varían hasta el ángulo límite. Por consiguiente, cuando se mira con
un anteojo la luz que emerge del prisma de refracción, se ve un campo dividido,
que se halla en parte oscuro y en parte iluminado con una línea divisoria neta
entre las dos porciones.
El procedimiento de lectura del índice de refracción en un refractómetro de Abbe,
se observa en la figura 7.4.
(a) (b) (c) (d)

Figura 7.4. Procedimiento de lectura del índice de refracción de una muestra
40d78409-8f5a-44ad-af96-811f110af4ad
Luego de aplicar unas gotas de la muestra entre los prismas, se observa por el
ocular del equipo y cuando el operador está cerca de índice de refracción de la
muestra debe observar que la visión en el ocular demuestra una región oscura
en la región inferior y más clara en la superior (figura 7.4a). Accionando
entonces un tornillo lateral en el refractómetro, debe buscar una demarcación
bien definida entre las regiones claras y oscuras (figura 7.4b) y colocar la
frontera exactamente en el centro de los retículos diagonales del ocular (figura
7.4c). Para leer índice de refracción, vea la escala a través del ocular (figura
7.4d). La escala superior indica índice de refracción (), mientras la inferior
indica el porcentaje de sólidos solubles en grados Brix (más adelante, en el
epígrafe 7.1.3 será tratada con mayor profundidad la utilidad de esta escala). El
ejemplo considerado se obtiene un índice de refracción de 1,4606 y 68,2 grados
Brix (figura 7.4d).
El uso de luz blanca, que ordinariamente produce una franja coloreada en vez de
un límite oscuro-brillante entre las dos partes del campo, se hace posible con el
uso de dos prismas de Amici, para compensar la dispersión relativa del prisma de
refracción y de la muestra.
Una ventaja peculiar del refractómetro de Abbe es que en esta forma puede
medirse el índice de refracción de muestras opacas, aunque en este caso hay
que tener el cuidado especial de evitar películas superficiales que tengan un
índice diferente del de la muestra.
Refractómetro de Pulfrich.
El refractómetro de Pulfrich es útil para la
medición del índice de refracción de
muestras sólidas o líquidas. Con gran
cuidado en el uso del instrumento y con los
ajustes mejores posibles, se alcanza una
precisión del orden de 1 x 10-4 en el índice
de refracción. La diferencia del índice entre
dos muestras cuyos índices difieren muy
poco, se puede determinar con un error de
2 x10-5. En la figura 7.5 se muestra uno de
los primeros refractómetros de Pulfrich
comerciales.
El componente central de este instrumento
es un bloque de vidrio, que ha de ser de
excelente calidad, con dos superficies
planas formando ángulo recto, una en el
plano horizontal y otra en el vertical. La luz, Figura 7.5. Refractómetro de Pulfrich
ligeramente convergente, de un foco que da
líneas espectrales netas, bien espaciadas, es incidente sobre la superficie
horizontal. Los rayos que inciden casi en ángulo de 90º con la normal, esto es,

casi paralelos a la superficie horizontal, se refractan en el bloque Pulfrich en el

ángulo límite, lo cual depende del índice de refracción del bloque y del líquido. Si
la dispersión del líquido es diferente de la del vidrio, como por lo general es el
caso, el ángulo límite será diferente para longitudes de onda distintas. Los rayos
que inciden sobre la superficie horizontal en ángulo de menos de 90º con la
normal, también se refractan en el bloque. Los rayos incidentes en ángulos
mayores que 90º naturalmente no entran en el bloque por la superficie
horizontal. Por lo tanto, los rayos refractados en ángulos menores que el ángulo
límite, o iguales a esté, emergerán de la cara vertical del bloque de Pulfrich,
mientras que no aparecerán los que inciden en ángulos mayores que el crítico.
Refractómetro de inmersión.
El principio del refractómetro de inmersión
es el mismo que el de los aparatos de Abbe
y Pulfrich. Su nombre proviene del hecho
que el prisma de refracción está sujeto
rígidamente al objetivo del anteojo y se
sumerge en el líquido cuyo índice de
refracción se mide. Requiere sólo 10-15 ml
de muestra y el prisma simple va montado
en un telescopio que contiene el
compensador y el ocular. La escala se sitúa
debajo del ocular dentro del tubo y la
superficie inferior del prisma se sumerge
en un pequeño vaso que contiene a la
muestra, con un espejo debajo para
reflejar la luz hacia arriba a través del
líquido.
Se hace la lectura de la posición de la línea
divisoria entre las porciones oscura y
brillante del campo sobre una escala en el
plano focal del anteojo mientras el prisma
está sumergido en el líquido. Las lecturas Figura 7.6. Esquema de un
de la escala se transforman en los índices refractómetro de inmersión.
de refracción correspondientes mediante
tablas de conversión suministradas con el instrumento.
La figura 7.6 muestra un esquema de funcionamiento de un refractómetro de
inmersión.
El refractómetro de inmersión puede usarse, como el de Abbe, con luz blanca,
aunque la compensación de la dispersión se hace por rotación de un solo prisma
de Amici, que da un valor algo menos exacto para la dispersión. En algunos
instrumentos especiales, ideados para una dispersión estrecha del intervalo del
índice, la compensación se hace con un prisma fijo.
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El refractómetro de inmersión es muy cómodo para la medición de numerosas

muestras que varían poco en el índice de refracción. Su precisión es algo mayor
que la del instrumento de Abbe ordinario, pero no es tan adaptable como éste o
como el refractómetro de Pulfrich.
La figura 7.7 muestra el diseño de un refractómetro de inmersión moderno con
escala para la determinación de humedad en miel de abejas.
Figura 7.7. Diseño de un refractómetro de inmersión para la medición de humedad en

mieles.
7.1.2.2. Refractómetros automáticos digitales

Los refractómetros automáticos digitales usan un circuito integrado de luz (una
matriz de diodos) y partes móviles para detectar la posición exacta del límite. La
luz, que proviene desde ese circuito integrado, pasa a través de un prisma en
contacto con la muestra. Un sensor de imagen determina el ángulo crítico en el
cual la luz no es más refractada a través de la muestra. La mayoría de los
instrumentos aplican en forma automática la compensación de temperatura a la
medición y convierten el índice de refracción de la muestra a una unidad de
medida específica. Además, pueden programarse escalas distintas y el resultado
se muestra en formato digital, brindando gran simplicidad al proceso y ahorro de
tiempo en las conversiones.
Algunos instrumentos también incorporan un programa informático especial para
interpretar los límites “difusos” que muchos productos tienden a producir. De
esta manera, no se requiere un criterio humano subjetivo al obtener una lectura,
lo que constituye la principal ventaja de un instrumento automático.
La figura 7.8 muestra algunos diseños de refractómetros automáticos digitales
que se comercializan en la actualidad.

(a) (b) (c)

Figura 7.8. Algunos diseños de refractómetros automáticos digitales: (a) de sobremesa;
(b) y (c) portátiles.
7.1.3. Aplicaciones de la refractometría
La refractometría tiene variadas aplicaciones tanto desde el punto de vista

cualitativo como cuantitativo.
Cuando la composición de una sustancia cambia, también lo hace su índice de
refracción. Así pues, una medida del índice de refracción puede dar información
sobre la composición de una sustancia. Por ejemplo, cuando una sustancia se
disuelve en un líquido, el índice de refracción aumenta. Así, para determinar la
concentración de la solución, puede emplearse una medida del índice de
refracción de una solución de azúcar en agua.
Existen numerosos usos y, por lo tanto, los refractómetros se calibran con una o
más escalas para adecuarse a las aplicaciones determinadas. En el caso de los
instrumentos ópticos, se visualiza una escala por medio del ocular y se obtienen
lecturas cuando el límite hace intersección con la escala. En el caso de los
instrumentos electrónicos, pueden programarse escalas distintas y el resultado
se muestra en formato digital.
El uso de la refractometría en diversos procesos productivos se ha hecho cada
vez más necesaria debido a las exigencias en las normativas de calidad vigentes,
las cuales incluyen a toda la cadena de producción desde el cultivo de las
materias primas, su recepción, elaboración y control de los productos finales en
las industrias del rubro químico, agroalimentario y farmacéutico, entre otros.
La medición del índice de refracción en el análisis de los alimentos encuentra
aplicaciones en tres áreas fundamentales:
1. Identificar o confirmar la identidad de una muestra comparando su índice de
refracción con los valores reportados para esa muestra.
Un claro ejemplo de esta aplicación es la determinación del índice de
40d78409-8f5a-44ad-af96-811f110af4ad
refracción en aceites y grasas comestibles por cuanto esta propiedad física

constituye un importante índice de identidad en estos productos, permitiendo
corroborar la fuente de obtención de los aceites y grasas, así como posibles
adulteraciones del producto final. La tabla 7.1 relaciona los índices de
refracción de algunos aceites y grasas comestibles.
Tabla 7.1
Índices de refracción de algunos aceites y grasas comestibles .
Aceites y grasas Índice de refracción () a 25ºC

Mantequilla 1,452 – 1,457
Manteca de cacao 1,454 – 1,458
Manteca de cerdo 1,458 – 1,461
Aceite de coco 1,448 – 1,450
Aceite de nuez 1,461 – 1,465
Aceite de maní 1,467 – 1,470
Aceite de maíz 1,470 – 1,474
Aceite de girasol 1,472 – 1,474
Aceite de lino 1,472 – 1,475
2. Determinar la pureza de una muestra comparando su índice de refracción con

el valor para la sustancia pura.
El etanol por ejemplo, posee un índice de refracción de 1,36176, mientras
que el metanol muestra un valor de 1,32920. De ahí que la medición de este
parámetro sirva para diferenciar ambos alcoholes. De igual modo el índice de
refracción puede emplearse para comprobar la pureza de los aditivos
alimentarios (colorantes, edulcorantes, potenciadores del sabor, etc.).
3. Determinar la concentración de un soluto en una solución comparando el
índice de refracción de la solución con una curva patrón binaria (sal, azúcar,
alcohol, etc.).
Se puede conocer por ejemplo la concentración de metanol contaminante en
una muestra de etanol, midiendo el índice de refracción de la mezcla
problema y comparándolo con una curva de calibración de una mezcla de
metanol y etanol.
En este caso se prepara una curva de calibrado a partir de etanol (EtOH) y
metanol (MeOH) absolutos con concentraciones crecientes y exactamente
conocidas del metanol en el rango de concentraciones en que se sospeche la
presencia del metanol contaminante, y se lee el índice de refracción de cada
una de las mezclas que forman la curva de calibración.
Supongamos que se preparó una curva con seis concentraciones de metanol
entre 0 y 10%, y se obtuvieron los siguientes resultados experimentales:

Nº de soluciones Muestra
1 2 3 4 5 6 problema
% 10
0 2 4 6 8 ¿?
MeOH
% EtOH 100 98 96 94 92 90 ¿?
 1,36176 1,35941 1,35712 1,35576 1,35311 1,35071 1.35802
El juego de datos de % metanol vs. , se procesa entonces por regresión

lineal obteniéndose los resultados que aparecen en la figura 7.9.
1,364
1,362
y = -0,0011x + 1,3617
ïndice de refracción
1,36 R² = 0,9949
1,358
1,356
1,354
1,352
1,35
0 2 4 6 8 10 12
% de metanol
Figura 7.9. Curva de calibración expresada en % de metanol vs. 

Nótese que se obtiene una recta de pendiente negativa, debido a que
el índice de refracción del metanol puro es menor que el del etanol; de
ahí que en la medida en que se incrementa el % de metanol el índice
de refracción de la mezcla disminuye.
En la ecuación de regresión obtenida el término y se sustituye por el
índice de refracción obtenido para la muestra en estudio y despejando
puede calcularse el % de metanol según:
1.35802 -1,3617
% metanol =
- 0,0011
% metanol = 3,34
De ahí, que en el ejemplo considerado la solución de etanol está contaminada
con un 3,34% de metanol.
Debe señalarse que aun cuando la refractometría puede emplearse para estos
fines, en la práctica el contenido de metanol y etanol en bebidas alcohólicas
se realiza por cromatografía de gases, por ser un método mucho más
potente, exacto, preciso y sensible.
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No obstante las aplicaciones antes mencionadas, el uso más extendido de la

refractometría en las industrias de alimentos y bebidas está en la medición de los
grados Brix.
Además de la escala del índice de refracción, la escala de uso más extendido en
un refractómetro es la escala de grados Brix (ºBx), que determina el porcentaje
de azúcares o sólidos solubles totales y es la más reconocida internacionalmente.
Esta escala establece una relación entre la concentración de sacarosa en el agua
a 20ºC con el índice de refracción de la solución. La mayoría de los productos
alimenticios son más complejos que una solución de sacarosa y muchos otros
ingredientes solubles pueden contribuir al índice de refracción total. Sin
embargo, la escala de Brix continúa usándose como patrón. En el caso de los
productos sin base de sacarosa, el término “Brix aparente” es estrictamente más
correcto.
El uso de la refractometría ha cobrado gran interés en el área de la fabricación
de bebidas y un claro ejemplo está relacionado a la elaboración de vinos. La
presencia de azúcares es uno de los parámetros fundamentales de la enología,
debido a que esta familia de compuestos interviene prácticamente en todo el
proceso de elaboración que conduce desde la uva al vino determinando la calidad
del producto final.
Para conocer la concentración de azúcares en los mostos naturales se recurre
habitualmente a la determinación del índice de refracción, que posteriormente es
transformado a una escala que determina el porcentaje en peso de azúcares o
sólidos solubles totales, conocida como grados Brix (°Bx).
Sin embargo, existen otras escalas como los grados Baumé (°Be) y los grados
Oechle (°Oe) que también determinan la concentración de estos compuestos en
una muestra (1,8°Bx= 1°Be y 0,2°Bx = 1°Oe)
Por otra parte, los dos principales azúcares fermentables presentes en las
vacuolas de los granos de uva son la glucosa y la fructuosa (que provienen de la
hidrólisis enzimática de la sacarosa durante la asimilación clorofílica) y durante la
maduración la concentración de fructuosa se incrementa.
En los granos maduros las concentraciones máximas de ambos azúcares oscilan
en el rango de 150 y 350 g/L de jugo, según las cepas; en este estado la relación
glucosa/fructosa se encuentra alrededor de 1 y 0,95, mientras que en el vino
esta relación debería disminuir considerablemente y estar comprendida entre 0,2
y 0,4. Para controlar esto, se hace necesaria la medición y seguimiento de los
azúcares durante todo el proceso fermentativo, generalmente en °Bx o su
correspondiente en °Baumé, calculando la relación glucosa/fructosa por medio
del equivalente de azucares reductores obtenido de una tabla de comparación.
Sin embargo, actualmente existen algunos instrumentos digitales que son
capaces de realizar esta conversión de manera automática.

Otro parámetro que puede ser calculado en función de los ºBx obtenidos es el
porcentaje de alcohol probable, fundamental para conocer la calidad del producto
a obtenerse, de acuerdo a la siguiente ecuación:
Alcohol probable (%) = 0.55 . ºBx
Otras aplicaciones de la refractometría en la industria de alimentos están
relacionadas con los productos derivados de frutas y hortalizas, como por
ejemplo, en los enlatados de frutas en almíbar se realiza la denominada prueba
de corte (cut-out), para determinar la homogeneidad de un lote, midiendo el
porcentaje de sólidos solubles totales (°Bx) en el líquido sobrenadante y la pulpa.
En el caso de las hortalizas en conserva se determina el porcentaje de cloruro de
sodio expresado en °Be (los grados Baumé también pueden ser equivalentes en
soluciones de sal siendo la relación de 1°Be = 1% de NaCl) en la salmuera y la
hortaliza con el fin de observar si al cabo de 48 horas se ha llegado al equilibrio
osmótico deseado, además de ver si el peso neto y el peso escurrido del
producto es el correcto para el lote en análisis.
En la elaboración de mermeladas, la refractometría encuentra también una
importante aplicación; existen tres parámetros fundamentales para obtener un
producto de calidad: la acidez, el porcentaje de azúcar y la concentración del
gelificante, en este caso los grados Brix finales deberán encontrarse en el rango
de 55–70 °Bx para mantener su vida de anaquel.
Finalmente debe señalarse que en la actualidad la determinación directa para
análisis utilizando la refractometría, ha sido superada por la información obtenida
por otras técnicas, no obstante, los equipos que miden el índice de refracción son
ampliamente utilizados como herramienta de los detectores de muchos aparatos
modernos, en particular por la cromatografía líquida de alta resolución, la cual
será abordada con detalle en el capítulo 10.
7.2. POLARIMETRÍA
La polarimetría es una técnica instrumental que se basa en la medición de la
rotación óptica producida sobre un haz de luz polarizada al pasar por una
sustancia ópticamente activa.
La actividad óptica rotatoria de una sustancia, tiene su origen en la asimetría
estructural de las moléculas. La causa estructural más simple para que se dé
este fenómeno en los compuestos orgánicos, es la existencia de carbonos
tetraédricos asimétricos; es decir, unidos a 4 grupos diferentes. Estos carbonos
de denominan quirales y provocan que la molécula ópticamente activa presente
una imagen especular no superponible (figura 7.10).
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Figura 7.10. Estructura simplificada del D (+) gliceraldehido (a la izquierda de la figura)

y su imagen especular no superponible, el L (-) gliceraldehido (a la
derecha).
Si bien el fenómeno de la polarización aparece ya descrito en trabajos de

Christian Huygens sólo fue estudiado a fondo en el siglo XIX, gracias a las
investigaciones de autores como el francés Jean Baptiste Biot (1774-1862) o el
alemán Thomas Johann Seebeck (1770-1831). Estos analizaron el
comportamiento de disoluciones de ciertas sustancias de origen vegetal y animal.
Para confirmar sus experiencias, Biot encargó al constructor de instrumentos
Nicolas Fortin (1750-1831) un sencillo aparato que consistía en un prisma
analizador y un tubo cilíndrico para introducir la muestra analizada, a través del
que pasaba la luz polarizada. De este modo, Biot pudo comprobar que ciertas
sustancias de origen natural como “el aceite esencial del laurel” hacían “girar la
luz de derecha a izquierda, al igual que la trementina” mientras que, por el
contrario, “el aceite esencial del limón y la disolución de alcanfor en alcohol” lo
hacían “de izquierda a derecha”. Más adelante, las primeras sustancias fueron
denominadas “levógiras” y las segundas “dextrógiras”. En la figura 7.9, el D (+)
gliceraldehido es una molécula dextrógira, mientras que su isómero óptico, el L
(-) gliceraldehido, es levógira.
7.2.1. Variables que afectan la rotación óptica
La rotación de la radiación polarizada en un plano por compuestos ópticamente
activos puede variar desde varios cientos de grados hasta unas pocas centésimas
de grado. Las variables experimentales que influyen en la rotación observada son
la longitud de onda de la radiación, la longitud de la trayectoria óptica, la
temperatura, la densidad (para el caso de sustancias puras no diluidas) y la
concentración para el caso de disoluciones.
Estas variables están expresadas en la llamada ley de Biot, según
α = [α]tλ ∙ l ∙ c
donde:

α es la rotación óptica observada en el equipo (llamada también rotación

angular), expresada en grados.
[α]tλ es una constante denominada rotación angular específica o rotación

específica a una temperatura t en ºC y una longitud de onda determinada.
l es la longitud del tubo del polarímetro en donde está colocada la muestra
(longitud del paso óptico) expresada en dm.
C es la concentración del soluto, expresada en gramos por mL de disolución
(cuando se trata de líquidos puros, C se sustituye por la densidad)
Rotación angular y rotación angular específica
La rotación angular () es una función lineal de la concentración tanto de la
sustancia examinada como de la longitud del paso óptico (longitud del tubo). Por
lo tanto, al duplicar la concentración se duplicará la rotación angular; al duplicar
la longitud del tubo también se duplicará la rotación.
t
La rotación específica de una sustancia química ([α]λ ) es una característica única
de una sustancia química y se define como la rotación angular  producida por
una columna de sustancia de 1 dm de longitud a una concentración de 1g/Ml,
manteniendo constantes la temperatura y la longitud de onda. La rotación
específica puede ser cualquier ángulo y a menudo tiene una magnitud superior a
± 90°.
Longitud de onda
La longitud de onda del sodio, de 589 nm, es la fuente luminosa más común que
se usa en la polarimetría; de ahí que la mayoría de las rotaciones específicas
tienen como referencia la longitud de onda del sodio, de 589 nm y los datos
publicados se basan en esta longitud de onda. Otras fuentes menos usadas serán
comentadas en más adelante en el epígrafe 7.2.2.
De cualquier modo, la rotación específica se representa siempre teniendo en
cuenta estos los parámetros de temperatura y longitud de onda, por ejemplo,
[α]20
D significa que la rotación específica se halló a 20ºC y empleando la línea D
de sodio a 589 nm.
El convenio adoptado para para designar la dirección de rotación del plano de
polarización, y así el signo de  y [α]tλ , es el siguiente: cuando el plano de
polarización rota en el sentido de las manecillas del reloj, se dice que la sustancia
es dextrógira o dextrorotatoria (+), y cuando la rotación se produce en el
sentido contrario a las manecillas del reloj se dice que la sustancia es levógira o
levorotatoria (–).
7.2.2. Polarímetros
Los polarímetros son instrumentos ópticos para medir la rotación o el “giro” de la
luz. Los laboratorios industriales y académicos usan los polarímetros para una
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variedad de fines, desde el simple control de calidad hasta la investigación

fundamental de estructuras químicas complejas.
En 1828, el fabricante de instrumentos escocés William Nicol (1768-1851) ideó
los prismas que acabaron siendo conocidos con su nombre, y se convirtieron,
más adelante, en una pieza clave de los polarímetros. Se trataba de dos
porciones de espato de Islandia, una variedad incolora de la calcita, unidas por
una de sus caras. Un prisma de Nicol permite polarizar la luz en un determinado
plano, de modo que, al pasar por un nuevo prisma de Nicol, sólo se observa la
intensidad luminosa inicial si éste último se encuentra en la misma posición que
el primero. Si entre los dos prismas se coloca una sustancia ópticamente activa,
el plano de la luz polarizada girará al pasar a través de esta sustancia y, por lo
tanto, el segundo prisma deberá ser colocado en una posición ligeramente
diferente al primero para observar luz. La diferencia entre la posición del primero
y la del segundo indica el poder rotatorio de la muestra analizada y a partir de
este valor se pueden calcular diversas características de la sustancia.
Así, los componentes básicos de un polarímetro son una fuente de radiación
monocromática, un prisma polarizador para producir radiación monocromática,
un tubo de muestra, un prisma analizador con escala circular y un detector, que
en la mayoría de los casos es el ojo humano, aunque en los últimos años han
aparecido algunos polarímetros equipados con fotoceldas u otros dispositivos
para la medición de la intensidad de la luz que emerge del instrumento. La figura
7.11 muestra el esquema general de un polarímetro.
Figura 7.11. Esquema general de un polarímetro

Fuentes. Como la rotación óptica varía con la longitud de onda, se emplea

radiación monocromática, generalmente proveniente de una lámpara de vapores
de sodio que emiten radiación de longitud de onda a 589 nm. Otra fuente
popular es el mercurio, con una longitud de onda de 546 nm; existe cada vez un
mayor interés por la longitud de onda del infrarrojo cercano, de 880 nm, debido
a su capacidad para penetrar las muestras que absorben muestras oscuras y con
colores intensos que absorben luz.
Polarizador y analizador. Por lo general se emplean prismas de Nicol tanto
para producir luz polarizada en un plano (polarizador) como para determinar el
ángulo con que la muestra hace girar la luz polarizada (analizador).
Conjuntamente se utiliza un dispositivo de media sombra que no es más que un
pequeño prisma de Nicol, llamado prisma de Lippich.
Los prismas de Lippich no son más que uno o dos prismas polarizadores de
pequeño tamaño que se colocan a continuación del prisma polarizador, con su
plano de polarización desviado dos o tres grados con respecto a este (figura
7.12), de forma tal que intercepte la mitad (figura 7.12a) o las dos terceras
partes del campo visual (figura 7.12b) respectivamente.
Figura 7.12. Representación esquemática de los sistemas de semipenumbra. (a) con un

prisma de Lippich, (b) con dos prismas de Lippich. ① Polarizador, ② Prismas de Lippich,
③ Tubo de muestras, ④ Analizador.
Para realizar las lecturas, el polarímetro se calibra a cero, con agua destilada,
para la posición de semipenumbra (figura 7.11, oculares A), luego se introduce la
muestra en el tubo y se vuelve a llevar a la posición de semipenumbra (figura
7.11, oculares C); entonces se lee en la escala el valor de rotación angular ().
Otros dispositivos de punto final que operan basándose en el mismo principio del
prisma de Lippich, permiten determinar la potencia rotatoria óptica con una
precisión de 0,005 a 0.01 grados en condiciones ideales. Los detectores
fotoeléctricos permiten obtener una precisión de 0,001 grado.
Tubos de muestra. La muestra a analizar se coloca en tubos cilíndricos,
generalmente de 10 cm de longitud (1 dm). Los extremos son discos de vidrio
planos y paralelos que se fusionan a las paredes del tubo o que se mantienen
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colocados con tapones enrroscados. Para mediciones precisas los tubos están
rodeados de cuna camisa para controlar la temperatura.
Intervalo angular: ambigüedad
Los polarímetros sólo pueden detectar la posición del plano de luz antes de
entrar en la muestra y después de transmitirla a través de la muestra. La
diferencia angular (rotación) puede proporcionar un resultado ambiguo porque
una rotación positiva, por ejemplo, de 110°, es la misma posición del plano que
una rotación negativa de -70. Por lo tanto, una muestra con una rotación de
+110º mostrará igualmente -70º en el intervalo de grados predeterminado
(figura 7.13).
Figura 7.13. Ambigüedad del intervalo angular
El instrumento no puede decidir por sí solo cuántas veces el plano ha pasado por
la posición de referencia de 180º a lo largo de la longitud de la vía de la muestra.
Depende del usuario conocer el intervalo (segmento angular) en el que se situará
el resultado preparar el experimento para establecer la rotación absoluta. Por
esta razón, con polarímetros digitales automáticos como el B+S ADP 220, el
usuario debe seleccionar el intervalo angular de medición, conociendo
(aproximadamente) dónde se situará la lectura.
En el caso de rotaciones angulares grandes (magnitud superior a ±90°), es
habitual que el usuario varíe sistemáticamente la concentración (o longitud del
tubo) y mida las rotaciones correspondientes. De esta manera, es posible
determinar la diferencia entre una rotación de +270º y +90º. Desde luego, con
los polarímetros manuales o semiautomáticos, es posible visualizar el círculo
completo de ±180°. El resultado continúa siendo ambiguo, pero el usuario puede
seleccionar uno de los dos puntos de la escala circular o tambor rotatorio, lo que
resulte adecuado. El instrumento no decide cuál es la posición correcta; es el
usuario quien lo hace.
Con polarímetros completamente automáticos, es habitual proporcionar una
visualización de ±90°. Luego, el usuario debe decidir si continúa experimentando
con concentraciones o longitudes del tubo para investigar la magnitud de la
rotación. Así pues, cuando se visualiza una lectura de 45º, puede que el usuario
deba añadir 180º, sabiendo que la rotación absoluta es de 225º (en este caso,
una dilución del quíntuplo continuará dando una lectura de 45º).

La figura 7.14 muestra las imágenes de dos polarímetros manuales

convencionales comercializados en la actualidad.
Figura 7.14. Polarímetros manuales convencionales
7.2.2.1. Sacarímetros
Una de las sustancias que concentró mayor atención en la segunda mitad del
siglo XIX, por razones médicas e industriales, fue el azúcar, cuyo interés
comercial se acrecentó a lo largo del siglo XIX hasta transformarse en un
producto de gran importancia económica. Bajo este impulso, se desarrollaron
aparatos especialmente adaptados para este objetivo que se denominaron
“sacarímetros”.
El sacarímetro partió entonces de la base del polarímetro como instrumento
destinado a la medición de la cantidad de azúcar en una sustancia. A finales de
dicho siglo, estos aparatos fueron utilizados por médicos y farmacéuticos para
determinar la presencia de glucosa en la orina y facilitar el diagnóstico de la
diabetes, entre otros aspectos.
El principio de funcionamiento de estos sacarímetros es bastante simple.
Disponen de un sistema destinado a la medición de la variación del plano de
polarización de la luz. Dado que esta variación se puede relacionar fácilmente
con la concentración de la sustancia, el aparato puede calibrarse y emplearse
para determinar la cantidad de un determinado producto en una muestra de
composición desconocida. El sacarímetro tiene la ventaja de utilizar como fuente
luz blanca, pero para mejorar las condiciones de la medición se utiliza un filtro de
dicromato de potasio con el fin de absorber el color violeta del espectro.
Las aplicaciones fundamentales de los sacarímetros están en la industria del
azúcar, y la rotación se expresa sobre una escala diferente, llamada Escala
Internacional del Azúcar (ISS en sus siglas inglesas), que se denota como ºZ.
7.2.2.2. Polarímetros automáticos
Los polarímetros automáticos constituyen hoy en día instrumentos analíticos con
una gran difusión en el mercado. Mientras los polarímetros manuales han de ser
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operados por expertos cualificados y su uso requiere un cierto tiempo, los

polarímetros automáticos modernos aceleran dicho proceso, pues proporcionan
valores de medición exactos en tan sólo un segundo. Así pues, se minimizan los
errores ocasionados por el operador y la constancia de medición se mejora
considerablemente: un factor determinante en las mediciones sistemáticas.
Entre sus características y beneficios se encuentran:
• Extremadamente eficientes en el tiempo; con un tiempos de medición de un
segundo.
• Alta precisión y resolución.
• Cómodas pantallas táctiles que permiten realizar la gestión completa de
muestras y de usuarios en el aparato mismo. Igualmente, trae incorporado un
sistema integrado de bases de datos SQL para almacenar datos. Los
polarímetros pueden estar conectados a una computadora, a través de una
interfaz Ethernet, o integrados en una red existente.
• La polarimetría automática es compatible con las Buenas Prácticas de
Laboratorio (GLP, por sus siglas en inglés) y la US FDA
Gracias a la velocidad de medición aumentada, se mejora notablemente la
productividad en el laboratorio, por lo que invertir en un instrumento
automatizado siempre es ventajoso desde el punto de vista económico. De todos
modos, la polarimetría manual tiene todavía cabida en laboratorios más
pequeños y en los procesos formativos. Sin embargo, para las industrias
modernas del sector farmacéutico, químico, azucarero o de procesamiento de
alimentos, los polarímetros automáticos son hoy en día, la mejor opción.
La figura 7.15 muestra dos polarímetros automáticos digitales de importantes
firmas comercializadoras.
(a)
(b) (c)
Figura 7.15. Polarímetros automáticos digitales: (a) Polarímetro automático digital p-8000 de
la firma KRUSS, (b) Polarímetro automático digital 412 ZUZI, (c) Polarímetro automático digital
AP-300 de la firma ATAGO.
Una experiencia cubana es el polarímetro LASERPOL 3M, ideado por un grupo de

investigadores cubanos del Centro de Desarrollo de Equipos e instrumentos
científicos (CEDEIC), para la automatización de los laboratorios de los centrales
azucareros.
La introducción del láser como fuente luminosa en los polarímetros de la serie
LASERPOL, garantiza una alta monocromaticidad, una elevada intensidad
luminosa, mayor transparencia de las soluciones a esta longitud de onda y un
tiempo de vida superior a las 20 000 h.
El LASERPOL 3M está especialmente concebido para su aplicación en la industria
azucarera al cumplir con las recomendaciones de la ICUMSA (Comisión
Internacional para la Uniformidad de los Métodos de Análisis Azucareros).
Además, está unido a un software diseñado al efecto que permite la salida de los
datos a través del monitor de una computadora y por tanto ofrece un elevado
nivel de automatización de las mediciones.
7.2.3. Aplicaciones de la polarimetría
Las mediciones de la rotación óptica pueden emplearse para determinar la
concentración y/o la pureza de una sustancia, o simplemente para detectar la
presencia de una sustancia química ópticamente activa en una mezcla.
t
La rotación angular específica ([α]λ ) de un compuesto bajo condiciones
especificadas proporciona una constante física útil para fines de identificación
semejante al punto de fusión, al punto de ebullición o al índice de refracción. La
actividad óptica es característica de muchas sustancias naturales presentes en
los alimentos, como aminoácidos, esteroides, alcaloides y carbohidratos; la
polarimetría representa un valioso método para la identificación de estos
compuestos.
En el análisis cuantitativo también se emplea la polarimetría para la
cuantificación de compuestos ópticamente activos. Se emplean curvas de
calibración empíricas que relacionan la rotación angular () con la concentración.
Estas gráficas pueden ser lineales, hiperbólicas o parabólicas.
Pero sin dudas, la aplicación fundamental de la polarimetría en el análisis de los
alimentos está en la determinación de azúcares. Por ejemplo si se desea
cuantificar la sacarosa en una muestra donde este disacárido es el único
constituyente ópticamente activo, la determinación se realiza mediante un
sencillo análisis polarimétrico de una solución acuosa de la muestra, ya que la
concentración es directamente proporcional a la rotación angular () medida.
Ahora bien, si en la muestra están presentes otras sustancias ópticamente
activas se requiere de un procedimiento más complejo. En este caso se
determina el cambio en la rotación como consecuencia de la hidrólisis de la
sacarosa, ya sea ácida o enzimática por acción de la enzima invertasa. La base
de este análisis se representa por la siguiente reacción:
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Esta reacción se denomina inversión debido a que la mezcla de glucosa y

fructosa resultante de la hidrólisis de la sacarosa posee una rotación invertida
(levorrotatoria, [α]20
D = – 20º), con respecto al poder rotatorio de la sacarosa
nativa (dextrorrotatoria, [α]20
D = + 66,5º). En este caso la concentración de
sacarosa es directamente proporcional a la diferencia de la rotación angular (),
antes y después de la inversión.
La mezcla de glucosa y fructosa resultante de la hidrólisis de la sacarosa, se
conoce como “azúcar invertido” y tiene una gran importancia en la industria de
los alimentos debido a que su poder edulcorante (dulzor) es superior al de la
sacarosa, y se emplea ampliamente en productos de repostería, panadería,
confitería y jarabes entre otras golosinas y productos horneados.
Otra propiedad importante del azúcar invertido es su propiedad de retardar el
proceso de cristalización, por lo que también tiene amplias aplicaciones en la
elaboración de helados. En este caso, su aplicación en heladería es similar a la
del uso de la dextrosa, glucosas (jarabe o en polvo), y del jarabe de maíz de alta
fructosa (JMAF). Todos estos azúcares cumplen la función de inhibir la
recristalización de la sacarosa y eventualmente de la lactosa. Al ser incristalizable
permite que se mantenga maleable el helado, además ayuda en la formación de
cristales de hielo pequeños por lo que se consigue una textura suave y más
agradable y refinada.
La polarimetría también puede ser utilizada en la determinación de glucosa y de
maltosa en el almidón de papa utilizando la rotación óptica y la valoración con
yodo; así mismo puede emplearse en la determinación del grado de oxidación de
almidones modificados, los cuales se usan como aditivos en la industria
alimentaria.
Otras aplicaciones que pueden citarse son la determinación de lactosa en leches,
la determinación de almidón en varios alimentos, la determinación de glucógeno
en productos cárnicos, la determinación de azúcar invertido y la estimación de
los contenidos relativos de glucosa y fructosa en mostos, vinos dulces y mistelas,
mediante el establecimiento de la relación entre azúcares reductores y desviación
polarimétrica a 20°C, entre otra muchas aplicaciones.
Debe señalarse que en caso de la determinación del perfil de monosacáridos y
disacáridos en alimentos se realiza hoy en día por otros métodos más potentes
como la cromatografía líquida de alta resolución, la cual será abordada en al
capítulo 10.
1. Consulte el apéndice B-7, en el que aparece un resumen del
presente capítulo.
epígrafe 14.1. Ejercicios propuestos.
BIBLIOGRAFÍA.
Madrid.
5. Hernández, A. (1995). Análisis Químico Cuantitativo. Ed. Felix Varela. La
Habana.
London.
SA. Madrid.
Dykinson. Madrid.
40d78409-8f5a-44ad-af96-811f110af4ad
8 Introducción a los métodos cromatográficos
8.1. GENERALIDADES
La separación de los componentes de mezclas complejas de compuestos
naturales o sintéticos con vistas a su identificación y cuantificación, ha sido
siempre un problema de gran interés para la química analítica. En este sentido el
desarrollo se ha ido moviendo desde la aplicación de métodos químicos clásicos
hasta el empleo de técnicas instrumentales sofisticadas que aventajan a las
primeras en cuanto a rapidez, exactitud, precisión y sensibilidad.
El origen de los métodos cromatográficos se remonta a la segunda mitad del
siglo XIX. Los primeros trabajos científicos de separaciones físicas notables
fueron reportados por Runge en 1855 y Schonbein en 1861. Estos investigadores
aplicaron una mezcla compleja de colorantes en un punto de una hoja de papel
de filtro e hicieron llegar a este un solvente, observando que la mancha inicial se
expandió radialmente separándose en sus componentes. Aunque estos
resultados fueron novedosos transcurrieron 80 años para que resurgiera la
cromatografía de papel como hoy se le conoce.
Alrededor de 1892, Redd logró separaciones de compuestos químicos basados en
principios físicos. Para ello usó tubos llenos de kaolin en los que separó
dicromato de potasio de eosina, así como iones férricos de iones cúpricos. Hoy se
conoce este procedimiento como análisis frontal en cromatografía en columna.
Pero el verdadero padre de la cromatografía fue el botánico ruso Mijail Tswett, el
cual publicó en 1903 la separación exitosa de varios pigmentos vegetales
extraídos de una planta con éter de petróleo, mediante la aplicación del extracto
vegetal en un tubo de vidrio relleno con carbonato de calcio. Tswett observó que
una vez aplicado el extracto, al hacer pasar éter de petróleo a través de la
columna la banda coloreada inicial se movía a través de esta y comenzaba a
separarse en varias bandas igualmente coloreadas. La figura 8.1 ilustra este
experimento.
Sin restar mérito a sus predecesores, Tswett no solo logró la separación de los
pigmentos vegetales, sino que, por las bandas coloreadas obtenidas, fue el
primero en acuñar el término “cromatografía” (del griego “croma atos” que
significa color y “graphos” que se refiere a escritura). Además, con gran visión
científica, no excluyó la posibilidad de que el método fuera aplicado también en
la separación de compuestos incoloros siempre y cuando se utilizara una técnica
de visualización de las zonas correspondientes a cada compuesto.
169
8. Introducción a los métodos cromatográficos
Figura 8.1. Experimento de Mijail Tswett
En la actualidad se mantiene el término de cromatografía, aun cuando la mayoría

de las separaciones que se realizan por esta técnica, se aplican a compuestos
incoloros.
Así, la cromatografía puede definirse como “aquel método de separación de
los componentes de una mezcla de solutos, basado en las diferentes
velocidades con que se mueven cada uno de ellos a través de un lecho
estacionario de gran desarrollo superficial (fase estacionaria) mientras son
arrastrados por un fluido en movimiento (fase móvil)”.
En el experimento de Tswett, la fase estacionaria es el carbonato de calcio
mientras que la fase móvil es el éter de petróleo. Los pigmentos vegetales de la
muestra tienen diferencias de afinidad por la fase estacionaria (algunos son más
afines que otros), lo que conduce a que se muevan por ella a diferente velocidad
mientras son arrastrados por el éter de petróleo (las más afines con la fase
estacionaria se moverán más lentamente mientras que las mas solubles en la
fase móvil lo harán más rápido); precisamente esa diferencia de velocidad es lo
que posibilita la separación de los compuestos.
En 1974 la Unión Internacional de Química Pura y Aplicada (IUPAC, del inglés
Internacional Union Pure Applied Chemistry) definió la cromatografía del
siguiente modo:
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“La cromatografía es un método físico usado principalmente para la separación

de los componentes de una muestra, en el cual estos se distribuyen entre dos
fases, una de ellas estacionaria mientras que la otra se mueve. La fase
estacionaria (FE) puede ser un sólido o un gel y puede estar empacada en una
columna, esparcida en forma de capa o distribuida como una película. La fase
móvil (FM) puede ser un líquido o un gas”.
8.2. CLASIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS

Los métodos cromatográficos pueden clasificarse en función de diferentes
criterios los cuales se describen a continuación.
A. En función del mecanismo físico químico que rige la separación. En
este sentido los métodos cromatográficos pueden se clasifican en
cromatografía de adsorción, cromatografía de reparto, cromatografía de
intercambio iónico y cromatografía de filtración sobre gel. Más adelante se
explicarán con detalle estos cuatro mecanismos.
B. En función de la disposición de la fase estacionaria. Así, se define la
cromatografía en columna cuando la separación ocurre en un sistema
cerrado (una columna), y la cromatografía plana cuando la separación
ocurre en una superficie plana y abierta (un papel o una capa delgada).
C. En función del estado de agregación de la fase móvil. En este caso se
habla de la cromatografía líquida, cuando la fase móvil es un líquido y la
cromatografía de gases, cuando la fase móvil es un gas. Si se considera
además el estado de agregación de la fase estacionaria, el cual puede ser
sólido o líquido, aparecen combinaciones en función de la fase móvil
empleada.
La cromatografía líquida clásica utiliza como fase estacionaria un líquido
adsorbido por un sólido (cromatografía líquido – líquido, en la que pueden
ocurrir los mecanismos de reparto y filtración sobre gel) o un sólido
propiamente (cromatografía líquido – sólido, en la que tiene lugar los
fenómenos de adsorción o intercambio iónico). En cualquiera de los casos
considerados, la fase estacionaria puede estar contenida en una columna o
dispuesta sobre una placa.
La cromatografía líquida en columna evolucionó en su desarrollo hacia la
cromatografía líquida de alta resolución (HPLC, del inglés High Performance
Liquid Chromatography), mientras que la cromatografía plana encuentra hoy
un gran despliegue en la cromatografía en capa delgada de alta resolución
(HPTLC, del inglés High Performance Thin Layer Chromatography).
En cromatografía de gases, la fase móvil es un gas que transporta al soluto,
que debe encontrarse en estado gaseoso. La técnica más utilizada es la
cromatografía de reparto gas-líquido, que emplea como fase estacionaria un
líquido no volátil que recubre el interior de la columna. En cambio, la
cromatografía de adsorción gas-sólido utiliza como fase estacionaria

partículas sólidas sobre las que el soluto puede adsorberse.

D. En función de los objetivos que se persigan. Cuando los métodos
cromatográficos se aplican con fines cualitativos y/o cuantitativos se habla de
cromatografía analítica. En cambio cuando el objetivo es simplemente aislar
compuestos para posteriormente continuar investigaciones con ellos, se habla
de cromatografía preparativa.
Obviamente, en la práctica estas clasificaciones se mezclan. Así, la cromatografía
líquida en columna puede experimentar los cuatro mecanismos de separación
(adsorción, reparto, intercambio iónico y filtración sobre gel) y aplicarse con fines
analíticos o preparativos; de forma parecida sucede con la cromatografía plana
(que es también cromatografía líquida), en tanto la cromatografía de gases tiene
lugar solo en columna y se ponen de manifiesto los mecanismos de reparto y
adsorción.
Las figuras 8.2 y 8.3 resumen dos maneras de integrar los criterios de
clasificación de los métodos cromatográficos descritos con anterioridad.
Figura 8.2. Clasificación de los métodos cromatográficos tomando como eje conductor el
estado de agregación de la fase móvil.
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Figura 8.3. Clasificación de los métodos cromatográficos tomando como eje conductor la
disposición de la fase estacionaria
8.3. MECANISMOS DE SEPARACIÓN CROMATOGRÁFICA

8.3.1. Cromatografía de adsorción
La totalidad de los primeros trabajos realizados en cromatografía correspondía al
tipo denominado de adsorción, en el cual la fase estacionaria (FE) es la superficie
de un sólido finamente dividido. De ahí que la cromatografía de adsorción se
inserte en la clasificación del tipo de cromatografía líquido-sólido o gas-sólido.
Cuando la muestra disuelta en la fase móvil (FM) se pone en contacto con las
primeras capas de adsorbente, este retiene parcialmente al sólido,
estableciéndose con rapidez un equilibrio entre la cantidad de muestra en la FM y
la retenida por el adsorbente (FE). Este equilibrio es dinámico y reversible.
La separación se realiza en virtud de las diferencias de comportamiento de las
sustancias que desean separarse, atendiendo a su adsorción preferencial por la
superficie de un sólido (FE) mientras se mueven por la acción de un disolvente
(FM) que puede ser un líquido o un gas (aunque, como ya se ha mencionado, en
lo adelante nos referiremos solamente a la cromatografía líquido-líquido pues la
cromatografía gas-líquido se estudiará en un tema independiente).

La FE adsorbe los componentes de la mezcla de sustancias que desean

separarse, mientras que la FM será la encargada de desorberlos. En dependencia
de la fortaleza con que los compuestos se adsorban a la FE, la FM podrá
desorberlos (arrastrarlos) con mayor o menor facilidad. Es este fenómeno el que
posibilita que los solutos puedan ser separados, dado que, en función de su
afinidad por la FE, los mismos se moverán a diferentes velocidades. Se plantea
que el soluto compite por los sitios activos de la superficie del sólido (FE) con el
disolvente utilizado como eluyente (FM).
Es importante señalar que la adsorción es un fenómeno superficial, que no
involucra la formación de enlaces químicos entre el soluto y la FE. La fuerza con
la que los adsorbentes retienen a los componentes de la muestra es de
naturaleza muy diversa, destacándose entre ellas las causadas por fuerzas
electrostáticas y de Vander Walls e interacciones dipolo-dipolo. La adsorción de
los componentes de la muestra depende de la estructura de las sustancias y del
desarrollo superficial del adsorbente. Mientras mayor sea la superficie específica
de un sólido, mayor será su poder de adsorción.
La elección del adsorbente es importante en el éxito de la separación que se
pretende realizar. La sílica gel o gel de sílice es sin duda el adsorbente (FE) más
utilizado para la cromatografía de adsorción aunque también se utiliza mucho el
óxido de aluminio (alúmina) y en menor proporción otros como el óxido de
magnesio activo, el carbón activo, el silicato de magnesio activo y la celulosa.
La actividad de un adsorbente depende de su naturaleza y del tratamiento previo
al cual este haya sido sometido. Esta actividad es una medida de la
disponibilidad de los centros activos (de adsorción) de un adsorbente. Por lo
general los adsorbentes muy activos tienden a captar agua del ambiente,
disminuyendo así gradualmente su capacidad adsortiva.
Para lograr el grado de actividad requerido en un proceso analítico dado, se
precisa deshidratar completamente el adsorbente. En el caso del gel de sílice y el
óxido de aluminio (los cuales se comercializan con cierto contenido de humedad),
la activación se realiza calentando el adsorbente a 350 ºC durante 1 – 2 horas.
La elección de la fase móvil (FM) es fundamental para el éxito de la
cromatografía de adsorción. Usualmente se utilizan solventes orgánicos de
diferente capacidad de desorción. El parámetro que define la capacidad de un
solvente (FM) para desorber una sustancia es la fuerza de elución, la cual está
relacionada con su polaridad y con su capacidad para competir con los solutos
con los centros activos del adsorbente. De forma general, a mayor polaridad del
solvente, mayor fuerza de elución. La figura 8.4 muestra algunos solventes de
uso frecuente en cromatografía de adsorción organizados en función de su
polaridad y fuerza de elución.
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Figura 8.4. Solventes de empleo frecuente en cromatografía de adsorción
Existen diferencias en la tendencia de los compuestos a adsorberse. Por ejemplo

puede encontrarse una correlación positiva entre las propiedades de adsorción y
el número de grupos hidroxilos de una molécula; existe una correlación similar
con los dobles enlaces y los compuestos que contienen ciertos grupos funcionales
tienden a ser más fuertemente retenidos que otros. Así, la tendencia a ser
adsorbido disminuye en el siguiente orden: ácido > alcohol > carbonilo > ester >
hidrocarburos. También influye la naturaleza del adsorbente (FE). Gran parte de
los conocimientos sobre este campo son empíricos y la elección del adsorbente
(FE) y del disolvente (FM) para una separación dada debe hacerse con frecuencia
en base a tanteos.
8.3.2. Cromatografía de reparto
La cromatografía de partición o reparto (cromatografía líquido-líquido o gas-
líquido) se originó en 1941 a partir del trabajo de los ganadores del Premio
Nobel, Martin y Synge.
Dicho procedimiento se fundamenta en el fenómeno de reparto, es decir, en la
distribución de una mezcla de solutos (sustancias que se desean separar) entre 2
fases inmiscibles. El reparto o distribución del soluto tiene lugar, atendiendo a su
solubilidad preferencial (lo cual depende de su polaridad), entre la fase
estacionaria (FE) líquida unida a un soporte sólido inerte, y la fase móvil (FM)
que resulta ser el disolvente que fluye a través de la FE y que puede ser un
líquido o un gas.
En lo adelante nos referiremos solamente a la cromatografía líquido-líquido, pues
la cromatografía gas-líquido se estudiará en un capítulo independiente.
Cuando la FE líquida es polar (generalmente el agua) y la FM es un solvente

apolar, se habla de cromatografía de partición clásica o cromatografía de fase
normal y los solutos se distribuirán según su solubilidad preferencial por alguna
de las 2 fases. Así por ejemplo, si se desean separar 2 solutos de diferente
polaridad empleando como FE el agua y como FM el éter de petróleo, aquel de
los solutos que sea menos polar viajará por la FE a mayor velocidad puesto que
será más fácilmente arrastrado por la FM en tanto el otro se moverá más
lentamente dada su afinidad preferencial por la FE.
Ahora bien, cuando la FE líquida es apolar, se habla entonces de cromatografía
de fase reversa y en este caso la FM ha de ser un solvente polar o al menos de
mayor polaridad que la FE. La cromatografía de fase reversa se instrumentó
ordinariamente en sus inicios embebiendo el soporte sólido con una sustancia
apolar.
Dada la naturaleza del proceso de partición es necesario escoger adecuadamente
los solventes a utilizar. En primer lugar estos deben tener una solubilidad con la
FE limitada; en caso ideal la FM y la FE deberían ser inmiscibles entre si.
El proceso de partición puede describirse a través de la ley del reparto de Nernst
según:
C1
K=
C2
donde K es el coeficiente de reparto, C1 y C2 representan respectivamente las

concentraciones en equilibrio del soluto en las fases estacionaria y móvil.
Otro parámetro importante relacionado con la constante de reparto, que expresa
la eficiencia de un proceso cromatográfico es el factor de separación (). Así para
dos solutos A y B, la magnitud  puede calcularse según:
KA
=
KB
Siendo KA y KB las constantes de reparto de los solutos A y B respectivamente.

Cuando  = 1 no habrá separación pues ambos solutos tienen idéntica afinidad
por la FM y la FE, y consecuentemente la separación entre ellos será mayor
cuanto mas difiera  de la unidad.
Los soportes utilizados para contener la FE líquida en cromatografía de reparto
requieren poseer una buena capacidad de retención de líquidos mientras que por
naturaleza propia o a consecuencia de la adsorción de la FE líquida, debe carecer
de acción frente a los solutos que se pretenden cromatografiar; quiere decir que
bajo las condiciones que se realice el análisis no deben producirse fenómenos de
adsorción pues la combinación de fenómenos de reparto y adsorción en un
mismo procedimiento cromatográfico conduce a una mala separación y a
pérdidas de solutos en el proceso.
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Los soporte más comúnmente usados en cromatografía de reparto son la sílica

gel, el polvo de celulosa y el kieselguhr, entonos los casos, embebidos con la
fase estacionaria.
Un tipo de empaque cuyo uso se ha generalizado en la actualidad es la llamada
cromatografía de fase ligada o cromatografía de fase químicamente unida, que
consiste en unir químicamente determinados grupos funcionales al soporte. Las
superficies de fase ligada ofrecen una considerable ventaja con respecto a los
líquidos sostenidos sobre sólidos ya que el soporte no puede perder su líquido
(FE) por la acción de la fase móvil. Sobre este particular se profundizará con
detalles en el capítulo 8. A modo de ejemplo, la tabla 8.1 ilustra el
comportamiento de algunas fases ligadas comercializadas industrialmente.
Tabla 8.1. Cromatografía de fase ligada con soporte de sílica gel.
Nombre Grupo funcional unido Tipo Aplicaciones

Tipo Diol Si-(CH2)3-O-CH2-CH(OH)-CH2(OH) Fase normal Compuestos polares
Tipo Amino Si-(CH2)3-NH2 Fase normal Compuestos polares
Tipo Ciano Si-(CH2)3-CN Fase normal Compuestos
moderadamente
polares y polares
Tipo Ester Si-OR Fase normal Compuestos polares
Tipo Siloxano Si-O-SiR Fase normal Compuestos polares
RP-2 o C-2 Si-(CH3)2 Fase reversa Compuestos apolares
y moderadamente
polares
RP-8 o C-8 Si-(CH2)7-CH3 Fase reversa Compuestos apolares
y moderadamente
polares
RP-18 o C-18 Si-(CH2)17-CH3 Fase reversa Compuestos apolares
y moderadamente
polares
La fuerza de elución de los solventes empleados en cromatografía de partición

dependerá del tipo de la naturaleza de la FE. Así, si estamos en presencia de una
partición en fase normal los solventes más polares tendrán una mayor fuerza de
elución pues serán más afines con los solutos que interactúan con la FE, en
cambio si se trata de una cromatografía de fase reversa, los solventes menos
polares serán los que con mayor facilidad interactuaran con los solutos
evidenciando una mayor fuerza de elución.
8.3.3. Cromatografía de intercambio iónico
La interacción que tiene lugar en este tipo de cromatografía es de naturaleza
iónica, es decir los componentes de la mezcla que se desean separar tienen que
estar en forma de iones cargados.
Los intercambiadores de iones son compuestos orgánicos sintéticos llamados
resinas, que poseen cargas positivas o negativas y están unidos a contraiones
lábiles de carga opuesta que son desplazados con facilidad por los iones de la
muestra, los cuales interaccionan con la resina y ocupan sus centros activos
(positivos o negativos) luego de intercambiarse con los contraiones.
Dicho de otra forma, la separación se basa en el equilibrio que se establece por

parte de los iones del soluto entre el disolvente (FM) y los grupos cargados
positiva o negativamente contenidos en la fase estacionaria sólida (resina
intercambiadora). Así, la cromatografía de intercambio iónico en función del
estado de agregación de la FM y la FE se clasifica como cromatografía líquido –
sólido.
Las resinas intercambiadoras pueden ser catiónicas o aniónicas, en dependencia
de su carga y de los solutos que intercambien.
Las resinas catiónicas poseen grupos funcionales cargados negativamente y se
emplean para separar iones de carga positiva (de ahí su nombre de catiónicas)
que son atraídos por la resina y se intercambian con los contraiones lábiles.
Las resinas aniónicas están por el contrario cargadas positivamente y se emplean
para separar iones de carga negativa (de ahí su nombre de aniónicas) que se
intercambian igualmente con los contraiones lábiles.
La figura 8.5 muestra un esquema de la estructura general de las resinas
intercambiadoras unidas a sus contraiones lábiles.
Figura 8.5. Resinas intercambiadoras.
El mecanismo de intercambio iónico se describe a continuación tomando como

ejemplo la separación de una mezcla de iones de carga negativa, para lo cual es
necesario emplear una resina aniónica. Las
etapas que tienen lugar en el proceso de
separación cromatográfica son las
siguientes:
1. Equilibrar la resina
El primer paso del proceso consiste en
equilibrar la resina de intercambio iónico, es
decir hacer pasar a través de la columna
cromatográfica que contiene la fase
estacionaria una disolución que aporte los
contraiones lábiles de carga opuesta
(negativa en este caso pues se trata de una
resina aniónica) que ocupe los sitios activos
Figura 8.6.
positivos de la resina. (figura 8.6) Equilibrio de la resina
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2. Aplicación de la muestra
En esta segunda etapa se aplica la muestra formada por los iones de carga
negativa que se desean separar. Los componentes de la mezcla son atraídos por
la fase estacionaria (resina aniónica) y se intercambian con los contraiones
lábiles ocupando los sitios activos de la resina. La fuerza con la que estos aniones
se fijen a la resina dependerá de su densidad de carga; así, los iones de mayor
densidad de carga negativa se fijarán con mayor fuerza mientras que los de
menor densidad de carga lo harán más débilmente. De cualquier manera todos
los aniones desplazarán a los contraiones y quedarán adheridos a la resina de
carga opuesta, ocurriendo así el primero de los intercambios (figura 8.7)
Figura 8.7. Aplicación de la muestra
3. Separación de los componentes
Para eluir los componentes fijados a la resina se hace

pasar ahora por la columna cromatográfica un
disolvente que actúa como fase móvil y contiene iones
de carga negativa que efectúan un segundo intercambio
iónico desplazando a los solutos de los centros activos
de la fase estacionaria (figura 8.8).
La diferencia de velocidad de los iones de la muestra
estará en dependencia de la fuerza con estén fijados a
la resina, es decir dependerá de su fuerza iónica.
Aquellos solutos más débilmente unidos a la fase
estacionaria serán los primeros en ser desplazados
(intercambiados) por los iones de la fase móvil y por lo
tanto de moverán a mayor velocidad, en tanto aquellos
Figura 8.8. Separación
más fuertemente adsorbidos, por poseer una mayor de los solutos
densidad de carga negativa serán más difíciles de

desplazar por el disolvente iónico (FM) y se moverán a menor velocidad (figura

8.8), lo que garantiza su separación de los primeros.
4. Regeneración de la resina
Una vez separados los solutos (aniones en este caso), es necesario regenerar la
resina para recuperar sus condiciones iniciales, es decir, hacer pasar nuevamente
la solución contentiva de los contraiones lábiles. Así, quedará lista la resina para
realizar un nuevo proceso de separación por intercambio iónico.
Resulta esencial comprender que la fuerza con que es retenido un ion por un
intercambiador depende de la naturaleza de ambos. Así, para una misma resina
las diferencias con que son retenidas las distintas especies iónicas de una
solución dependerán de la naturaleza de los iones y del pH del medio, pues este
último influye en la ionización del compuesto.
Por ejemplo, un intercambiador catiónico a través del cual se pasa una solución
de cationes de diversa carga, retiene preferentemente y con mayor fuerza
aquellos de mayor carga y con menor fuerza a los de carga unitaria,
estableciéndose un orden de retención como se indica a continuación: M 4+ > M3+
> M2+> M+.
Por otra parte, dentro de un grupo de cationes con la misma carga se establece
también un orden de retención, siendo fijados con mayor fuerza aquellos
cationes con menor diámetro efectivo y aquellos menos fuertemente retenidos
serán los más voluminosos.
Los grupos funcionales de las resinas catiónicas son principalmente los grupos
sulfónico o carboxilo dispuestos sobre una matriz orgánica de poliestireno o
poliacrílica. Las resinas aniónicas por su parte, están constituidas por bases
insolubles cuyos grupos funcionales son aminas terciarias o grupos amonio
cuaternario dispuestos igualmente sobre una soporte orgánico de poliestireno.
La figura 8.9 muestra la estructura de dos resinas intercambiadoras en soporte
de celulosa, mientras en las tablas 8.2 y 8.3 se presentan algunos
intercambiadores de mayor empleo en cromatografía.
Figura 8.9. Estructura de dos resinas intercambiadoras en soporte de celulosa
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Tabla 8.2. Intercambiadores comerciales usados en cromatografía
Rango útil
Tipo Nombre comercial Fortaleza Grupo funcional
de pH
Amberlite IR 120 Ácido fuerte 1-14
Dowex 50 (X1-X16) Ácido fuerte -SO3H 1-14
Wofatit KPS 200 Ácido fuerte -SO3H 1-12
Celulosa fosforilada Ácido fuerte -O-PO3-H2
Catiónico
Amberlite IRC 50 Ácido débil -COOH 5-14
Wofatit CF 300 Ácido débil -COOH
Zeocarb 226 Ácido débil -COOH
Carboximetil celulosa Ácido débil -O-CH2-COOH
Amberlite IRA 400 Base muy fuerte -N (CH3)3 1-14
Dowex 1 (X1-X16) Base muy fuerte -N (CH3)3 1-14
Amberlite IRA 410 Base fuerte -N (alquil)2 alquilol 1-12
Aniónico Dowex 2 (X1-X10) Base fuerte -N (alquil)2 alquilol 1-14
DEAE Celulosa Base fuerte -C2H4-N(-C2H5)2
Amberlite IR 45 Base débil -NR2 1-9
Dowex 3 Base débil -NR2 1-9
Tabla 8.3. Tipos de intercambiadores y sus aplicaciones
Tipo de resina Soporte + grupo funcional Aplicaciones

Cambiadora de cationes Poliestireno sulfonado. Cationes, vitaminas, péptidos y
(fuertemente ácida) aminoácidos.
Cambiadora de cationes Polimetacrilato carboxilado. Cationes, antibióticos y bases
(débilmente ácida) orgánicas.
Cambiadora de aniones Poliestireno con amina Alcaloides, halógenos, aniones y
(fuertemente básica) cuaternaria. ácidos grasos.
Cambiadora de aniones Poliestireno con amina Iones complejos y aniones de
(débilmente básica) terciaria o poliamida diferente valencia.
8.3.4. Cromatografía de filtración sobre gel

Este tipo de cromatografía, conocido por las siglas GPC (del inglés Gel
Permeation Chromatography), también llamada cromatografía de exclusión
molecular, se usa en la separación de mezclas de compuestos en función de la
masa molecular de estos (magnitud que está relacionada directamente con sus
dimensiones). Así, esta cromatografía es aplicable a compuestos con masas
moleculares superiores a 2000, los cuales pueden ser solubles en agua o solubles
en solventes orgánicos.
La fase estacionaria se obtiene al mezclar un material polímero inerte de elevado
grado de hidratación con agua o soluciones buffer. El resultado es un gel
formado por gránulos o perlas con estructura parecida a un tamiz que contienen
poros de diferente tamaño (figura 8.10)
Figura 8.10. Estructura del gel para cromatografía de exclusión molecular
El mecanismo de separación
consiste en que la solución de
la muestra se hace pasar a
través del gel que posee un
tamaño de poro determinado.
Las moléculas de alto peso
molecular con tamaño superior
al de los poros de las partículas
del gel no pueden penetrar en
los mismos (se dice que son
excluidas) y se mueven
libremente a través de la fase
acuosa en el exterior de los
gránulos, entre los espacios
interpartícula, mientras que las
de tamaño inferior al de los Figura 8.11. Proceso de exclusión molecular
visto con aumento
poros se introducen en estos y
ven obstaculizado su paso a través del gel, por lo que su avance a través de la
columna se retrasa (figura 8.11)
La fase móvil está constituida por moléculas muy pequeñas que pueden penetrar
en todos los poros y son las últimas en salir de la columna. En general el orden
de elución está dado por el tamaño (o la masa molecular). Las moléculas
40d78409-8f5a-44ad-af96-811f110af4ad
grandes eluyen primero y le siguen las demás en orden decreciente de sus

masas moleculares. La figura 8.12 ilustra este comportamiento.
Figura 8.12. Mecanismo de exclusión molecular
En la cromatografía de filtración sobre gel la fase móvil es generalmente agua o

soluciones buffer y la fase estacionaria es el líquido acuoso del gel que se
encuentra en el exterior de los gránulos en los espacios interpartículas, de
manera que en este caso se trata de una cromatografía líquido – líquido.
Los polímeros empleados para formar el gel pueden obtenerse con diferente
tamaño de poro, lo que condiciona el intervalo de masas moleculares que pueden
ser separadas eficientemente. En sus inicios, los polímeros más empleados para
GPC fueron, entre otros, el Sephadex y el Biogel. La tabla 8.4 muestra las
características de los geles obtenidos con estos polímeros.
Tabla 8.4. Algunos geles hidrófilos
Rango aproximado de separación

Tipo de gel
Proteínas globulares (PM) Polisacáridos (PM)
Sephadex G-25 1000 – 5000 100 – 5000
Sephadex G-50 1500 – 30 000 500 – 10 000
Sephadex G-100 4000 – 150 000 1000 – 100 000
Sephadex G-150 5000 – 400 000 1000 – 150 000
Sephadex G-200 5000 – 800 000 1000 – 200 000
Biogel p-10 – 5000 – 17 000
Biogel p-30 – 20 000 – 50 000
Biogel p-100 – 40 000 – 100 000
Biogel p-200 – 80 000 – 300 000
Biogel p-300 – 100 000 – 400 000

Las aplicaciones fundamentales de la cromatografía de exclusión molecular están

dirigidas a la separación de sustancias de alto peso molecular como proteínas,
polisacáridos, polímeros de triacilgricéridos, colorantes de alto peso molecular,
virus, ribosomas, bacterias, etc.
También se emplea en la desalinización y separación de moléculas de bajo peso
molecular mezcladas con moléculas de alto peso molecular y en la determinación
del peso molecular de macromoléculas.
Antes de concluir este capítulo, debe señalarse que en el presente libro no se
explicarán los diferentes métodos cromatográficos siguiendo la cronología
histórica de su aparición y desarrollo sino que, por razones metodológicas,
seguiremos el esquema propuesto en la figura 8.3. Es decir, se abordarán
primero los métodos de cromatografía en columna líquida y gaseosa (en ese
orden, a pesar que en el desarrollo histórico de los métodos cromatográficos la
cromatografía de gases fue la primera en alcanzar avances significativos en la
separación de compuestos volátiles y mostró un claro predominio a mediados del
pasado siglo sobre el resto de las técnicas cromatográficas) y finalmente los
métodos de cromatografía plana.
Consulte los apéndices C-1 y C-2, en los que aparece un resumen
del presente capítulo.
BIBLIOGRAFÍA.
Madrid.
2. Dierksmeier, G. (2005). Métodos cromatográficos. Editorial Científico Técnica.
Impreso por Impresol Ediciones Ltda. Bogotá, Colombia.
3. IUPAC (1974). Recommendations of nomenclature for chromatography.
IUPAC 37, 447-462.
SA. Madrid
5. Shoenbein, C. F. (1861). Verhandel. Naturforsch. Ges. Basel 3 Seite 249.
7. Tswett, M. (1903). Proc. Warsaw Soc. Nat. Sci. Biol. Sect.
40d78409-8f5a-44ad-af96-811f110af4ad
9 Cromatografía en columna
9.1. GENERALIDADES.
La cromatografía en columna utiliza para su realización unos tubos largos y
estrechos dentro de los cuales está contenida la fase estacionaria. El proceso de
separación cromatográfica que tiene lugar en el interior de la columna se
describe a continuación:
Considérese una muestra de dos componentes, A y B, que se van a separar en
una columna por cromatografía, utilizando una fase estacionaria sólida o líquida
(según se describió en el epígrafe 8.3 del capítulo 8) y como fase móvil un
líquido que actúa como eluyente. La figura 9.1 muestra las distintas etapas de la
separación.
Figura 9.1. Etapas de la separación cromatográfica
Inicialmente se introduce la muestra con los componentes A y B, disuelta en el

eluyente (FM), en la columna (tiempo t0), con lo que A y B se distribuirán entre
las dos fases. Al ir añadiendo eluyente a la columna la muestra irá descendiendo,
pero a la vez se producirá una distribución de sus componentes entre las fases
móvil y estacionaria atendiendo a las diferencias de afinidad de los componentes
por ambas fases en función del mecanismo de separación que tenga lugar
185
9. Cromatografía en columna
(adsorción, reparto, intercambio iónico o exclusión molecular). Estas diferencias

de afinidad irán produciendo la separación de A y B (tiempos t1 y t2) en la medida
que transitan por la columna. Finalmente, los componentes llegan a salir por el
extremo de la columna donde pueden ser recogidos. El primer componente en
salir (eluir) será el menos retenido por la fase estacionaria, en este ejemplo, el A
(tiempo t3), y posteriormente eluirá aquel que haya sido más fuertemente
retenido, en este caso el B (tiempo t4).
En el extremo de la columna se puede colocar un detector que permita medir
una magnitud representativa de la concentración de cada componente. La señal
(magnitud medida) se representa habitualmente en función del tiempo y la
gráfica obtenida se conoce como cromatograma. Al pie de la figura 9.1, se
recoge el cromatograma que corresponde a la separación efectuada. Las señales
obtenidas de cada componente se denominan picos, que quedan definidos por el
tiempo de retención (tiempo correspondiente a la aparición del pico del soluto en
el cromatograma respecto al momento inicial de introducción del compuesto en
la columna) y por el área del pico (representativa de la concentración del
componente). Así, los tiempos de retención pueden utilizarse para análisis
cualitativo, y las áreas, en análisis cuantitativo.
9.2. ETAPAS DE TRABAJO DE LA CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA EN COLUMNA

CONVENCIONAL.
En los marcos de este libro, definimos la cromatografía líquida en columna

convencional como aquella que se realiza por etapas y con un bajo o ningún
grado de automatización. En la actualidad este procedimiento se emplea muy
poco y ha dado paso a la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC, del
inglés High Performance Liquid Chromatography), sin embargo los principios
más generales siguen siendo los mismos y la explicación de cada una de las
etapas de separación por cromatografía convencional ayudará a comprender más
adelante el funcionamiento automatizado de la HPLC.
Las etapas generales de este proceso son: selección y preparación de la fase
móvil y la fase estacionaria, aplicación de la muestra, corrida cromatográfica y
elución, recogida de los eluatos y detección de los componente separados.
9.2.1. Selección y preparación de la fase móvil y la fase estacionaria
La selección de la fase móvil y la fase estacionaria dependerá de la estructura y
características de los compuestos a separar, lo que condiciona el mecanismo de
separación que tendrá lugar en la columna cromatográfica. Así, si se trata de
compuestos en los que predominan sus características de polaridad puede
elegirse la cromatografía de reparto o la cromatografía de adsorción con sus
correspondientes soportes y eluyentes (ver epígrafe 7.3, capitulo 7). Sin
embargo si los solutos a separar son ionizables, una opción importante sería la
elección de resinas intercambiadoras como fase estacionaria, privilegiando el
40d78409-8f5a-44ad-af96-811f110af4ad
mecanismo de intercambio iónico. Finalmente, si se desean separar compuestos

de masas moleculares superiores a 2000, entonces habría que acudir a la
cromatografía de filtración sobre gel.
Una vez seleccionada la fase estacionaria,

esta se coloca dentro de la columna, la cual
es generalmente un tubo de vidrio de longitud
variable cuyas dimensiones guardan la
relación 30:1 (largo:diámetro interno).
La columna lleva colocada en su extremo
inferior una llave que actúa como regulador
del flujo de la fase móvil, y muy cerca de
este extremo poseen un material filtrante,
que puede ser vidrio aglomerado de diversas
porosidades, para evitar que la fase
estacionaria se salga. Así mismo, una
columna clásica puede poseer en su extremo
superior un ensanchamiento que sirve de
reservorio del solvente, lo que permite
mantener durante mayor tiempo condiciones
estables de flujo de la fase móvil en la
columna.
La figura 9.2 muestra un esquema de una
columna cromatográfica para trabajos
rutinarios.
Figura 9.2. Columna
cromatográfica con reservorio de
solvente
La cantidad de fase estacionaria que debe añadirse en la columna dependerá del

problema analítico a resolver. En general esto está definido en la técnica analítica
que se realiza, o de lo contrario pueden realizarse ensayos previos y
determinarse empíricamente.
El llenado de la columna es una etapa de la que depende en buena parte la
eficiencia del método. Debe garantizarse un empaquetamiento compacto de la
fase estacionaria dentro de la columna, evitando en todo momento la presencia
de burbujas de aire o de solvente volátil, así como impedir que esta se seque
después que haya sido eluida con algún solvente y no se haya terminado el
trabajo con ella. Si n se mantienen estos cuidados, se producen grietas que
constituyen viñas preferenciales para los solventes usados como fase móvil
disminuyendo la eficiencia del proceso. En general se obtienen buenos resultados
cuando la fase estacionaria se hace llegar a la columna suspendida en un
solvente, que ha de ser el de menor polaridad de todos los que se pretendan
utilizar en la separación.

9.2.2. Aplicación de la muestra.

La aplicación de la muestra en la columna cromatográfica tiene también
importancia sobre la calidad del resultado final. La muestra debe incorporarse a
la columna disuelta en una pequeña cantidad de fase móvil, cuando el solvente
con el que se cargó la columna haya penetrado totalmente en la fase
estacionaria. La aplicación se realiza con pipeta empleando volúmenes
relativamente grandes en el orden de los mililitros.
9.2.3. Corrida cromatográfica y elución de los componentes
La corrida cromatográfica consiste en hacer pasar la fase móvil a través de la
columna cromatográfica. En este momento los componentes de la muestra
aplicada comenzaran a moverse a lo largo de la fase estacionaria arrastrados por
el solvente que actúa como fase móvil. La diferencia de velocidad con la que se
mueven cada uno de ellos dependerá de sus diferencias de afinidad por la fase
estacionaria y por la fase móvil, lo que condiciona su separación y el orden con el
que saldrán por el extremo inferior de la columna cromatográfica. Este proceso
se conoce con el nombre de elución.
Existen diferentes modos de eluir los componentes de la mezcla aplicada en
función de la composición de la fase móvil empleada en la corrida
cromatográfica, ellos son: elución isocrática, elución por etapas y elución en
gradiente, los cuales se describen a continuación.
A. Elución isocrática
La elución isocrática es aquella que se realiza cuando la composición de la fase
móvil no varía durante el proceso cromatográfico. Por ejemplo si en una
separación cromatográfica se emplea como fase móvil metanol o una mezcla
metanol:agua (2:1 V-V) desde el comienzo hasta el final de la corrida
cromatográfica, estamos en presencia de un sistema isocrático de elución.
B. Elución por etapas
Ocurre con frecuencia que un solo solvente o sistema de solventes no es capaz
de lograr una adecuada separación de los componentes de una muestra, debido
a la existencia de impurezas o contaminantes que pueden interferir en las etapas
de separación. En estos casos es necesario eluir estas interferencias con una
determinada fase móvil y posteriormente utilizar otros solventes para eluir los
compuestos de interés analítico.
Un ejemplo ilustrativo es la determinación de ácido cítrico en vinos empleando
como fase estacionaria una resina de intercambio aniónico. Una vez aplicados a
la columna 10 mL de vino, la misma se lava 3 veces con 50 mL de agua destilada
para eluir las sustancias neutras y aquellas cargadas positivamente, estos
eluatos se desechan y posteriormente se hace pasa a través de la columna 200
mL de una solución de ácido acético 2.5 N para que los aniones acetatos se
intercambien con los ácidos que están interactuando con la resina; la fuerza
iónica del ácido acético es suficiente para eluir un grupo de ácidos, entre los que
40d78409-8f5a-44ad-af96-811f110af4ad
se encuentra el ácido citromálico que constituye una interferencia, pero esta fase
móvil no es capaz de desplazar los aniones del ácido cítrico, los cuales están mas
fuertemente adheridos a la resina; este segundo eluato también se desecha y
entonces se usa un tercer solvente (100 mL de hidróxido de sodio 2 N), cuya
fuerza iónica es mayor que la del ácido acético, pudiendo ahora los aniones
hidroxilos desplazar a los aniones citrato y eluir el ácido cítrico de interés en la
determinación.
C. Elución con gradiente o gradiente de elución
El gradiente de elución es una variante mucho más eficiente que la elución por
etapas para la separación de mezclas complejas pero el principio general es el
mismo, es decir el cambio de la composición de la fase móvil durante el proceso
de elución cromatográfica.
En este caso, a diferencia de la elución por etapas, la fase móvil atraviesa la
columna cromatográfica como un flujo continuo, sin interrupciones, pero su
composición (fuerza de elución) se hace variar gradualmente desde el inicio
hasta el final de la separación cromatográfica. Esto se logra mezclando
paulatinamente 2 solventes en orden creciente de fuerza de elución (polaridad o
fuerza iónica según el mecanismo de separación) fuera de la columna de manera
que el flujo que atraviesa la misma va cambiando gradualmente su composición.
Así por ejemplo un gradiente de polaridad ascendente para una columna de
reparto fase normal se muestra en la figura 9.3.
Tal gradiente se logra mezclando

metanol y agua de modo que al inicio
de la corrida la fase móvil estará
compuesta por únicamente por
metanol y gradualmente su polaridad
irá aumentando en la medida en que
se mezcle con agua. De este modo se
logra una mayor selectividad de la
fase móvil que arrastrará
selectivamente a los componentes de
la mezcla los cuales eluirán en orden
de polaridad ascendente, es decir, los
menos polares se moverán con mayor Figura 9.3.
velocidad y eluirán primero en tanto Gradiente de polaridad ascendente
los más polares serán los últimos.
Con este sencillo procedimiento se pueden lograr gradientes lineales siempre y

cuando los recipientes que contienen los solventes 1 y 2 poseen el mismo
diámetro y contengan iguales volúmenes. Usando recipientes de diferente
diámetro de obtienen mezclas con un aumento no lineal de 2 en 1.

9.2.4. Recogida de los eluatos y detección de los componentes

En la cromatografía en columna convencional más ortodoxa los componentes
separados se recogen disueltos en la fase móvil a la salida de la columna
cromatográfica. En este sentido la recogida de los eluatos puede realizarse de
dos formas diferentes en dependencia de los objetivos que se persigan con la
separación cromatográfica.
Si el objetivo del método es separar un único compuesto de resto de otros que
se comportan como sustancias interferentes, usualmente se emplea un sistema
de elución por etapas en el que en un primer momento, una vez aplicada la
muestra, las interferencias se eluyen con un solvente que no desplace al
compuesto de interés y estos eluatos se desechan. Posteriormente se hace pasar
un segundo solvente para eluir al analito, el cual puede ser recogido en un
matraz volumétrico u otro recipiente quedando listo para su cuantificación.
Puede suceder que, siguiendo este mismo objetivo, el compuesto de interés no
interaccione con la fase estacionaria y la aplicación de la muestra se realice para
que las sustancias interferentes queden adheridas a la fase estacionario mientras
el analito fluye libremente con la fase móvil y se recoge igualmente en un
recipiente adecuado.
Ahora bien, si el objetivo que se persigue es la separación de varios
componentes de una muestra e interesa obtenerlos a todos de forma individual,
entonces los eluatos se recogen con ayuda de un equipo llamado colector de
fracciones.
El colector de fracciones es un dispositivo constituido por un tambor que contiene
un gran número de viales o pequeños tubos de ensayo que recogen cierto
volumen de eluatos según sea programado por el analista (figura 9.4).
Figura 9.4. Colector de fracciones
En la medida que comienzan a eluir los componentes por el extremo de la

columna, los eluatos se recogen en el colector de fracciones. El analista establece
que volumen debe ser recogido en cada uno de los viales o tubos de ensayo y
una vez que se haya alcanzado este volumen en un tubo, automáticamente el
tambor se desplaza y coloca otro tubo vacío a la salida del flujo en la columna.
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Este proceso se repite hasta culminar la corrida cromatográfica cuya duración es

también establecida por el analista.
Al finalizar la corrida cromatográfica es necesario detectar los componentes
eluidos, es decir determinar cuántos componentes han sido separados. Para ello
se lee una señal analítica (absorbancia, fluorescencia, índice de refracción, etc.)
a cada uno de los eluatos recogidos en cada uno de los tubos de ensayo (según
el orden de elución) y se construye un cromatograma, que es un gráfico de señal
vs. volumen de elución.
Supongamos que en una separación cromatográfica se ha recogido un volumen
total de 60 mL en un colector de fracciones que ha sido regulado para recoger 1
mL en cada tubo. Al finalizar la corrida cromatográfica se tendrán entonces un
total de 60 tubos de ensayo a los que se les determina individualmente una señal
analítica (absorbancia por ejemplo, en un espectrofotómetro). Se obtendrán
entonces 60 pares de valores de absorbancia vs. volumen de elución con los
cuales se construye el cromatograma que aparece en la figura 9.5.
Figura 9.5. Cromatograma de señal vs. volumen de elución
La línea base representa los volúmenes de fase móvil que no contienen soluto
(pues la señal del detector es mínima), mientras que cada uno de los picos que
aparecen en el cromatograma (A, B y C) se corresponden con cada uno de los
componentes d separados en la columna cromatográfica. En este caso, el
componente A está contenido en los tubos del 8 al 18, el componente B en el
intervalo del 29 al 40 y el componente C en los tubos del 48 al 57. Por otra parte
los tubos 13, 35 y 52 son aquellos en que es mayor la concentración de los
componentes A, B y C, respectivamente.
Del análisis de este gráfico queda claro además que el componente A es el de
menor afinidad por la fase estacionaria y es el primero en eluir, mientras que el
C resultó el más fuertemente retenido.

La figura 9.6 muestra un esquema resumen del procedimiento de recogida de los

eluatos según los objetivos que se persigan en la separación.
Figura 9.6. Recogida de los eluatos en función de los objetivos analíticos
9.2.5. Identificación y cuantificación de los compuestos separados

En la actualidad las aplicaciones cualitativas y cuantitativas de la cromatografía
en columna clásica o convencional son muy limitadas debido al acelerado
desarrollo de los métodos automatizados de cromatografía líquida de alta
resolución (HPLC) y cromatografía de gases, los cuales constituyen poderosas
herramientas para separación, identificación y cuantificación de mezclas
complejas.
No obstante, existen algunas determinaciones cuantitativas que se realizan por
cromatografía en columna clásica. En este caso la cuantificación se realiza en los
eluatos obtenidos empleando generalmente métodos espectroscópicos con ayuda
de una curva de calibración.
Incluso existen técnicas reportadas de separaciones por cromatografía convencional en los
que el componente separado se cuantifica mediante métodos volumétricos. Tal es el caso de
la determinación de ácido cítrico en vinos, descrita en el epígrafe 9.2.3. En esta
determinación el ácido cítrico eluido y recogido en un matraz aforado es transformado por
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oxidación cuidadosa en acetona, la que se separa por destilación y el etanal

arrastrado se oxida a ácido acético y se valora sola la acetona por yodometría
empleando tiosulfato de sodio como patrón valorante.
9.3. EFICIENCIA DE UNA COLUMNA CROMATOGRÁFICA.

La eficiencia de una columna cromatográfica está dada por su capacidad para
lograr la separación de dos o más solutos en un tiempo relativamente corto, en
dependencia de la complejidad de la mezcla.
Para el estudio de la eficiencia de una columna tomaremos como punto de
partida un sistema en que los eluatos no se recogen en un colector de fracciones
como se explicó en el epígrafe 9.4.2., sino que a la salida de la columna está
colocado un detector que emite una señal analítica correspondiente a los
componentes que van eluyendo, la cual se registra automáticamente en forma
de un cromatograma, en este caso de señal vs. tiempo de retención (figura 9.7).
Figura 9.7. Detección en línea de los eluatos
La comprensión de las teorías que explican los fenómenos que afectan la

eficiencia de una columna cromatográfica requiere en primer lugar del estudio de
dos magnitudes cromatográficas de enorme importancia práctica: el tiempo de
retención (tr) y la resolución (R), las cuales serán analizadas a continuación:
a. Tiempo de retención (tr)
El tiempo de retención (tr) de un analito dado mide el lapso de tiempo que
media entre la introducción de la muestra y el instante en que la respuesta del
detector alcanza su valor máximo (figura 9.8).

Figura 9.8. Tiempos de retención y otras magnitudes cromatográficas.
Si el tiempo de retención se mide a partir de la señal producida por un analito no

retenido por la fase estacionaria, entonces este se llama tiempo de retención
reducido (t’r). A su vez se llama tiempo muerto (tm) al tiempo que demora ese
analito no retenido en recorrer la columna cromatográfica y que coincide con el
tiempo que requiere la fase móvil para recorrer la distancia desde que se
introduce la muestra hasta que esta llega al detector. En consecuencia tm es
aproximadamente igual al tiempo necesario para que una molécula de la fase
móvil pase a lo largo de la columna.
b. Resolución (R)
La resolución es la medida con que una columna es capaz de separar a dos
solutos con tiempos de retención muy semejantes.
Sean dos solutos 1 y 2 cuyos picos se presentan muy próximos (figura 9.9). La
resolución puede calcularse por la expresión:
 tr − tr1 
R12 = 2  2 
 W2 + W1 
Donde tr1 y tr2 son los tiempos de retención de ambos solutos, mientras que W1
y W2 representan la anchura en la base de los picos 1 y 2 respectivamente.
Si R calculado es mayor de 1.5, los picos están completamente separados
(99.7% de resolución), aunque para los trabajos prácticos es suficiente que R
sea igual o mayor que 1 (resolución de 98%).
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Figura 9.9. Parámetros para el cálculo de la Resolución entre dos picos cromatográficos.
9.3.1. Teorías de la elución cromatográfica

La figura 9.10 muestra las trayectorias de migración de los solutos A y B dentro
de una columna cromatográfica en tres etapas: una etapa inicial, una etapa
intermedia y una etapa cercana a la elución.
Figura 9.10. Proceso de migración de dos solutos (A y B)

dentro de una columna cromatográfica
La interacción del soluto A con la fase estacionaria es mayor que la de B, en

consecuencia A se retrasa durante el proceso de migración dentro de la columna
y sería el último en eluir. Es evidente que el movimiento hacia abajo en la
columna aumenta la distancia entre los dos picos. Al mismo tiempo sin embargo
tiene lugar un ensanchamiento de ambos picos (llamado también
ensanchamiento de banda o de zona) lo que disminuye la eficiencia de la
columna como dispositivo de separación.

El ensanchamiento de zona es inevitable; sin embargo, afortunadamente este

proceso es más lento que la separación de los picos. De esta forma, es posible
una separación neta de ambas especies siempre que la columna posea una
longitud suficiente.
Resulta evidente que las teorías que intenten sustentar el proceso de separación
cromatográfico deben ser capaz de explicar dos fenómenos: primero, la
velocidad de migración de los solutos en la columna cromatográfica y segundo, la
velocidad de ensanchamiento de los picos durante la migración. En este sentido
son válidas dos teorías que en la actualidad se complementan: la teoría de los
platos teóricos y la teoría cinética.
9.3.1.1. Teoría de los platos teóricos
La teoría de los platos teóricos es
la teoría original de la
cromatografía y fue desarrollada
por Martin y Synge en 1941. Esta
teoría considera que el empaque
de una columna cromatográfica
está compuesto por una serie de
estrechas capas horizontales
llamadas platos teóricos (que no
existen como una entidad física en
la columna). Se supone que en
cada plato tiene lugar el equilibrio
del soluto entre la fase móvil y la
Figura 9.11. Representación
fase estacionaria. El movimiento esquemática de los platos teóricos
del soluto y el disolvente se
considera entonces como una serie de transferencias sucesivas de un plato al
siguiente (figura 9.11).
La eficiencia de una columna cromatográfica será mayor en la medida que
aumenta el número de platos teóricos, pues aumentará también el número de
equilibrios. Puesto que cada soluto establecerá el equilibrio a diferente velocidad,
en función de su constante de distribución entre ambas fases ello condiciona que
a mayor número de posibles equilibrios, mejor será la separación entre los
solutos que forman la mezcla pues se moverán a diferente velocidad.
En consecuencia, el número de platos teóricos (N) se utiliza como una medida de
la eficiencia de una columna cromatográfica. Un segundo término, la altura
equivalente de un plato teórico (H) también sirve para este fin. La relación entre
ambos parámetros es la siguiente:
L
N=
H
donde L es la longitud del empaque de la columna.
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Obviamente N y H son inversamente proporcionales. Quiere esto decir que si

desea aumentar la eficiencia de una columna o sea, aumentar el número de
platos teóricos (N), esto puede lograrse o bien aumentando la longitud del
empaque, o bien disminuyendo la altura equivalente de un plato teórico.
El número de platos teóricos de una columna puede calcularse
experimentalmente con los datos de un pico cromatográfico, según:
2
 tr 
N = 16  
W 
donde tr es el tiempo de retención del soluto y W es la anchura del pico en la
base.
La teoría de los platos teóricos fue capaz de describir las velocidades de
migración de los solutos de forma cuantitativa; sin embargo, su utilidad resulta
limitada porque no logró describir los efectos de las variables responsables del
fenómeno de ensanchamiento de banda. Como consecuencia esta teoría fue
complementada y enriquecida por la teoría cinética que si pudo explicar el efecto
de estas variables.
9.3.1.2. Teoría cinética
La observación de un pico cromatográfico típico pone de manifiesto su semejanza
con las curvas gaussianas o curvas de distribución normal, que se obtienen
cuando se grafican valores repetidos de una medida en función de su frecuencia
de aparición. En consecuencia se obtiene una distribución simétrica de los datos
alrededor de un valor medio.
La teoría cinética parte del hecho de que no todas las moléculas del mismo
soluto se mueven a igual velocidad dentro del empaque de la columna
cromatográfica. Quiere esto decir que, en algunos casos, el tiempo de residencia
de las moléculas de un soluto en una fase dada puede ser muy breve pero en
otros puede ser muy prolongado. Ciertas moléculas de un soluto viajan más
rápidamente que el promedio en virtud de su inclusión accidental en la fase móvil
(lo que se traduce en que transitan al próximo plato teórico sin haber alcanzado
el equilibrio), mientras otras pueden retardarse debido a que permanecen en la
fase estacionaria un tiempo mayor que el promedio. La consecuencia de estos
procesos individuales al azar, es una distribución simétrica de las velocidades de
migración alrededor de un valor medio que representa el comportamiento
promedio de las moléculas del soluto.
Dicho de forma más simple, el fenómeno de ensanchamiento de pico se debe a
que no todas las moléculas de un mismo soluto transitan por la columna a la
misma velocidad sino que unas se adelantan y otras se atrasan.
La figura 9.12 muestra el efecto perjudicial que tiene el ensanchamiento de
banda en la resolución (separación) de los picos en un cromatograma y por ende
en la eficiencia del proceso.

Ahora bien, ¿cuáles son las causas que provocan el ensanchamiento de un pico
cromatográfico?
Los picos cromatográficos se ensanchan, por lo general, debido a tres procesos
bajo control cinético, ellos son: el efecto multipaso, la difusión longitudinal y la
transferencia de masa fuera del equilibrio. Las magnitudes de estos efectos están
determinadas por variables controlables experimentalmente, tales como la
velocidad de flujo, el tamaño de partícula del material de empaque, las
velocidades de difusión y el grosor de la fase estacionaria.
A continuación, se explicará en que consiste cada uno de estos fenómenos.
Figura 9.12. Efecto del ensanchamiento de banda sobre la

resolución
En el cromatograma A el ensanchamiento de banda produce un
solapamiento de los picos afectando la resolución, mientras que
en el cromatograma B se obtienen picos estrechos y
perfectamente separados. Nótese que los tiempos de retención
de los picos 1 y 2 en ambos cromatogramas son idénticos por lo
que afectación de la resolución es resultado del ensanchamiento
de zona.
A. Efecto multipaso
El efecto multipaso, también llamado efecto del
camino múltiple y difusión en remolino, se debe a la
gran cantidad de trayectorias que puede encontrar
una molécula en su camino a través del empaque de
la columna.
En la figura 9.12 se muestran las trayectorias de dos
moléculas de un mismo soluto, observándose que
las longitudes de estas trayectorias no son iguales.
En consecuencia, los tiempos de residencia de
ambas moléculas de la misma especie en la columna
son también diferentes lo que conduce a que unas
se adelanten y otras se atrasen.
Figura 9.12.
Efecto multipaso
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Tal y como se observa en la figura, el efecto multipaso puede relacionarse con el

tamaño y la geometría de las partículas del empaque, así como con el grado de
compactación del empaquetamiento.
Por ejemplo, parte de las moléculas de un soluto se retrasan en su avance
cuando la fase móvil (líquida o gaseosa) tiene que rodear partículas grandes de
relleno o cuando en un punto de la columna hay obstrucción debido a partículas
muy pequeñas. En ambos casos los movimientos axiales de la fase móvil
conducen a un ensanchamiento de la banda del soluto.
Así, el ensanchamiento de bandas debido al efecto multipaso puede disminuirse
al mínimo si se empaqueta cuidadosamente la columna conpequeñas partículas
esféricas cuyo tamaño varíe dentro de un intervalo limitado, poniendo especial
cuidado en evitar la formación de canales abiertos
Una columna empacada de esta forma obligaría a las moléculas de un mismo
soluto a moverse por trayectorias similares a similar velocidad, lo que minimiza
significativamente el ensanchamiento del pico cromatográfico.
Llama la atención el hecho de que el efecto multipaso es independiente de la
velocidad de flujo de la fase móvil.
B. Difusión longitudinal.
La difusión longitudinal se debe a la tendencia de las moléculas de migrar desde
la porción central concentrada de una banda hacia regiones más diluidas de
arriba y debajo de la zona. Dicho de otro modo, es la tendencia de las moléculas
difundir desde zonas de mayor concentración a zonas de menor concentración.
Este tipo de difusión puede ocurrir tanto en la fase móvil como en la fase
estacionaria y produce un ensanchamiento adicional del pico cromatográfico
(figura 9.13).
Figura 9.13. Difusión longitudinal

La difusión longitudinal es más importante cuando la fase móvil es un gas debido

a que la velocidad de difusión en la fase gaseosa es varios órdenes mayor que en
los líquidos. El grado de la magnitud de la difusión aumenta con el tiempo, en
consecuencia, el grado de ensanchamiento será mayor mientras menor sea la
velocidad de flujo.
En virtud de este comportamiento, el ensanchamiento de banda debido a la
difusión longitudinal puede disminuirse aumentando la velocidad de flujo de la
fase móvil.
C. Transferencia de masa fuera del equilibrio
La transferencia de masa fuera del equilibrio, también conocido como resistencia
a la transferencia de masa, es un fenómeno en virtud del cual las bandas
cromatográficas se ensanchan debido a que el flujo de la fase móvil es por lo
general tan rápido que los solutos no pueden alcanzar un verdadero equilibrio
entre la fase móvil y la fase estacionaria.
Dicho de otro modo, puesto que el establecimiento del equilibrio del soluto entre
las fases transcurre con una velocidad finita, se alcanzará completamente solo a
velocidades muy bajas de flujo de la fase móvil. La transferencia incompleta de
masa contribuye al ensanchamiento de la banda.
Por ejemplo, al frente de la zona en la cual se encuentran el soluto, la fase móvil
encuentra fase estacionaria nueva lo que conduce a que ciertas moléculas del
soluto se transporten un poco más abajo de la columna sin haber alcanzado el
verdadero equilibrio (transitan al siguiente plato teórico sin haber alcanzado el
equilibrio en el plato precedente). De la misma forma, detrás de esa zona los
solutos de la fase estacionaria encuentran fase móvil nueva y nuevamente la
velocidad de transferencia de las moléculas del soluto no es instantánea;
entonces la cola de la zona se estira más de lo que ocurriría si el tiempo fuese
suficiente para lograr el equilibrio. El efecto neto es el ensanchamiento de la
banda del soluto en ambos extremos.
Los efectos de transferencia de masa fuera del equilibrio pueden hacerse
menores si se disminuye la velocidad de flujo de la fase móvil debido a que hay
más tiempo disponible para que se alcance el equilibrio. Además, es de esperar
una aproximación más estrecha al equilibrio si los canales a través de los cuales
fluye la fase móvil son estrechos, de modo que las moléculas del soluto no
tengan que difundir a lo largo de una distancia grande para alcanzar la fase
estacionaria.
Por la misma razón, las capas de líquido inmovilizado en la fase estacionaria (en
la cromatografía líquido-líquido y gas-líquido), deben ser lo más delgadas
posible. Teóricamente la eficiencia sería máxima con un recubrimiento en forma
de capa monomolecular, pero en la práctica esto trae consecuencias adversas ya
que por debajo de un cierto espesor de fase líquida se ponen de manifiesto
efectos de adsorción del soporte, lo que dificulta y/o hace imposible el análisis.
40d78409-8f5a-44ad-af96-811f110af4ad
Cuando la fase estacionaria es sólida (cromatografía líquido-sólido y gas-sólido),

la transferencia de masa fuera del equilibrio puede hacerse pequeña usando
partículas pequeñas de mucha superficie especifica pero sin grandes poros y
grietas.
Finalmente, la aproximación al equilibrio es también mucho mejor a
temperaturas elevadas (para el caso de la cromatografía de gases) y utilizando
disolventes de baja viscosidad.
Se han obtenido varias ecuaciones que relacionan la eficiencia de una columna
cromatográfica con la magnitud de estos tres fenómenos. La primera y más
simple de estas ecuaciones se conoce como ecuación de Van Deemter y
proporciona una relación aproximada entre la velocidad de flujo ( u) y la altura
equivalente de un plato teórico (H). Esta ecuación es aplicable tanto en
cromatografía líquida como en cromatografía de gases.
B
H =A+ + Cu
u
En este caso la magnitud A se relaciona con el efecto multipaso, B es la difusión
longitudinal y C es la transferencia de masa fuera del equilibrio.
En forma más desarrollada, esta ecuación puede plantearse como:
2  Dg 8 K d
2
H = 2  dp + +   f u
u  (1 + K ) DL
2
en donde:
 es el llamado coeficiente de tortuosidad y depende de la uniformidad del relleno y de la

forma en que se llenó la columna.
dp es el diámetro promedio de las partículas de relleno.

Dg es el coeficiente de difusión del soluto en la fase líquida.
u es la velocidad lineal media de la fase móvil.
 es el factor de laberinto de los canales o factor de obstrucción.
K es el factor de retención.
df es el espesor promedio de la película de fase líquida que recubre el soporte.
Con la excepción de u, los demás factores quedan fijados cuando se selecciona:
el tipo de soporte y fase líquida, el porcentaje de ésta última, la forma en que se
llenó la columna y el tipo de fase móvil. De cualquier modo, de las expresiones
analizadas se desprende que la eficiencia de la columna cromatográfica aumenta
a medida que se hace mínimo A, B y C, por cuanto también se minimiza la altura
equivalente de un plato teórico lo que conduce al incremento del número de
platos teóricos y con ello al establecimiento de un mayor número de equilibrios
del soluto entre ambas fases.

En la figura 9.14 se muestra la contribución de cada término de la ecuación

simplificada de Van Deemter en función de la velocidad de la fase móvil, así
como su efecto neto.
Del análisis de este gráfico resulta claro que es preciso llegar a un compromiso
entre los factores que afectan la eficiencia cromatográfica, expresada por la
ecuación de Van Deemter. Así hemos visto que la altura del plato teórico H crece
a bajas velocidades de la fase móvil debido a difusión, mientras que ocurre lo
mismo a elevadas velocidades por falta del establecimiento del equilibrio. Entre
estos dos extremos hay un punto que corresponde al flujo óptimo. En la práctica
se trabaja dentro de una zona bastante amplia, por cierto, aunque es siempre
recomendable conocer cuáles son los límites dentro de los que es factible situar
la velocidad de la fase móvil en el trabajo diario.
Figura 9.14. Solución gráfica de la ecuación de Van Deemter.
9.3.2. Otros parámetros cromatográficos de interés

a. Factor de capacidad (k’).
El factor de capacidad describe las velocidades de migración de los analitos en la
columna y está relacionado con la constante de distribución (Kc) de un soluto
entre 2 fases, es decir la relación de la concentración de un analito A en la fase
estacionaria, respecto al valor correspondiente en la fase móvil.
A 
K C =  FE 
 AFM 
donde FE es la fase estacionaria y FM es la fase móvil
Esta expresión se puede transformar como se indica:
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wE
V w V
KC = E = E  M
w M w M VS
VM
donde:
w E = masa del analito en la fase estacionaria

VE = volumen de la fase estacionaria
w M = masa del analito en la fase móvil
VM = volumen de la fase móvil

Se llama entonces factor de capacidad (k’) a la relación de las masas del analito
en la fase estacionaria y la fase móvil.
wE
k' =
wM
El factor de capacidad puede expresarse también en función de la relación del
tiempo de permanencia del analito en la fase estacionaria (t’r) respecto al valor
correspondiente en la fase móvil (tm), es decir:
tiempo que permaneceel analito en la fase estacionaria
k' =
tiempo que permaneceel analito en la fase móvil
o lo que es l mismo:
t' r
k' =
tm
y se sabe que t’r= tr – tm, entonces k’ puede expresarse:
tr − tm
k' =
tm
En resumen el factor de capacidad (k’) expresa la interacción del soluto con la
fase estacionaria. Obviamente a mayor k’, mayor será el tiempo de retención (tr)
del soluto.
En la cromatografía de partición, la cantidad de fase estacionaria es directamente
proporcional a k’. En la cromatografía de adsorción la proporcionalidad va ligada
a la superficie del adsorbente, mientras que en intercambio iónico, la
correspondencia es con el número especies ionizadas.
b. Selectividad ()
La selectividad expresa la retención relativa entre los máximos de dos picos
adyacentes y puede calcularse mediante la expresión:

t' r2
=
t' r1
La determinación de los tiempos que permanecen dos componentes en la fase

estacionaria, evalúa las magnitudes de sus interacciones y se establece la
relación de separación. La selectividad es conocida como eficiencia de la fase
estacionaria y en la medida que se aleje más del valor 1 mejor será la separación
entre los picos, es decir la fase estacionaria es más selectiva mientras mayor es
el valor de .
Una vez conocidas estas dos nuevas magnitudes se puede plantear la ecuación
maestra de la resolución como:
N  k'    − 1
R=    
  
'
4 1 + k
y de la cual pueden extraerse las siguientes conclusiones:
N
• El término se relaciona directamente con la eficiencia, mientras que
4
 k'    − 1
  y   están ligados a la retención y la selectividad,
  
'
1+ k 
respectivamente.
• Para tener buenas separaciones, se necesita que k’ sea mayor de 2. Sin
embargo, un valor mayor de 6, sólo aumenta el tiempo del análisis sin
mejorar la resolución.
• Al graficar R vs. , se obtiene una gráfica asintótica por arriba de 6. Debido a
que lo más usual es trabajar en la zona cercana a = 1, la resolución mejora
notablemente cuando se incrementa de 1 a 6 el valor de .
• Es necesario cambiar en varios órdenes de magnitud el valor de N para tener
una buena resolución. Sólo se debe mejorar N con sistemas que posean
valores pequeños de H. Únicamente en casos especiales, se debe trabajar con
columnas muy largas, que producen análisis lentos.
En resumen, puede plantearse que la eficiencia de una columna cromatográfica
está condicionada por los siguientes factores:
1. Longitud del empaque: A mayor longitud, mayor número de platos teóricos y
mayor eficiencia, pero los análisis consumen mayor tiempo
2. Tamaño y geometría de las partículas del empaque: A menor tamaño de
partícula y mayor homogeneidad y grado de compactación, menor efecto
multipaso, y mayor eficiencia.
3. Diámetro interno del empaque: A menor diámetro, menor espesor de la capa
líquida que rodea a fase estacionaria, menor resistencia a la transferencia de
masa y mayor eficiencia.
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4. Velocidad de flujo: Existe una velocidad de flujo óptima, aunque no siempre

es necesario trabajar a este valor óptimo. En la práctica la velocidad de flujo
se determina empíricamente.
5. Naturaleza de la fase móvil y la fase estacionaria: Ambas influyen en el factor
de capacidad y en la selectividad, de ahí la importancia de su adecuada
selección según los objetivos analíticos que se persigan y las características
de los solutos que se desean separar así como de la matriz en que se
encuentren.
6. Régimen de elución: Se emplean regímenes isocráticos o de gradiente en
función de la complejidad de la mezcla expresada tanto el número de
componentes como en sus coeficientes de distribución.
La cromatografía líquida en columna convencional no pudo en su momento
satisfacer todas estas exigencias. El tamaño grande e irregular de las partículas
de la fase estacionaria, el gran consumo de solventes y matrices, los largos
tiempos de análisis así como la pobre eficiencia en la separación de mezclas
complejos, impusieron a la cromatografía convencional un reto que solo pudo
vencerse con el desarrollo de la electrónica y de nuevos materiales. Así, la
cromatografía líquida en columna convencional evolucionó al potente sistema
automatizado que hoy constituye la cromatografía líquida de alta resolución, a la
cual dedicaremos el siguiente capítulo.
1. Consulte el apéndice C-3, en el que aparece un resumen de los
aspectos relacionados con la eficiencia de una columna
cromatográfica, tratados en el presente capítulo.
2. Resuelva los ejercicios 10, 11 y 12 que aparecen en el Capítulo
14 / epígrafe 14.1. Ejercicios propuestos.
BIBLIOGRAFÍA.
1. Dierksmeier, G. (2005). Métodos cromatográficos. Editorial Científico Técnica.
Impreso por Impresol Ediciones Ltda. Bogotá, Colombia.
2. Martin, A. y Synge, R. (1941). Biochem. J., 35, 1358.
Dykinson. Madrid
5. Stock, R. y Rice, C. (1966). Chromatographic Methods. Ed. Chapman and
Hall. LTD and Sciense Paperbacks Second Edition Liverpool.

10 Cromatografía líquida de alta resolución
10.1. GENERALIDADES
El éxito alcanzado por la cromatografía gaseosa y el desarrollo logrado en la
construcción de equipos, condujo necesariamente a la cromatografía líquida
instrumental moderno, cuya primera versión se remonta a comienzos de la
década de 1960.
La cromatografía líquida de alta resolución, tal como la conocemos hoy y que
universalmente se abrevia con las siglas HPLC (del inglés High Performance
Liquid Chromatography), vino a llenar el vacío, no abarcado por la cromatografía
gaseosa.
En efecto, esta nueva rama analítica se ocupa con preferencia, aunque no
exclusivamente, de aquellos compuestos con presión de vapor baja o
termolábiles que, o no se pueden cromatografiar directamente mediante la
cromatografía gaseosa o requieren de un tratamiento químico previo
(derivatización), en ocasiones engorroso, consumidor de tiempo o caro.
El éxito y la popularidad alcanzada por la cromatografía líquida desde su
utilización comercial a partir de la década de 1970 no tienen precedentes. En
parte esto se debió a que la cromatografía gaseosa ya había abierto el camino,
se había alcanzado un nivel considerable en la teoría cromatográfica y además,
la construcción de equipos sofisticados era cosa rutinaria en muchos países.
En menos de una década, la HPLC abarcó campos como el de los medicamentos,
los polímeros sintéticos y biológicos, los aminoácidos, azúcares y compuestos
inorgánicos, por solo mencionar aquellos de acceso difícil a la cromatografía
gaseosa.
En la actualidad la cromatografía gaseosa y la HPLC abarcan una gran parte de la
actividad analítica que se realiza a nivel mundial. La primera, apoyada en el
desarrollo de fases estacionarias nuevas, puede contar en el presente con una
fase estacionaria adecuada a cada problema analítico particular. Además, el
desarrollo de las columnas capilares y la introducción de la sílice fundida en la
construcción de éstas le han abierto un campo extraordinario a la cromatografía
gaseosa.
La HPLC, especialmente en su modalidad de fase reversa (RP del inglés Reverse
Phase) que es la que más se utiliza y se apoya en un reducido número de
rellenos cromatográficos. La gran aplicabilidad del método se basa en que la fase
móvil interviene de forma decisiva en el proceso de separación cromatográfica.
Prácticamente se puede obtener una fase móvil para cada problema analítico,
206
40d78409-8f5a-44ad-af96-811f110af4ad
10. Cromatografía líquida de alta resolución
variando cualitativamente (la composición) o cuantitativamente (la proporción de

los componentes) de ella.
10.2. Descripción del proceso cromatográfico
De forma muy simplificada puede decirse que el proceso consiste en bombear a
presión elevada un solvente o sistema de solventes a través de una tubería
capilar, por lo general de acero inoxidable. Este líquido llega a una válvula que
permite la introducción de la muestra que se desea analizar.
La muestra, casi siempre una solución, se introduce mediante una jeringuilla en
un segmento de tubo capilar de volumen exacto y conocido. Accionando una
válvula se logra que la solución de la muestra se incorpore rápidamente al
torrente de fase móvil. Entre la válvula de introducción de muestras y la columna
cromatográfica, se sitúa generalmente una precolumna. En los primeros
cromatógrafos líquidos, esta precolumna tenía como función garantizar que la
fase móvil que salía de ella, se encontrara completamente saturada
precisamente con la fase estacionaria usada en la columna cromatográfica. De
este modo se evitaba que la fase móvil, a su paso a través de la columna,
arrastrara consigo la fase cromatográficamente importante en el proceso.
Con la introducción de rellenos de fase enlazada y la reducción drástica en el
tamaño de partículas de estos, cambió la función de la precolumna, pero no su
importancia. En efecto, en la actualidad, al usarse rellenos de fase enlazada, no
se requiere la precolumna saturadora, pero la reducción del tamaño de partículas
hace que las columnas estén más expuestas al deterioro, a la obstrucción por la
materia en suspensión que puede acompañar a la muestra, a las moléculas de
peso molecular elevado que como impurezas pueden introducirse con la muestra
e incluso a los solventes usados como fase móvil. La precolumna es pues una
barrera, un filtro protector adicional que alarga la vida útil de la columna.
A continuación de la precolumna se sitúa la columna cromatográfica, conectada a
la primera mediante una tubería capilar. En su modalidad clásica la columna
cromatográfica es un tubo de acero inoxidable (relleno con la fase estacionaria)
de 1 mm a 4 mm de diámetro interno y longitud variable, según la necesidad
analítica, pero por lo general inferior a 50 cm.
En la columna ocurre la separación cromatográfica de los componentes de la
muestra. El mecanismo de separación depende de la naturaleza de la fase móvil
y de la fase estacionaria y en esencia, la separación está determinada por las
diferencias en afinidad de los analitos por ambas fases.
A la salida de la columna se encuentra conectado el detector. En la actualidad se
usa un número reducido de detectores entre ellos: el refractométrico, el detector
espectrofotométrico, el detector electroquímico, el de fluorescencia y el de
conductividad. Se han desarrollado otros detectores, pero no han sido tan
utilizados comercialmente como los mencionados.
Análisis Instrumental de los Alimentos. 207

La señal producida por el detector, previamente amplificada, se recibe en un

registrador potenciométrico donde se origina el cromatograma correspondiente.
En la actualidad, la señal puede procesarse mediante un software especializado
con las ventajas inherentes que brindan las Tecnologías de la Información y las
Comunicaciones (TICs). Aunque no es una parte esencial del sistema de
cromatografía líquida, es posible también acoplar a la salida del detector, un
colector de fracciones, con el que se puede obtener separadamente las eluciones
correspondientes a un pico o un conjunto de picos según se requiera para un uso
posterior.
En la figura 10.1 se presenta un esquema correspondiente a un sistema
cromatográfico simple como el que se ha descrito en los párrafos precedentes.
Figura 10.1. Esquema de un sistema cromatográfico HPLC
10.3. Los componentes del sistema cromatográfico

En los párrafos siguientes se describe las partes constitutivas de un sistema de
cromatografía líquida de alta eficiencia. Siempre que sea posible se dará los
parámetros característicos o usados comercialmente.
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10.3.1. La fase móvil

La fase móvil está constituida por un solvente, una solución o un sistema de
solventes, acorde al tipo de cromatografía y a la muestra que se pretenda
analizar.
La fase móvil ha de ser compatible con el detector que se requiera para llevar a
cabo la determinación.
Por lo general, la fase móvil se encuentra en recipientes de un 1 litro de
capacidad, situados por encima de los demás constituyentes del sistema
cromatográfico. Mediante tubería plástica resistente a solventes de 1 mm a 2
mm de diámetro interno, la fase móvil llega a la bomba.
Por lo general en el extremo del tubo de toma de solventes se sitúa un filtro
tubular que impide la entrada de partículas a la bomba que sean superiores a 0,2
micrómetros.
Hay algunos requisitos que deben satisfacer los solventes usables en
cromatografía líquida de alta eficiencia, tanto en sus propiedades físicas como
químicas.
Propiedades físicas
Las propiedades físicas más importantes de los solventes son: índice de
refracción; absorción en el ultravioleta; viscosidad y polaridad. (5)
• Índice de refracción. Solo es necesario tenerlo en cuenta cuando se trabaja
con un detector refractométrico. Es requisito en este caso que el solvente
seleccionado tenga un índice de refracción lo más diferente posible al de los
solutos constitutivos de la muestra, de lo contrario, la sensibilidad de la
determinación será baja.
• Absorción en el ultravioleta. Cuando se trabaja con un detector
espectrofotométrico en el rango UV, es imprescindible conocer la longitud de
onda límite de uso de cada solvente.
• Viscosidad. Esta propiedad es importantísima puesto que ella se opone al
flujo del solvente a través de la columna. Como se sabe, en HPLC la fase
móvil se hace pasar a presión elevada a través de una columna rellena con
partículas muy pequeñas. Mientras menor sea la viscosidad de un solvente a
la temperatura de la columna, menor será la presión necesaria para lograr la
velocidad lineal (o el flujo) requerido para el análisis de una muestra.
• Polaridad. Esta propiedad siempre es necesario conocerla tanto cuando se
trabaja en cromatografía de absorción como cuando se utiliza otros tipos de
cromatografía.
En la tabla 10.1 se resume las propiedades físicas de interés de algunos
solventes de uso común en HPLC.

Tabla 10.1.
Propiedades físicas de interés de algunos solventes de gran uso en HPLC
Viscosidad  límite Índice de Refracción

Solvente
cp (20ºC) nm 20ºC 20ºC
N - pentano 0,23 200 1,358
N - hexano 0,42 200 1,388
Ciclohexano 0,98 210 1,426
Éter etílico 0,23 220 1,353
Diclorometano 0,44 250 1,424
Acetato de etilo 0,45 260 1,37
Acetonitrilo 0,37 210 1,344
Isopropanol 2,39 205 1,375
Etanol 1,2 200 1,361
Metanol 0,6 200 1,329
Tetrahidrofurano 0,51 210 1,404
Agua 1,00 180 1,333
Es preciso señalar que las propiedades físicas de un sistema de solventes

dependen de la magnitud correspondiente de cada constituyente y de la
proporción de estos en el sistema.
Por ejemplo, la viscosidad del sistema agua: metanol 1:1 es aproximadamente:
1,0 cp + 0,6 cp
= 0,8 cp
2
En donde 1,0 cp y 0,6cp son las viscosidades respectivas del agua y el metanol.
Pureza de los solventes
La pureza de los solventes es un requisito elemental si se tiene en cuenta que la
HPLC alcanza límites de detección y de determinación en el rango de los
nanogramos a los picogramos. Desde el punto de vista químico, un solvente puro
para análisis, destilado en equipo de vidrio, está apto para usarlo en HPLC
siempre que durante esta etapa purificadora se excluya la incorporación de
polvo. Sin embargo, a pesar de las medidas que se tomen en este sentido, se
recomienda siempre, antes de usar un solvente, pasarlo a través de un filtro que
retenga partículas en suspensión superiores a 0,2 micrómetros – 0,4
micrómetros. De esta forma se obtiene un solvente adecuado para la mayoría de
los trabajos en HPLC.
Una impureza sutil que acompaña a todos los solventes es la presencia en ellos
de gases disueltos, fundamentalmente oxígeno y nitrógeno. Esto origina burbujas
gaseosas en la bomba, en el dispositivo de mezclado y en el detector. Además,
con el transcurso del tiempo, el oxígeno afecta algunos constituyentes del
sistema cromatográfico.
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La formación de burbujas en la bomba puede producir cambios en el flujo de

trabajo. Si las burbujas se localizan en el dispositivo de mezclado, originan
cambios notables en la composición del sistema de solventes, tanto si se está
trabajando con composición constante (isocráticamente) o si se opera con un
gradiente de concentración.
Pero donde más frecuentemente se forman las burbujas es en el detector, puesto
que en él la presión es baja (a la salida del detector la fase móvil está a presión
atmosférica). El aire que se mantiene disuelto en el solvente cuando este último
está a presión, se libera entonces al llegar al detector, originando las burbujas.
Estas burbujas producen ruido y deriva considerable y una inestabilidad tal que
impiden trabajar cuando ellas se forman.
También se produce burbujas cuando se opera en el modo de operación llamado
gradiente de concentración con solventes en los cuales la solubilidad del aire en
ellos es diferente.
Estas razones son suficientes para comprender la necesidad de desgasificar los
solventes que se usan en HPLC.
Hay diversos métodos para desgasificar solventes, algunos ya usados desde los
comienzos de la técnica de la cromatografía líquida moderna. Entre ellos se
encuentran la desgasificación por burbujeo de Helio; mediante aplicación de
vacío; por reflujo o con la utilización de un baño ultrasónico.
• Desgasificación mediante corriente de Helio
Debido a que el He es mucho menos soluble en los solventes que el Nitrógeno
y el Oxígeno, se utiliza para desplazar a éstos. Para ellos se introduce una
corriente de Helio en la masa del solvente mediante un tubo provisto en su
extremo de una placa de vidrio aglomerado. De esta forma, la salida está
constituida por burbujas pequeñas distribuidas en el solvente. En la práctica
es suficiente un flujo de 60 ml - 80 ml de He/min durante 10 minutos.
Después el flujo de este gas se puede reducir a unos 20 ml/min para
mantener desgasificado el solvente mientras dura el trabajo. Esto es
importante, pues la redisolución del aire hasta alcanzar el nivel previo a la
desgasificación se produce entre 30 minutos y 60 minutos, en dependencia
del solvente y la temperatura de éste.
Para la mayoría de los solventes la eficiencia de la desgasificación con He es
superior a 80 %. El agua es más difícil de desgasificar y nunca se alcanza la
eficiencia señalada. Aunque el método es satisfactorio, su costo elevado limita
su uso.
• La utilización del vacío
La desgasificación mediante vacío se utiliza cuando no se dispone de otros
recursos. Consiste simplemente en mantener a presión reducida al solvente
durante unos 15 minutos. La eficiencia de la desgasificación es comparable a

la del He. El agua es una excepción, pues con el vacío apenas se alcanza una
eficiencia de 30 % en el tiempo señalado.
• El reflujo
Este es el método más efectivo en lo que respecta a rapidez y eficiencia.
Entre 10 minutos y 15 minutos son necesarios para expulsar completamente
todo el gas disuelto en el solvente cuando este se refluja en un balón provisto
de un condensador convencional. Si se mantiene después el solvente a una
temperatura cercana a su punto de ebullición, la reincorporación del aire es
despreciable. Sin embargo, esto ocasiona una atmósfera nociva y peligrosa en
el área de trabajo. En nuestro Laboratorio se ha utilizado con éxito por más
de 15 años una combinación de vacío y temperatura que mantiene
desgasificada la fase móvil mientras se usa el cromatógrafo, sin los
inconvenientes mencionados.
• El baño ultrasónico
La introducción del frasco del solvente en un baño ultrasónico produce una
desgasificación moderada, con una eficiencia por lo general inferior a la de los
demás métodos descritos. El procedimiento es sin embargo cómodo, barato y
no peligroso.
• Desgasificadores comerciales
Actualmente se oferta en el mercado equipos desgasificadores que funcionan
de forma segura, eficiente y sin contaminar el área de trabajo. Esos equipos
permiten la desgasificación simultánea de varias fases móviles. La eficiencia
de la desgasificación es independiente del flujo de la fase móvil que se
requiera y tampoco depende de la composición de esta.
Finalmente es preciso señalar que la desgasificación es más difícil y menos
eficiente en aquellos solventes con polaridad grande (por ejemplo, el agua).
10.3.2. La bomba
La bomba es una parte fundamental del sistema cromatográfico. Su función es la
de extraer el solvente o sistema de solventes (fase móvil) de su reservorio e
impulsarlo a altas presiones a través del sistema cromatográfico, garantizando la
velocidad de flujo.
Puede decirse que el desarrollo alcanzado en la construcción de esta parte del
cromatógrafo líquido, ha sido decisiva en el avance de la HPLC. Esto resulta
evidente si se analiza los requisitos de una bomba usable en esta técnica.
Cuando se trata de columnas analíticas convencionales (diámetros internos entre
2 mm y 4 mm) la bomba debe entregar un flujo de solvente constante y exacto,
en el rango de 0,5 ml/min a 10 ml/min. La presión de entrega de la bomba ha de
ser regulable entre 10 bar y 500 bar (146 psi y 7300 psi).
La bomba ha de trabajar de forma continua, sin interrupciones, por periodos
prolongados de tiempo. El material constitutivo de la bomba, especialmente las
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partes en contacto con el solvente, deben ser capaces de resistir el ataque de las
fases móviles agresivas (como las usadas en separaciones iónicas).
En la actualidad, la mayoría de los fabricantes oferta bombas reciprocantes de
dos pistones, que entregan un flujo de fase móvil, prácticamente sin pulsaciones.
Las bombas utilizadas con columnas rellenas de diámetros internos menores o
iguales a 1 mm deben entregar entre 5 microlitros/min y 500 microlitros/min en
el mismo rango de presiones señalado anteriormente.
Cuando se trabaja con columnas vacías, por ejemplo, de sílice fundida, el rango
de trabajo es aún menor, del orden de 0,1 microlitros/min – 10 microlitros/min.
Las bombas usadas en este rango son por lo general del tipo de jeringuilla (un
émbolo que desplaza el volumen requerido a la presión que garantice el flujo
necesario.
En HPLC puede trabajarse con un sistema de elución isocrático (la composición
de la fase móvil no varía durante el proceso cromatográfico) o con un sistema de
gradiente de elución (la composición de la fase móvil varía paulatinamente
durante el proceso cromatográfico).
Cuando se aplica un sistema de gradiente, se utilizan como mínimo dos
solventes. El solvente A es débil mientras que el solvente B es fuerte. El
porcentaje de este segundo solvente se hace variar en función del tiempo, de
modo de lograr la separación requerida.
En sus orígenes, para trabajar con gradiente de elución se requería dos bombas,
una para el solvente A y otra para el B.
La salida de ambas bombas se hacía llegar a un dispositivo mezclador desde
donde se conducía hacia la columna. La fase móvil iba cambiando en fortaleza
acorde a lo requerido para el análisis.
En la actualidad el principio es el mismo, aunque se ha ampliado las posibilidades
de formación de gradiente a más de dos componentes, utilizando bombas muy
complejas, capaces de asumir por sí solas la formación de la fase móvil
requerida. Así, existen hoy en el mercado bombas binarias, terciarias y
cuaternarias, capaces de mezclar y controlar la proporción de dos, tres y cuatro
solventes, respectivamente.
El funcionamiento de las bombas usadas en HPLC está controlado por un
microprocesador, lo cual facilita el trabajo y amplía las posibilidades de uso de
esta parte del sistema cromatográfico. El microprocesador es especialmente útil
cuando se trabaja con gradientes de concentración o con programación de
caudal.
En el epígrafe 10.4 se abordará con más detalle los aspectos relacionados con la
utilización de sistemas de elución isocrática y de gradiente, así como otros
modos de operación con HPLC.

10.3.3. Sistema de inyección o válvula de introducción de muestras.

La válvula de introducción de muestras es un dispositivo que permite la
dosificación exacta de volúmenes conocidos de solución o muestra líquida, según
el caso, de forma rápida, en el torrente de fase móvil que se encuentra a presión
elevada.
La válvula está situada entre la bomba y la precolumna, por lo general próxima a
esta última. En posición normal o de carga, la válvula permite el flujo de fase
móvil, a la vez que se puede introducir en un tubo calibrado, mediante una
jeringuilla, un volumen de muestra exacto y conocido. Estos tubos calibrados o
“loops” tienen volúmenes de 1 microlitro a 100 microlitros para la determinación
con columnas clásicas, y por debajo de un microlitro cuando se trabaja con
columnas de diámetros pequeños o capilares. Con un ligero movimiento de la
manecilla de la válvula hacia la posición de introducción, la fase móvil se desvía y
circula entonces a través del tubo calibrado, hasta desplazar totalmente el
volumen de muestra contenido en este. Después de algunos segundos se retorna
la válvula hacia la posición normal o de carga. (figura 10.2)
1. Conexión del lazo / 2. Bomba / 3. Columna /

4. Punto de inyección / 5 y 6. Salida al exterior
Figura 10.2. Válvula de inyección: A) posición de carga, B) introducción a la columna
Por lo general para columnas cromatográficas de diámetros internos entre 4 mm

y 5 mm, el volumen de inyección no debe exceder de 25 microlitros. Así se evita
la disminución en los tiempos de retención y en el número de platos teóricos, así
como la perdida de resolución.
Un tópico de importancia en HPLC es el relacionado con la naturaleza del
solvente que se utiliza para disolver la muestra que se va a inyectar. Es una
práctica generalizada disolver la muestra en la fase móvil. Esto en cromatografía
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de fase normal no tiene inconvenientes, pues casi todas las muestras son
solubles en los solventes orgánicos que se utilizan como fase móvil.
No es así en HPLC – fase reversa por la naturaleza acuosa en muchos casos de la
fase móvil. Pero técnicamente es admisible si se tiene en cuenta que en HPLC
analítica las concentraciones de trabajo son muy pequeñas por lo que, por muy
baja que sea la solubilidad de la muestra en la fase móvil, siempre se logra
obtener una solución en ella. Pero si fuera necesario disolver la muestra en otro
solvente incluso muy poco soluble en la fase móvil, los resultados de la inyección
serían buenos.
Pero la inyección en las columnas capilares, y en las micro, rellenas o no, tiene
sus características por lo que es preciso resaltarlas.
Los flujos en las columnas capilares son muy pequeños y los volúmenes de
muestras que se inyectan están en el orden de los nanolitros.
Puesto que, en estos casos, aunque se inyecte un volumen tan pequeño, este
tiene una proporción grande relativa al flujo de fase móvil típico de estas
columnas, la naturaleza del solvente en que se disuelve la muestra influye
considerablemente en la calidad del cromatograma.
Así, si el solvente en que se disuelve la muestra es soluble en la fase móvil (o es
la propia fase móvil) se reducen los tiempos de retención y en ocasiones se
ensanchan algo los picos.
Si por el contrario, este solvente no es soluble en la fase móvil, los picos serán
más estrechos que lo esperado, mientras que los tiempos de retención no se
alterarán. Hay lo que se llama un efecto de “enfoque” de los componentes de la
muestra. Y lo más importante, es posible inyectar volúmenes grandes sin que se
altere las características del cromatograma (los tr y la resolución serán los
mismos).
Para inyectar volúmenes tan pequeños de muestra se requiere válvulas de
inyección especiales, que tienen “loops” internos. En este caso el loop clásico se
sustituye por una hendidura practicada directamente en el rotor de la válvula de
inyección, que tiene el volumen requerido.
Este tipo de dispositivo de inyección se tupe con mucha facilidad aun con
muestras limpias, por lo que hay que prestar especial atención a su limpieza
sistemática.

En la actualidad existen también los

llamados automuestreadores automáticos
que son equipos que pueden realizar el
proceso de inyección automáticamente sin
apenas atención del analista. Estos
dispositivos son programables en cuanto al
número de muestras a inyectar y los
volúmenes que se desean introducir. Así
mismo puede programarse el número de
inyecciones por vial y el intervalo de tiempo
en que se debe realizar la operación. Estos
equipos son muy útiles cuando es necesario Figura 10.3.
procesar un gran número de muestras. Automuestreador automático para HPLC
En la figura 10.3 se presenta la fotografía de

un modelo de automuestrador para HPLC.
10.3.4. La precolumna
La precolumna va conectada entre la válvula de introducción de muestras y la
columna analítica, en ocasiones unida directamente a ésta. En todos los casos,
las precolumnas, además de servir de filtro para evitar la introducción de
partículas a la columna, retienen los componentes de la muestra que se
adsorberían irreversiblemente en ella, contribuyendo así a prolongar su vida útil.
Por lo general el relleno de las precolumnas es el mismo que el de la columna
analítica, en algunos casos con un tamaño de partícula superior. El diámetro de
las precolumnas es de unos 4 mm y su longitud varia de 5 mm hasta 30 mm o
más. El relleno de las precolumnas puede sustituirse tan pronto se observe
saturación (perdida de eficiencia).
10.3.5. La columna cromatográfica
Es la parte del sistema donde se origina la separación de los componentes de la
muestra y de la que depende en gran medida la eficiencia del proceso
cromatográfico. A continuación, se describe los aspectos fundamentales de las
columnas cromatográficas.
10.3.5.1. Características generales
El material más empleado para la fabricación de las columnas de la HPLC, tanto
analíticas como preparativas, están constituidas de acero inoxidable por razones
de seguridad.
El acero sin embargo tiene limitaciones. En primer lugar, es preciso pulir la pared
interna de la columna, pues con paredes rugosas, el empaquetamiento del
relleno es deficiente (9). Este tratamiento solo es posible para columnas con 2
mm o más de diámetro interno. En las columnas de acero de diámetros menores
40d78409-8f5a-44ad-af96-811f110af4ad
o iguales a 2 mm ha resultado exitoso recubrirlas interiormente con una capa

fina de vidrio.
Otra de las limitaciones del acero es que a pesar de su calidad ocurre siempre la
oxidación de la pared interna y las fritas de ambos extremos. Este efecto es
mayor si se usa fases móviles pobremente desgasificadas especialmente
metanol, acetonitrilo y agua o sus mezclas. Es cierto que, si se oxida una parte
de la columna, la capa de óxido formada la protege de ataque posteriores. Pero
en ocasiones como se trabaja con medios agresivos, el óxido se disuelve y el
acero está expuesto siempre al ataque de la fase móvil, en mayor grado si esta
tiene reacción ácida, pero también el metanol y el acetonitrilo reducen la capa de
óxido.
No obstante, a pesar de los inconvenientes indicados, las columnas de acero, en
especial las de diámetro interno comprendidos entre 2 mm y 5 mm, son las que
más se usan en la actualidad.
Las columnas de vidrio, debidamente protegidas con una estructura o forro
metálica exterior, que facilita además su conexión, han encontrado también
muchas aplicaciones, debido a la inercia de este material ante un número
elevado de fases móviles.
Más recientemente se ha comenzado a utilizar columnas capilares de sílice
fundida sin relleno, recubiertas exteriormente de poliamida. Estas columnas
resisten presiones altas, en ocasiones superiores a las requeridas para establecer
el flujo necesario para las determinaciones analíticas.
Las columnas analíticas en HPLC pueden ser de cuatro tipos, acorde a sus
diámetros internos.
• Columnas Clásicas. Estas columnas tienen diámetros internos entre 2 mm y
5 mm. Hasta el presente son las columnas más usadas. Para ellas fueron
desarrollados los elementos constitutivos del sistema cromatográfico (bomba,
inyector, detectores). La longitud de estas columnas, ofertadas
comercialmente, se encuentra entre 5 cm y 50 cm, pero las de mayor uso son
las de 25 cm.
• Columnas SBC. Estas columnas tienen diámetros internos entre 0,5 mm y 2
mm. Las siglas SBC proceden del inglés (small bore column). El uso de estas
columnas brinda algunas ventajas tales como:
− El gasto de solvente es proporcional al cuadrado del radio, por lo que el
ahorro es sustancial.
− La eficiencia es la misma comparada con las columnas de diámetro mayor,
siempre que sea igual en ambas el valor de la velocidad lineal de la fase
móvil ().
− En estas columnas se disipa rápida y fácilmente el calor que se genera por
bombeo de la fase móvil, especialmente si los flujos son altos.

− La cantidad mínima detectable en igualdad del analito, del detector y los

demás parámetros cromatográficos que influyen, es mucho más baja que
en las columnas clásicas, puesto que en HPLC hay proporcionalidad entre
la masa detectable y el cuadrado del radio de la columna cromatográfica.
No obstante, estos beneficios, como desventajas de las columnas SBC se
señalan por lo general las siguientes:
− Requieren un empaquetamiento muy bueno, no siempre alcanzable.
− Las bombas deben trabajar en el rango de 5 microlitros/minuto hasta 500
microlitros/minuto. Estas bombas por lo general son costosas.
• Columnas Microbore. Estas columnas tienen diámetros internos en el rango
de 0,1 mm hasta 0,5 mm. Comúnmente el material constitutivo de estas
columnas es la sílice fundida. Estas columnas se empaquetan por secciones,
se acoplan y después se enrollan. En la actualidad el volumen muerto de
estos acoplamientos es muy pequeño, por lo general inferior a 70 nanolitros.
Puesto que se determina la calidad y eficiencia de cada segmento antes de
acoplarlos para lograr la columna, se puede predeterminar el número de estos
para obtener una columna de la eficiencia requerida.
• Columna Capilar. El diámetro interno de estas columnas se encuentra entre
25 micrómetros y 100 micrómetros. Se fabrican casi exclusivamente de sílice
fundida, puesto que este material garantiza una buena resistencia mecánica
asociada a una flexibilidad aceptable. Resisten presiones del orden de 800
atmósferas ( 55 bar), tienen una superficie interna muy lisa (carecen de
efecto de pared) además como se sabe, son muy inertes.
En estas columnas la fase estacionaria se une químicamente a la pared.
Con el uso de las columnas capilares en HPLC, el consumo de solventes es
muy pequeño (en ocasiones hasta 5000 veces menor que con las columnas
clásicas). Tienen muy buena resolución, pero la capacidad de carga es
pequeña.
Como el flujo de la fase móvil requerido por estas columnas es muy bajo (del
orden de los nanolitros/minuto), se pueden acoplar directamente a detectores
de ionización por llama o a espectrómetros de masa.
La forma de las columnas clásicas analíticas y preparativas es recta. Con ello se
garantiza un empaquetamiento uniforme del relleno. Dada la pequeña longitud
de estas columnas (inferior o igual a 500 mm) la forma recta no crea un
problema de ubicación de éstas en el sistema de cromatografía líquida. Incluso
se puede colocar estas columnas verticalmente sin ningún problema.
Las columnas rellenas de pequeños diámetros y las capilares sin relleno se
pueden enrollar como ya se explicó. Así, una columna de varios metros de
longitud ocupa el mismo espacio que una clásica.
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La figura 10.4 muestra un esquema y una fotografía de columnas

cromatográficas de relleno para HPLC
Figura 10.4. Columnas cromatográficas de relleno, de acero inoxidable para HPLC
10.3.5.2. La fase estacionaria

Si se exceptúa las columnas capilares en las cuales la fase estacionaria está
unida directamente a la pared interior de éstas, las demás columnas usadas en
HPLC, tanto las convencionales como las de diámetro interno pequeño, están
rellenas de un material que es en sí la fase estacionaria y el soporte de ésta.
El tamaño y la forma de las partículas de relleno
Las partículas usadas en las columnas analíticas tienen diámetros de 10
micrómetros o inferiores. Las usadas en HPLC preparativa pueden tener hasta 60
micrómetros y en algunos casos algo mayores.
Como ya se ha explicado con anterioridad, a medida que el tamaño de partículas
disminuye, la eficiencia del proceso en la HPLC es mayor, en igualdad de los
demás parámetros que influyen en ella.
Comercialmente se oferta columnas con tamaños de partículas de 3
micrómetros, 5 micrómetros, 7 micrómetros y 10 micrómetros. Por lo general, a
medida que el tamaño es menor, decrece la uniformidad del empaquetamiento.
La forma de las partículas es también muy importante. Las hay irregulares,
producto de la reducción mecánica del tamaño de partículas mayores. Se obtiene
partículas esféricas con condiciones muy controladas. El tamaño de ellas es muy
uniforme y el empaquetamiento resultante es mucho más regular, la columna es
más permeable a la fase móvil.
La naturaleza del relleno
La base fundamental de casi todos los rellenos en cromatografía líquida es el gel
de sílice completamente poroso. Este se utiliza directamente (en la cromatografía
líquido – sólido) o como soporte sobre el cual se une químicamente la fase
estacionaria. Sin embargo, ha comenzado a usarse rellenos poliméricos, que por
sus características encontrarán seguro un uso amplio en HPLC.
En la actualidad se usa tres tipos fundamentales de rellenos: los inorgánicos

(representados por el gel de sílice y la alúmina); los constituidos por el gel de
sílice modificados químicamente y finalmente aquellos a base de partículas
poliméricas. Hay otros, pero sin la importancia de los mencionados. A
continuación se describe algunas de las características importantes de estos
rellenos.
A. Rellenos inorgánicos
Gel de Sílice. Este material se obtiene en la actualidad con un grado elevado de
pureza. Se fabrica en forma de esferas muy uniformes, con una distribución muy
estrecha de diámetros de partículas. Los tamaños más frecuentemente usados
de estas partículas son de 10 m, 5 m y 3 m. Cada una de ellas puede
obtenerse con un diámetro de poro entre 7 nm y 100 nm. Estos poros le
confieren a la sílice una superficie específica entre 450 m2/g y 50 m2/g
respectivamente.
La sílice tiene una resistencia mecánica elevada y resiste durante largo tiempo
las presiones usuales en HPLC. Sin embargo, tiene tendencia a solubilizarse a pH
por encima de 8. Aun a este pH el relleno puede colapsar, con pérdida de
eficiencia de la columna y asimetría en los picos.
La sílice es ligeramente ácida, por lo que es buena para la separación de
compuestos ácidos y neutros, pero no es adecuada para compuestos básicos o
con polaridad elevada.
La presencia de trazas metálicas en la sílice causa asimetría en algunos picos,
especialmente en muestras básicas y/o polares.
Óxido de Aluminio (Alúmina). Este soporte se usa poco actualmente. Se
comercializa en un número reducido de diámetro de poros. Sus partículas son
fuertes además de que resisten fases móviles con pH hasta 12. Esto permite su
uso en separaciones de compuestos básicos.
Carbón Grafitado. Se oferta como esferas porosas, de varios tamaños y
diámetros de poro. Son usables a cualquier pH y temperatura, pero en líneas
generales tienen menor eficiencia que la sílice o la alúmina. Sus partículas son
frágiles.
Requiere para su uso fases móviles muy puras, pues este relleno retiene
impurezas que eventualmente pueden dar cromatogramas con un ruido
inaceptable.
Además de lo expuesto, estas columnas son muy caras.
B. Sílice modificada
La mayoría de los rellenos usados hoy en HPLC tienen como base la sílice porosa,
con sus grupos silanoles unidos químicamente a compuestos que le dan las
características deseadas.
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Los compuestos utilizados para obtener las fases enlazadas a base de sílice son
los monoclorosilanos y triclorosilanos. En menor grado se usa los diclorosilanos.
Estos tienen un ligando R que le confiere finalmente a la fase las propiedades
requeridas.
La expresión general de la reacción con un monoclorosilano sería:
En función de la naturaleza del grupo R se han podido obtener varios tipos de

relleno de gel de sílice modificada.
• Si R es una cadena carbonada alifática no ramificada, normal de 2 átomos,
8 átomos o 18 átomos de carbono, se obtiene las fases no polares
denominadas RP-2, RP-8 y RP-18 respectivamente. Estas fases,
monoméricas y/o diméricas son las de mayor uso en la actualidad, tanto
en HPLC analítica como preparativa.
• Cuando el ligando R es una cadena carbonada alifática corta, terminada en
el grupo NH2 o el grupo CN, se obtiene soportes polares, usables en
cromatografía de fase normal, los cuales aventajan a los rellenos
inorgánicos a base de gel de sílice o alúmina.
• Las fases que se obtienen cuando el ligando R termina en el grupo
sulfónico (-SO3-H) o el amonio cuaternario (-NH4+) tienen mucha
aplicación en HPLC de intercambio iónico.
• Si el ligando termina en un diol vecino, resulta una fase estacionaria con
aplicación en la cromatografía de exclusión por tamaño (SEC).
Todas las fases orgánicas con soporte de gel de sílice son muy buenas, pues no
se altera su volumen por cambios de solventes de la fase móvil. Esto permite
usarlas con condiciones cromatográficas muy variadas, incluyendo trabajos con
programación de gradiente.
C. Fases estacionarias en base a polímeros porosos
La mayoría de este tipo de fase estacionaria tiene como base al estireno,
reticulado con divinilbenceno para lograr una dureza que le permita soportar las
presiones usuales en HPLC.
Se obtiene esferas del tamaño requerido para su uso en HPLC. El material es
poroso, con un rango amplio de diámetros de poro, lo que permite su uso en el
análisis de moléculas de peso molecular muy amplio.

Este relleno puede usarse en un rango muy grande de pH, pero a diferencia de
los rellenos a base de gel de sílice, sufre modificación de su volumen (se hincha)
con algunos solventes de uso común en HPLC. Esto limita su utilización en la
mayoría de los casos a la cromatografía isocrática.
Este polímero es hidrofóbico por lo que sin la introducción de grupos R, puede
usarse en cromatografía de fase reversa, aunque con menos eficiencia que sus
análogos a base de gel de sílice.
Se han empleado también con ligandos que le confieren propiedades de
exclusión y de intercambio iónico.
10.3.5.3. Los mecanismos de separación en HPLC
En HPLC se pueden realizar separaciones analíticas mediante cualquiera de los
cuatro mecanismos de separación (adsorción, reparto, intercambio iónico y
filtración sobre gel). A continuación, se expondrán los más utilizados.
A. Cromatografía de fase normal
Este tipo de cromatografía fue la que primero se desarrolló y está caracterizada
porque la fase estacionaria es polar mientras que la fase móvil es un solvente
orgánico o una mezcla de solventes orgánicos de polaridad baja, no miscibles en
agua.
La fase estacionaria usada originalmente en este tipo de cromatografía fue el gel
de sílice micro poroso. En la actualidad hay varias fases derivadas del gel de
sílice con propiedades diferentes, de modo que se amplía el rango de utilización
de la cromatografía de fase normal. En orden aproximado de utilización, las
principales fases son:
ciano > gel de sílice > diol > amino
A su vez, la fuerza de la interacción de la fase estacionaria con una muestra en
igualdad de fase móvil y otros parámetros es:
gel de sílice (fuerte) >> amino > diol > ciano
Esta fuerza de interacción con los analitos es de carácter adsortiva. Por lo
general, la fase móvil recubre el adsorbente con una monocapa. Un analito
interactúa con la fase estacionaria, por desplazamiento de una o varias
moléculas de fase móvil.
En el caso de gel de sílice, como ya se ha explicado, la interacción se produce
con los grupos silanoles. Esta adsorción es muy fuerte por lo que algunos picos
cuando se trabaja con gel de sílice, presentan colas. Esta desventaja puede
eliminarse con la adición de pequeños volúmenes de agua o etanol a la fase
móvil. Con estos compuestos, llamados moduladores, se logra saturar los centros
más activos del gel de sílice y los cromatogramas tienen más calidad. El efecto
de los moduladores es mayor en aquellas fases móviles en la que son muy poco
solubles. En el caso de la adición de alcohol a la fase móvil, la concentración
máxima debe estar entre 0,01 % y 0,5 %.
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Concentraciones pequeñas de agua en la fase móvil, entre 1 mg/L y 2 mg/L

originan efectos grandes sobre la fuerza elutrópica de estas. La poca
reproducibilidad y repetibilidad de los tr con las columnas de gel de sílice se debe
casi siempre a la incorporación de vapor de agua del ambiente.
Además, la regeneración de la columna después de un análisis, conlleva el paso
de volúmenes grandes de fase móvil. Cuando se trabaja con sílice modificada los
inconvenientes no se presentan. Los picos no tienen colas y por lo general no se
requiere una regeneración exhaustiva de la columna como en el caso del gel de
sílice.
La fase móvil en la cromatografía de fase normal está constituida por lo general
por dos solventes: un solvente débil, no-polar, llamado A y otro fuerte, polar,
llamado B.
Para obtener una fase móvil adecuada se mezcla B con A hasta obtener una
polaridad tal que origine valores de K para los componentes de la muestra en el
rango 0,5 > K > 20.
Otro aspecto a tener en cuenta en la selección de los componentes y proporción
de estos en la fase móvil es la selectividad. Si  para dos componentes de la
muestra está próximo a la unidad, es preciso variar el porcentaje de B, o cambiar
B por otro solvente fuerte para alcanzar el objetivo, esto es obtener un valor de
1
La retención de los compuestos en este tipo de cromatografía está relacionada
con la polaridad y solubilidad de estos en la fase móvil. Así los compuestos
menos polares (hidrofóbicos) eluyen primero, mientras que los más polares
(hidrofílicos) son los últimos en eluir.
De forma muy general, el orden de elución en cromatografía de fase normal para
compuestos R-X en donde X es un grupo funcional y R una cadena carbonada
alifática, depende fundamentalmente de X y se comporta del modo siguiente:
Alquilo < halógeno (F < Cl < Br < I) < éteres < compuestos nitro < nitrilos <
aminas terciarias < ésteres < cetonas < aldehídos < alcoholes < fenoles <
aminas primarias < amidas < ácidos carboxílicos < ácido sulfónico.
La elección de la fase estacionaria en la cromatografía de fase normal depende
como es natural del problema analítico a resolver.
El gel de sílice es excelente para separaciones complejas. Con esta fase
estacionaria se logra valores adecuados de  variando casi siempre el porcentaje
de B o la naturaleza de este. Para compuestos básicos, aminas, éteres, cetonas y
esteres se requiere la fase amino, mientras que los compuestos muy polares
deben cromatografiarse con la fase ciano.
Finalmente, considerando las propiedades generales de las sílices modificadas y
del gel de sílice, se puede resumir que las primeras no requieren un control
riguroso de la humedad en la fase móvil, se equilibran fácilmente, son estables y

pueden usarse en técnicas de gradiente de elución. El gel de sílice por su parte

es más duradero, más selectivo (es usado en separaciones de isómeros) pero no
es usable en cromatografía con gradiente de elución.
B. Cromatografía de fase reversa
Este es sin duda el tipo de cromatografía líquida más usado y el que más campos
ha abarcado hasta el presente. Con fase reversa es posible analizar muestras
muy variadas, desde compuestos no polares hasta polares y aún iónicos, desde
moléculas pequeñas hasta polímeros de pesos moleculares altos (proteínas, DNA,
plásticos). Es además el procedimiento más robusto de los usados en HPLC.
En la cromatografía de fase reversa, la fase estacionaria es siempre menos polar
que la fase móvil. Esta última es casi siempre agua con un solvente orgánico
polar, hidrofílico (llamado modificador orgánico), mientras que la fase
estacionaria es preferentemente sílice modificada con radicales alquilo
recubriendo su superficie.
El mecanismo de separación en la cromatografía de fase reversa es similar al de
una partición continua entre la fase móvil polar, acuosa, que se mueve a través
de un lecho hidrofóbico, apolar.
Los analitos se distribuyen acorde a su afinidad por ambas fases. Los compuestos
hidrofílicos se retendrán poco y tendrán tr pequeños mientras que los
hidrofóbicos interactuarán más con la fase estacionaria y tendrán tr mayores.
La fase móvil es esencialmente agua (A) con una cantidad de un solvente
orgánico (B) hidrosoluble.
El porcentaje de B en la composición de la fase móvil debe ser tal que para los
componentes de la muestra que se analiza, los valores de K han de encontrarse
en el rango 0,5 < K < 20. Aunque cuando se trabaja isocráticamente (con
composición constante de la fase móvil) se prefiere el rango 1 < K <10. (7)
En RP son pocos los solventes que pueden ser usados como modificador orgánico
(B), puesto que además de ser algo solubles en agua, deben tener una
transparencia adecuada en el rango UV. En la práctica solo el acetonitrilo y el
metanol han encontrado un uso generalizado en RP, pues son transparentes a
longitudes de onda bajas (185 nm – 210 nm), aunque el tetrahidro furano, el
etanol y el propanol han tenido eventualmente algún uso.
En igualdad del porcentaje del modificador, la fortaleza de la fase móvil está
dada por la secuencia:
agua < metanol < acetonitrilo < etanol < tetrahidro furano < propanol
En esta serie el agua es el solvente más débil y los tr resultantes son los
mayores, mientras que el propanol es el solvente más fuerte y con el los tr
obtenibles son los menores.
Para cualquiera de los modificadores (B) los tr decrecen en la medida que la
proporción de este crece en la composición de la fase móvil.
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En la práctica se puede trabajar en un rango amplio de la composición de la fase

móvil (respecto al componente B). Sin embargo esto no quiere decir que la
composición elegida sea la óptima.
La composición de la fase móvil próxima a la óptima se obtiene con relativa
facilidad para un analito dado, llevando a cabo una corrida con gradiente lineal
de B (ver epígrafe 4). La composición de la fase móvil a la cual eluye un analito
bajo esas condiciones, está muy próxima a la óptima para trabajar bajo
condiciones isocráticas.
Un caso particular en la cromatografía de fase reversa está relacionado con las
muestras muy hidrofóbicas (compuestos que no eluyen aún con 100 % de
Acetonitrilo como fase móvil). En estos casos se elige como solvente A al
Acetonitrilo mientras que el B puede ser el tetrahidro furano, el diclorometano o
la acetona.
Cromatografía de fase reversa – par iónico
La cromatografía de par iónico es un método ingenioso de analizar iones por un
procedimiento totalmente diferente al del intercambio iónico. En esencia consiste
en añadir un contraión (Ci) a la fase móvil, el cual se une químicamente al ión
del analito (I) originando un compuesto neutro que se analiza en fase reversa. El
contraión es un compuesto que es capaz de reaccionar rápida y reversiblemente
con el ión (el analito) en la muestra y tiene además un grupo hidrofóbico que
interactúa con la fase estacionaria.
Hay dos teorías para explicar la forma en que se produce la separación en la
cromatografía de par iónico. En una de ellas el contraión y el ión se unen en la
fase móvil y el producto (ICi) interactúa con la fase estacionaria (fase reversa)
acorde a la ecuación.
I+- acuoso + Ci+- acuoso  ICi acuoso  ICi en la fase estacionaria
La segunda teoría supone que el contraión interactúa con la fase estacionaria (se
retiene en ella, y después, desde esta, forma el compuesto con el ión (analito).
I+- acuoso + Ci+- en la fase estacionaria  ICi en la fase estacionaria
En la práctica, los dos mecanismos se complementan y ambos explican, desde

posiciones extremas, lo que ocurre durante la separación.
La figura 10.5 ilustra esquemáticamente estos mecanismos
Las columnas usadas en la cromatografía de par iónico son las RP monoméricas,
pues con ellas se obtiene los mejores resultados. La fase móvil es casi siempre
agua: metanol. La proporción la determina el analista acorde al problema
concreto a resolver. El rango de pH es por lo general de 2 – 8, aunque siempre
hay que tener presente la característica del contraión que se vaya a usar.

Figura 10.5. Mecanismo de fase reversa – par iónico
Las columnas usadas en la cromatografía de par iónico son las RP monoméricas,

pues con ellas se obtiene los mejores resultados. La fase móvil es casi siempre
agua: metanol. La proporción la determina el analista acorde al problema
concreto a resolver. El rango de pH es por lo general de 2 – 8, aunque siempre
hay que tener presente la característica del contraión que se vaya a usar.
Los contraiones usados frecuentemente para muestras catiónicas son:
• Aniones inorgánicos (acetato, Cl-, I-, Br-, PO43-)
• Alquilsulfonato con R de C1 a C16
• Toluensulfonato
• Naftalensulfonato
• Alquilsulfato con R de C1 a C12
• Citrato
• Tartrato
Para los compuestos aniónicos, se usa como contraión:
• Tetraalquil amonio (R4N+), con R de C1 a C7
• Trialquil amonio (R3NH+) con R de C1 a C8
Puede usarse los cationes Na+, K+, Cs+, Mg+2 y Ca+2.
El tiempo de retención en par iónico depende del tipo de contraión. El tr será
mayor cuanto mayor sea la tendencia del contraion a formar par iónico, así como
cuanto mayor sea el peso molecular del contraion y mientras más grande sea el
carácter lipofílico del contraion.
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La concentración del contraión por lo general es baja. El rango óptimo se

encuentra entre 0,002 molar y 0,05 molar. La concentración del contraión
también influye sobre el tr (crece con ésta).
C. Cromatografía de intercambio iónico
La cromatografía de intercambio iónico y la cromatografía de fase reversa – par
iónico, tienen muchos aspectos en común. En especial el mecanismo de
separación es muy similar. Pero debido a las características favorables de la
cromatografía de fase reversa, muchos de los compuestos que en la década de
los años 70 (poco después de la comercialización de los primeros equipos para
HPLC en 1968) se cromatografiaban mediante intercambio iónico, hoy se
analizan por par iónico. En especial los iones pequeños, pues con par iónico es
mejor la resolución y los resultados son más reproducibles.
El principio y el campo de aplicación de la cromatografía de intercambio iónico ya
fueron expuestos en un capítulo precedente. Sin embargo, las características de
la HPLC imponen exigencias al intercambiador iónico que sirve de relleno a la
columna. Este material ha de resistir las presiones elevadas con que se trabaja
en este tipo de cromatografía. Por su naturaleza han sido dos los rellenos usados
hasta el presente:
a) Gel de sílice modificada químicamente con grupos de amonio cuaternario o de
ácido sulfónico (intercambiadores aniónicos o catiónicos, respectivamente).
b) Resinas poliméricas altamente reticuladas que poseen los grupos funcionales
antes mencionados. La estabilidad ácido – base de estas resinas es superior a
la de la sílice modificada.
La fase móvil es por lo general un buffer acuoso diluido, aunque es posible
utilizar sistemas de solventes hidroorgánicos.
El incremento en la concentración del buffer resulta en una reducción de los tr de
los componentes de una muestra. A su vez, la naturaleza de los aniones o
cationes constituyentes del buffer o de la sal que se adiciona a la fase móvil,
influyen selectivamente sobre los tr. En general, la carga elevada tanto del anión
como del catión conduce a un aumento del tiempo de retención.
Para el intercambio aniónico, la fuerza desplazante está indicada para un grupo
de aniones de uso común:
F- (débil) < OH - < acetato < CI - < SCN - < Br - < CrO4- < NO3- < I - < oxalato2- <
citrato3- (fuerte)
La fuerza desplazante en intercambio catiónico está dada en la serie:
Li+(débil) < H+ < Na+ < NH4+ < K+ < Rb+ < Cs+ < Ag+ < Mg2+ < Zn2+ < Cu2+ <
Ni2+ < Ca2+ < Pb2+ < Ba2+ (fuerte)
Para cambiar la selectividad en una separación por intercambio iónico, es preciso
cambiar la naturaleza de la sal.

Para la detección de iones por cromatografía líquida hay varios detectores, como
el de conductividad, el refractométrico, el espectrofotométrico (en el rango UV de
200 nm a 400 nm) y especialmente el electroquímico.
D. Cromatografía de filtración sobre gel
En HPLC pueden también emplearse columnas de filtración sobre gel (GPC, del
inglés Gel Permeation Chromatography) o exclusión molecular para realizar
separaciones de mezclas de compuestos en función de la masa molecular. Esta
cromatografía es aplicable a compuestos con masas moleculares superiores a
2000 y el mecanismo de separación, así como sus características generales ya
fueron explicadas en el epígrafe 7.3.4 del capítulo 4 de este texto.
Los rellenos de las columnas de GPC para HPLC pueden ser de dos tipos:
• Gel de sílice o polímeros orgánicos semirrígidos, que se ofertan con distintos
diámetros de poro que van desde 4 nm (para separar masas moleculares de
50 a 4000) hasta 400 nm con el que se puede obtener separaciones de
muestra con masas moleculares en el rango de 104 Dalton a 107 Dalton.
• Polímeros orgánicos, los que tienen un rango amplio de diámetros de poros y
permite separar muestras con masas moleculares desde 200 Dalton hasta 10 7
Dalton o aún mayores.
Cuando se trabaja con este último tipo de relleno, la presión no debe exceder de
los 100 bar para evitar daños en la estructura de este.
La fase móvil debe tener una viscosidad baja, preferentemente inferior a 0,7 cP.
Entre los solventes más utilizados en GPC se encuentran el tetrahidrofurano,
diclorometano, cloroformo, tolueno y dimetilformamida.
Es importante tener en cuenta las indicaciones del fabricante pues hay
incompatibilidades de algunos rellenos con determinados solventes.
La exclusión en fase acuosa utiliza como fase estacionaria partículas esféricas de
gel de sílice modificada con diversos tamaños de poros que permiten
separaciones de muestra con masas moleculares desde 200 Dalton hasta más de
107 Dalton. La fase móvil es agua o un buffer acuoso.
Las tablas 10.2 y 10.3 muestran algunas fases estacionarias de amplio uso en la
actualidad, así como los criterios de selección del tipo de cromatografía en
función de las características de los componentes a separar.
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Tabla 10.2.
Fases estacionarias empleadas en HPLC
FASE ESTACIONARIA. FASE MOVIL. APLICACIONES.

Gel de sílice. Hexano, CHCl3 Adsorción
Si-OH e isopropanol. Ésteres, éteres, porfirinas
micotoxinas y vitaminas liposolubles.
Alúmina. Hexano, CHCl3 Adsorción

Al2O3 e isopropanol. Aminas.
Amino. Hexano, CHCl3 Fase Normal

Si-(CH2)3-NH2 e isopropanol. Azúcares, esteroides y
nitroderivados.
Ciano. Hexano, CHCl3 Fase Normal

Si-(CH2)3-CN e isopropanol. Aminoácidos y nitroderivados.
Diol. Na2HPO4 0.1 M Fase Normal

Si-(CH2)3-O-CH2-[CH(OH)]2 y agua. Proteínas, péptidos y tensoactivos
acuosos.
Octadecilsilano (C-18) Agua, metanol, THF Fase Reversa

Si-(CH2)17-CH3 y acetonitrilo. Analgésicos, aromáticos,
polinucleares y ftalatos.
Octilsilano (C-8) Agua, metanol, THF Fase Reversa

Si-(CH2)7-CH3 y acetonitrilo. Catecolaminas, esteroides aceites
esenciales.
Dimetilsilano (C-2) Agua, metanol Fase Reversa

Si-(CH3)2 y acetonitrilo. Aminas, fenoles y vitaminas
hidrosolubles.
Divinilbenceno sulfonado. Agua. GPC

Proteínas, péptidos y azúcares.
Divinilbenceno. CHCl3, THF. GPC
Polímeros y gomas.
Vidrio poroso. THF, alcoholes, agua. GPC
Compuestos biológicos.
Sephadex Agua, buffer GPC
Compuestos biológicos, proteínas,
carbohidratos.
Resina fuertemente ácida Na2HPO4 0.01-0.1 M Intercambio iónico
–SO3- Vitaminas hidrosolubles, purinas,
aminoácidos y nucleósidos.
Resina fuertemente básica Na2HPO4 0.01-0.1 M Intercambio iónico
–NH4+ Nucleótidos.

Tabla 10.3.
Criterios de selección del tipo de cromatografía según las características de los
compuestos a separar con masas moleculares menores de 2000.
Carácter polar Tipo de Fase

Solubilidad Fase móvil
y/o iónico cromatografía estacionaria
RP RP-2 a RP-18 CH3-CN: H2O;
MetOH: H2O
Adsorción Gel de Sílice cloroformo,
No polar, no (Si-40 a Si-100) diclorometano
iónico Partición Gel de Sílice diclorometano,
modificada metanol
(Si-NH2, Si-CN,
Solventes Si-diol)
orgánicos RP con control RP-2 a RP-18 CH3-CN:buffer acuoso
de pH MetOH: buffer acuoso
RP- par iónico RP-2 a RP-18 CH3-CN: buffer
Polar, acuoso + contraión
ionizable Partición Gel de Sílice THF, MetOH
modificada H2O, solución buffer
(Si-NH2, Si-CN,
Si-diol)
RP RP-2 a RP-18 CH3-CN: H2O,
MetOH:H2O
Polar, no Partición Gel de Sílice MetOH, CH3-CN, H2O
iónico modificada
(Si-NH2, Si-CN,
Agua Si-diol)
RP– par iónico RP-2 a RP-18 CH3-CN: buffer
acuoso + contraión
Iónico Intercambio Intercambiador buffer acuoso
iónico aniónico o
catiónico
10.3.5.4. Especificaciones de las columnas cromatográficas

Teniendo en cuenta la diversidad de proveedores de columnas cromatográficas,
con frecuencia no basta con seleccionar un relleno, un tamaño de partículas y
unas dimensiones concretas. Para estos mismos parámetros, los resultados
cromatográficos de dos columnas pueden ser muy diferentes, si estas son de
distintos fabricantes.
Por esta razón, en ocasiones se requiere información adicional concerniente a
especificaciones y eficiencia de la columna que se pretende adquirir,
especialmente si por razones de aseguramiento de la calidad es preciso repetir
condiciones analíticas.
Los parámetros más estrechamente vinculados con la eficiencia de la columna
cromatográfica y que por lo general se requiere conocer antes de usarla de forma
rutinaria son:
• Números de platos teóricos para un analito dado y un valor concreto de K.
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• Factor de asimetría de un pico.

• Selectividad determinada para dos compuestos similares.
• Reproducibilidad del tiempo de retención.
• Caída de presión para una fase móvil y temperatura requerida.
• Estabilidad de la columna.
En caso de columnas de sílice modificada, con frecuencia es preciso conocer
además de lo expuesto: la concentración de la fase enlazada (porcentaje de
carbono orgánico, por ejemplo), así como si la fase es monomérica o polimérica.
Algunos de los parámetros indicados pueden obtenerse del fabricante. Hay
columnas que se suministran con cromatogramas tipos. Otros parámetros se
precisa determinarlos en el laboratorio y sirven al analista para la toma de
decisiones en adquisiciones futuras.
10.3.5.5. Problemas de la columna cromatográfica
Durante el uso de la columna cromatográfica surgen problemas, algunos
normales, debidos al número de muestras inyectadas y a las condiciones de
operación. Otros dependen del cuidado al que son sometidas por el analista.
Los problemas se pueden agrupar en tres tipos: variabilidad en tiempos de
retención y resolución, formación de colas y vida útil muy corta
• Variabilidad en los tiempos de retención y en la resolución
Debido al uso prolongado de la columna comienza a producirse variaciones en
los t r y en la selectividad (  ). Estas variaciones son aceptables si no exceden
3 % respecto al valor óptimo de la columna.
Las causas de este comportamiento son varias: pérdida de fase estacionaria;
disolución parcial de la sílice (aun en el caso de rellenos de fase enlazada) y
acumulación de impurezas que no eluyen con las condiciones normales de
trabajo.
Otros factores que influyen y que no dependen directamente de la columna
son: cambios en la composición de la fase móvil; cambios de flujo;
variaciones de temperatura; falta de equilibrio entre análisis sucesivos y la
inyección de tamaños de muestra excesivos.
• Formación de colas
La formación de colas debe evitarse o reducirse al mínimo por el efecto
adverso que tiene sobre la resolución y la exactitud de las determinaciones.
Una cola puede invadir la zona de elución de un componente próximo, con lo
que se reduce la exactitud de la determinación cuantitativa de ambos.
El cálculo del número de platos teóricos y la resolución pueden
sobreestimarse cuando los picos involucrados tienen cola.

Las causas para la formación de cola son varias. Algunas dependen de la

columna, del uso al cual está destinada y otras de las condiciones de
operación.
Las causas principales son: columna de calidad baja (no llenada
adecuadamente); fritas obstruidas; acumulación de impurezas
fundamentalmente a la entrada de la columna; sobresaturación (muestras
muy grandes); efectos extracolumna; retención secundaria (debida a
silanoles libres en el caso de rellenos de fase enlazada); buffer no apropiado o
falta de buffer.
• Vida útil muy corta
El trabajo estable y la vida útil de una columna cromatográfica de calidad
buena dependen en gran medida de la aplicación que se le dé y del trato que
reciba. Aun con condiciones inobjetables (muestras limpias, no agresivas) y
buen manejo, las columnas tienen una vida limitada. Pero esta vida útil varia
de laboratorio a laboratorio y dentro de un mismo laboratorio acorde al
trabajo específico al cual se dedica la columna.
Como orientación, una columna debe desecharse cuando el valor de n inicial
se haya reducido a la mitad, mientras que el valor de  descendió a 75 % de
su valor óptimo. Otro elemento para desechar la columna es el incremento en
el factor de asimetría. Si este es ≈ 2 la columna debe desecharse. Sin
embargo, columnas con estas características pueden ser usadas en trabajos
menos exigentes.
La vida útil debe expresarse por el número de muestras analizadas. Una
columna normal permite el análisis de 1000 – 1500 muestras limpias, no
agresivas, mientras que este número se reduce a 50 – 250 en el caso de
muestras complejas (extractos de tejidos y fluidos biológicos, muestras
vegetales, suelos y sedimentos con un contenido alto de materia orgánica)
sometidas a purificaciones simples.
Si se tiene el registro del trabajo que se realiza con una columna, esta debe
cambiarse cuando se haya analizado el número de muestras indicado en cada
caso.
Por el costo de las columnas cromatográficas hay laboratorios que prolongan
la vida útil de estas, tal como se indicó en párrafos anteriores.
En igualdad de condiciones las columnas que más duran son las usadas en
HPLC – fase normal. En ese orden le siguen las columnas poliméricas,
mientras que las columnas usadas en fase reversa, y sobre todo cuando se
utiliza en la modalidad RP – par iónico, son las que tienen una vida más corta.
Esto se debe a que las fases acuosas son más agresivas que los solventes
orgánicos usados en la modalidad de fase normal.
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10.3.6. Los detectores

Han sido desarrollados numerosos detectores para ser usados en los sistemas de
cromatografía líquida. Además, se ha intentado adaptar a esta técnica algunos
detectores de gran uso en cromatografía gaseosa, pero esto no es aún una
realidad en muchos casos. Lo cierto es que en el momento en que nos
encontramos, el número de detectores adquiribles en HPLC es relativamente
reducido. En los párrafos siguientes se describirá brevemente las características
y la aplicación de la mayoría de los detectores actualmente en uso en esta rama
analítica.
Se describirá además algunos detectores que, aunque aún no se comercializan
ampliamente, son ejemplos notables del desarrollo alcanzado por la HPLC en este
aspecto.
10.3.6.1. Detectores espectrofotométricos UV-Vis
Este tipo de detector se puede usar en el rango ultravioleta (desde 190 nm hasta
360 nm), en el visible (más de 360 nm hasta 800 nm) o en ambos, dependiendo
del fabricante. Hay tres tipos fundamentales de detectores: el detector de
longitud de onda fija, el de longitud de onda variable y el detector de arreglo de
diodos, también llamado multiespectral. En todos ellos una fuente luminosa
procedente de una lámpara apropiada pasa a través de una celda de flujo que
está conectada a la salida de la columna, y llega a un fototubo o a un diodo
donde se mide la intensidad de luz I (figura 10.6). Usualmente la luz de la
lámpara se dirige hacia el fototubo (o diodo) de referencia donde se mide la
intensidad original de luz I0 .Mediante un dispositivo electrónico el detector
transforma estas dos señales en absorbancia (A)
Figura 10.6. Esquema de un detector UV para HPLC
El detector de longitud de onda fija, utiliza una fuente luminosa que emite una
radiación I0 muy fuerte. Por tal razón la sensibilidad de este detector es muy
buena. Sin embargo, no tienen mucha aplicabilidad.

El detector de longitud de onda variable es algo menos sensible, pero es

aplicable a un número mayor de muestras diferentes.
La sensibilidad en líneas generales se encuentra en el rango de los ng a los g,
pero depende fuertemente de la naturaleza del analito.
El volumen de la celda de medición de ambos detectores es inferior a 10
microlitros y el paso óptico es del orden de 10 mm. Son detectores estables, con
un nivel de ruido muy bajo.
Estos detectores son los más usados en HPLC y solo requiere que el solvente sea
transparente a la longitud de onda de trabajo en UV. Su utilización depende de la
naturaleza del analito (que absorba en UV o que tenga color)
La aplicación de la microelectrónica y la computación en la fabricación de
instrumentos científicos, unido al desarrollo de software especializados, ha
permitido el surgimiento y utilización a gran escala, de uno de los detectores más
importantes y sensibles de los que se ofertan hoy para HPLC: el detector
multiespectral o de arreglo de diodos.
Los primeros detectores de arreglo de diodos trabajaban en el rango de 190 nm
hasta 400 nm, mientras que los que se ofertan hoy abarcan también el rango
visible.
El sistema electrónico de estos detectores permite de forma continua y mientras
dura el análisis, captar varios espectros de absorción en una fracción de segundo
(en el rango de longitud de onda de interés). Esta información se guarda en la
memoria de la PC y al final de la corrida se integra para dar un cromatograma
tridimensional absorción – longitud de onda – tiempo de retención.
Las posibilidades que brinda el detector de arreglo de diodos y su software
específico son muchas. Entre ellas, poder determinar y mantener en la memoria
del equipo el cromatograma tridimensional del blanco de reactivos
(eventualmente el blanco de la matriz que acompaña a un compuesto de
interés). Estos cromatogramas se pueden sustraer del obtenido de la muestra,
resultando solamente uno más limpio, más fácil de interpretar, el cual sirve para
identificar trazas o componentes minoritarios de la muestra con mucha
sensibilidad y un grado elevado de exactitud.
Pero además permite hacer comparaciones y búsqueda de cromatogramas
similares almacenados en un archivo (con fines de identificación), entre otras
opciones de interés analítico y del aseguramiento de la calidad correspondiente.
10.3.6.2. Detector refractométrico
Es un detector de uso general, utilizado en la determinación de aquellos
compuestos para los que sea posible usar una fase móvil que como característica
sobresaliente, tenga un índice de refracción diferente al de estos. Es el detector
de menos sensibilidad de los usados en HPLC. Por lo general no detecta por
debajo del microgramo de compuesto. Se opera de forma diferencial, usando dos
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celdas, una de medición y otra de referencia, por la que pasa exclusivamente la

fase móvil. Tiene uso en la determinación de azúcares y oligómeros sintéticos.
No puede usarse cuando se trabaja con gradiente. Es además muy sensible a los
cambios de temperatura por lo que requiere una climatización estable del local
de trabajo.
10.3.6.3. Detector de fluorescencia
Este detector es uno de los más sensibles actualmente en uso. Es ideal para la
determinación de trazas, especialmente en matrices complejas, basado
fundamentalmente en su selectividad elevada. Es tres órdenes de magnitud más
sensible que el detector UV o el de ordenamiento de diodos. Tiene también un
rango lineal amplio (103 - 104).
El detector es selectivo ya que no todos los solutos son capaces de fluorescer,
además los que se excitan, lo hacen generalmente a longitudes de onda
incidentes diferentes. Esto quiere decir que, si se selecciona adecuadamente la
longitud de onda, se puede lograr la respuesta de un analito en presencia de
otros compuestos, sin que se produzcan interferencias.
Este detector como se señaló, es muy sensible. Responde satisfactoriamente en
trabajos de rutina ante cantidades del orden de los picogramos en el volumen de
la muestra inyectado.
Es importante señalar que la señal fluorescente y la longitud de onda óptima de
la radiación excitadora dependen de la temperatura, la polaridad y la viscosidad
de la fase móvil y del pH. Está en manos del analista lograr un compromiso
satisfactorio entre una buena separación cromatográfica y una buena detección.
La gran sensibilidad de la detección fluorométrica ha hecho posible que se
extienda el campo de aplicación del detector de fluorescencia aún a compuestos
que no son fluorescentes. En estos casos se requiere del acoplamiento químico
de la muestra con un compuesto fluoróforo. Esta reacción química puede llevarse
a cabo pre o post columna. Algunos de estos fluoróforos se usan extensamente y
son clásicos en la literatura científica. Entre ellos por solo citar unos ejemplos se
encuentran el 4 bromometil, 7 etoxicoumarina (BrMMC) usado en el análisis de
ácidos grasos; la dansilhidrazina (DNS–hidrazina), utilizada fundamentalmente
en la determinación de aldehídos, cetonas y azúcares; el cloruro de dansilo
(DNS-CL), para aminas y aminoácidos y la 4 cloro 7 nitrobenzofurazano (NBD–
CL) que tiene campos de aplicación en aminas primarias y secundarias. El más
conocido de estos agentes fluoróforos es sin duda el OPA (anhídrido orto ftálico).
Este compuesto se usa ampliamente en el análisis de aminoácidos, péptidos y
aminas.
10.3.6.4. Detector electroquímico
Es un detector muy sensible y selectivo. Se utiliza en la detección de solutos que
puedan oxidarse o reducirse.

En esencia, el detector está constituido por una microcelda a través de la cual

fluye la fase móvil. En ella hay situados dos electrodos, uno llamado de trabajo y
el otro denominado electrodo auxiliar.
La respuesta del detector se origina cuando las moléculas del analito sufren una
reacción redox en el electrodo de trabajo. Paralelamente ocurren reacciones
electroquímicas en el electrodo auxiliar, restableciéndose el equilibrio eléctrico
mediante el flujo hacia ambos electrodos de los iones presentes en la fase móvil
(como componentes de esta). En ausencia de muestra, está pasando fase móvil
solamente por la celda y entre ambos electrodos se mantiene una corriente
iónica portada por el electrolito. La oxidación o reducción de un analito sobre el
electrodo de trabajo provoca un cambio en esta corriente, que previamente
amplificada y registrada en función del tiempo origina el cromatograma (el pico)
del analito en cuestión.
La reacción sobre el electrodo de trabajo es muy rápida. La concentración del
analito se reduce allí casi a cero, por lo que la respuesta del detector está
limitada por la difusión de la muestra hacia la superficie del electrodo de trabajo.
La fase móvil es por lo general una solución acuosa diluida de un electrolito, una
solución buffer diluida o un solvente hidrofílico que contiene un electrolito.
La selectividad del detector electroquímico se basa en que no todos los analitos
sufren oxidación (o reducción). En el caso de los compuestos que sufren
reacciones redox, la selectividad, se logra mediante el ajuste a un valor
determinado del voltaje entre el electrodo de trabajo y el electrodo auxiliar. La
gran sensibilidad (del orden de los picogramos) se debe al pequeño volumen de
celda y a la rapidez con que ocurren las reacciones electroquímicas.
Comercialmente se oferta detectores con volúmenes de dos microlitros y aun
menores. Experimentalmente se ha fabricado algunos detectores electroquímicos
con celdas muy pequeñas, tan solo de unos pocos nanolitros.
Las variaciones de la temperatura afectan la respuesta del detector. Aunque es
posible operar un detector electroquímico a temperatura ambiente, la máxima
estabilidad se alcanza cuando el equipo se encuentra en un área de temperatura
constante.
La adsorción de algunos productos de las reacciones que tienen lugar sobre los
electrodos, cambia la respuesta del detector. Esto requiere una calibración
frecuente y una limpieza de los electrodos o cambio de estos, especialmente el
de trabajo, cosa que en los equipos modernos se realiza con facilidad.
La sal requerida para mantener la conductividad de la solución limita
considerablemente el número de fases móviles utilizables con este detector. En
caso de que la separación cromatográfica no permita la adición de un electrolito,
este puede introducirse a la salida de la columna.
La principal utilización del detector electroquímico se encuentra en los campos de
la bioquímica y los fármacos. Compuestos como las catecolaminas, algunas
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vitaminas, hormonas estrogénicas, analgésicos y narcóticos, se determinan con

una sensibilidad buena.
10.3.6.5. Detector de conductividad
Es un detector útil en la determinación de compuestos iónicos o ionizables. El
detector está constituido por dos celdas, una de medición y otra de referencia. La
fase móvil es una solución acuosa muy diluida de sales, ácidos o bases. Por lo
general las celdas de este detector son pequeñas (del orden de los microlitros).
Los electrodos son de platino.
Hay detectores de conductividad que resisten presiones elevadas. Esto es
importante ya que no es necesario trabajar con dos bombas. Basta intercalar la
celda de referencia entre la bomba y el inyector (o válvula de introducción de
muestras). La sensibilidad es moderada.
10.3.6.6. Otros detectores usados en HPLC
En la actualidad han comenzado a desarrollarse otros detectores para los que se
prevé una aplicación extensa a corto plazo. El desarrollo de esos detectores ha
estado vinculado con la introducción de las columnas de diámetro pequeño y en
especial de las columnas capilares.
De forma muy breve se describen las principales características de estos
detectores:
• Detección en la Columna
Las ventajas de la radiación láser sobre las del arco de mercurio, ha hecho
posible el desarrollo de un modo de detección fluorescente que utiliza una
parte de la columna como celda de flujo.
En efecto, con el uso del láser como fuente excitadora se obtiene una ventaja
sobre la excitación clásica. La radiación láser es muy compacta, coherente,
planar, con una dispersión mínima fácilmente eliminable (la luz del arco de
mercurio por el contrario es omnidimensional)
Si se elimina la poliimida en un segmento pequeño de una columna
cromatográfica capilar y se enfoca la radiación láser hacia ese lugar, se logra
detectar compuestos fluorescentes, en concentraciones extraordinariamente
bajas, por lo menos tres órdenes de magnitud por debajo de lo obtenible con
un detector convencional. El volumen iluminado es del orden de los picolitros.
La emisión fluorescente se mide en una dirección tal que la radiación láser
excitadora no influya en esa magnitud.
La resolución cuando se usa este detector, está dada por la longitud del
segmento de columna iluminado por el láser.
• Detector de lente térmico
Se ha desarrollado un detector que utiliza la radiación láser y el principio de la
detección en columna ya explicado, pero aplicable a compuestos que se
excitan pero que no emiten radiación fluorescente al retornar al estado base.

En esencia, consiste en hacer llegar la radiación láser a un segmento corto de
la columna capilar. Las moléculas del analito al pasar por esa sección de la
columna se excitan. Al volver al estado base generan calor. Esta pequeña
perturbación térmica local cambia el índice de refracción de esa zona en una
magnitud tal que es posible detectarlo.
Este detector es de uso general y tiene una sensibilidad muy buena, en el
rango de los ng a los pg.
• Detector de dispersión de luz
El detector de dispersión de luz es otro que ha sido desarrollado después que
se introdujeron las columnas capilares en HPLC. Este detector responde por
igual ante muestras de naturaleza química muy diferente. Es pues un detector
universal. Tiene como requisito que la fase móvil sea fácilmente volatilizable y
ha encontrado mayor aplicación desde la introducción de las columnas de
diámetro pequeño.
El principio del detector es simple. El eluato de la columna se hace llegar a
una cámara donde se nebuliza para facilitar la evaporización de la fase móvil.
Las partículas del analito se conducen hacia la celda de dispersión de luz. A
través de esa celda pasa continuamente un haz de luz de longitud de onda
apropiada. Parte de esa luz es dispersada por las micropartículas de la
muestra. La intensidad de la luz dispersada se capta y amplifica mediante un
tubo fotomultiplicador.
La magnitud de la luz dispersada es proporcional a la concentración de la
muestra. El tubo fotomultiplicador debe situarse de modo tal que su
respuesta no esté afectada por la luz no dispersada (procedente de la fuente).
10.3.6.7. Acople de la HPLC con espectrometría de masas.
El valor de la espectroscopia de masas (MS) como técnica eficaz en la
identificación de la estructura de compuestos químicos fue reconocido hace
varias décadas. El espectro de masas da una información concerniente al
ordenamiento estructural de los átomos en una molécula. La interpretación de
los espectros de masas brinda una información cualitativa inequívoca acerca de
la identidad de un compuesto. En sus inicios, esta interpretación era difícil y
requería de una cierta especialización de los analistas. No obstante, estas
dificultades, el reconocimiento de su potencial identificador situaba a la MS en un
lugar cimero.
Un uso amplio y creciente ha tenido el acoplamiento de la cromatografía líquida
de alta resolución (HPLC) con espectrometría de masa (MS del inglés “mass
spectrometry”). Por la importancia de esta técnica, se describen a continuación
los aspectos fundamentales.
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El espectrómetro de masas
Todo espectrómetro de masas está constituido por tres elementos o partes
esenciales: la fuente de ionización, el analizador de masas y el detector.
De modo muy general el proceso que ocurre es el siguiente:
Las moléculas eluidas de la columna son ionizadas y fragmentadas en la fuente
de ionización, pues el espectrómetro de masas solo es capaz de detectar
especies iónicas.
Los iones formados en la fuente (la molécula cargada o ión molecular) así como
los fragmentos de esta son separados y enfocados hacia el detector mediante el
analizador de masas. Los haces de iones de igual relación masa/carga (m/z)
impactan en el detector, el cual determina su intensidad.
El analizador del MS es análogo al prisma o monocromador de un
espectrofotómetro, pero en este caso, los iones son separados acorde a sus
valores de m/z, en lugar de la separación de los fotones.
El detector del MS es también análogo al del espectrofotómetro, pero en el
primer caso se utiliza un multiplicador electrónico en lugar de un
fotomultiplicador como en el segundo.
Un esquema conceptual del funcionamiento de un espectrómetro de masas se
muestra en la figura 10.7.
Figura 10.7. Esquema conceptual del funcionamiento de un espectrómetro de masas
La fuente iónica. Una vez que las moléculas de la muestra salen de la interfase y
entran en la cámara de ionización se ionizan, eventualmente también se
fragmentan, originando iones de distinta relación m/z. El esquema general de
ionización y fragmentación es el siguiente:

IONIZACIÓN ABCD + fuente → ABCD+. (ión molecular)

FRAGMENTACIÓN ABCD+. → AB. + CD+
ABCD+. → AB+ + CD.
ABCD+. → ACD+ + B. … etc.
Son varios los métodos usables para provocar la ionización y fragmentación de

las moléculas que llegan a la cámara de ionización.
El método más simple, el que primero se usó y aún continúa vigente en muchas
aplicaciones, es el del impacto electrónico (EI), también conocido por ionización
electrónica. Por lo general este método además de originar el ión molecular
ABCD+. (la molécula no fragmentada, cargada por captación o perdida de un
electrón) produce una fragmentación significativa de la molécula. En general la
ionización es máxima cuando el voltaje de aceleración de los electrones está en
orden de los 50v-70v.
El método de EI no debe usarse para compuestos que se fragmentan muy
fácilmente. En estos casos es difícil determinar las masas moleculares. Tampoco
es bueno el método cuando se requiera analizar isómeros.
La ionización química (CI) por el contrario es un método de ionización menos
fuerte, con el cual se favorece la formación preferencial (aunque no exclusiva)
del ión molecular (ABCD+.). Para lograr esto se introduce constantemente en la
cámara de ionización una sustancia química la cual se ioniza con facilidad
mediante impacto electrónico originando un gas reactivo. Este actúa sobre las
moléculas de la muestra provocando transferencias de carga, pero con poca
transferencia de energía por lo que la fragmentación es poco probable aunque en
algunos casos puede ocurrir.
Entre las ventajas de la ionización química sobre el impacto electrónico se
señalan:
• Puede determinarse la masa molecular de la muestra.
• Es más sensible y selectivo en el caso de muestras complejas, pues puede
buscarse condiciones de ionización adecuadas a un compuesto dado.
• Permite distinguir entre isómeros y estereoisómeros.
• La fragmentación es poca por lo que los espectros son más fáciles de
interpretar.
• Es muy bueno cuando se usa el método de cuantificación SIM (selective ion
monitoring).
Analizador de masas. Los iones formados en la cámara de ionización entran de
inmediato en el analizador de masas. La función de esta parte del espectrógrafo
de masas es filtrar o “enfocar” los iones de igual relación m/z hacia el detector.
Para ello y como las especies a separar son iones en movimiento, se hace uso de
la interacción simultánea de campos eléctricos y magnéticos sobre los primeros,
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acorde a las leyes de la electroestática y la electrodinámica. Esto da origen al

analizador de masas de doble enfoque (eléctrico y magnético).
El objetivo, como se expresó es guiar todos los iones formados hacia un punto
(el detector) y como estos tienen masas y/o cargas diferentes (ión molecular,
fragmentos iónicos) es preciso incrementar progresivamente la intensidad del
campo magnético y la corriente directa, que crea un campo electrostático
también creciente.
Las posibilidades que brinda la electrónica, los materiales novedosos, la
mecánica de alta precisión, así como el uso de PC y softwares especializados han
permitido el desarrollo y puesta en práctica de varios tipos de analizadores de
masa tales como el cuadrupolo y el Ion Trap Analyzer con características
variadas de trabajo en especial el rango de relación m/z máximo y mínimo que
abarcan, así también como la resolución.
No obstante, es importante señalar que aunque los analizadores de masas
mencionados son los más usados hasta hoy en la mayoría de los equipos
comerciales, se ha desarrollado y comenzado aplicar en los últimos años un tipo
de analizador de masas, que basa la separación de las especies iónicas en un
principio totalmente diferente. Este es conocido por sus siglas en inglés como
“TOF mass analyzer” (Time Of Flight), el cual fue el primero en usarse en el
acoplamiento CG– MS, aunque sin éxito por entonces.
En este tipo de analizador las especies iónicas se conducen a un tubo llamado de
deriva y son aceleradas hacia el detector mediante un potencial eléctrico
adecuado a tal fin. Puesto que las especies iónicas que se originan en la cámara
de ionización tienen distintas relaciones m/z, cada ión llegará al detector en un
momento diferente. Los primeros en llegar serán los de menor masa y los
últimos los de mayor.
La resolución en este tipo de analizador estará dada por la diferencia del tiempo
de migración de cada ión, que como es lógico dependerá de su relación m/z. La
resolución depende también de la longitud del tubo de deriva y del potencial
(constante) aplicado, los cuales son aspectos tenidos en cuenta por el fabricante
y optimizados por el.
En la actualidad la resolución de los analizadores de masa comerciales y las del
tipo TOF son similares, obteniéndose rutinariamente valores del orden de 0,1 a 1
Da.
La detección. Cada especie iónica llega al amplificador electrónico y da una
señal cuya intensidad dependerá de su abundancia relativa. La corriente
generada por el flujo de iones proveniente del analizador de masas es muy débil
del orden de 10-14 A. No obstante, a través de un amplificador electrónico alcanza
valores aptos para ser medidos con exactitud.
Hay varios tipos de detectores comerciales en uso desde el punto de vista
analítico la información eléctrica puede ser adquirida de dos modos distintos. En

uno de ellos se monitorea todas las masas producidas en la cámara de ionización

(ión molecular, fragmentos y productos de reacción). Se obtiene un gráfico
tridimensional donde un eje corresponde al tiempo de retención, otro a la
abundancia iónica relativa y el tercero a la masa de cada fragmento. Este modo
es usado en la identificación de compuestos con la ayuda de los ficheros de
espectros de masas.
En el otro modo se selecciona previamente las masas o fragmentos que se
desean medir. Este procedimiento es conocido por SIM. Es mucho más sensible y
selectivo y los espectros son más fáciles de interpretar.
Como resultado del análisis por espectrometría de masas se obtiene un espectro
de masas, que es un gráfico compuesto de muchas líneas, cada una de las cuales
se corresponde con los diferentes fragmentos obtenidos y detectados, en función
de su relación masa/carga (m/z). En el eje de las ordenadas (y) aparece el % de
abundancia de cada uno de estos fragmentos.
La figura 10.8 muestra un espectro de masas de la Vitamina D3
Figura 10.8. Espectro de masa obtenido para la Vitamina D 3 (colecalciferol)
Obviamente el espectro de masas de una especie brinda importante información

cualitativa sobre esta, pues el número de fragmentos obtenido, así como los
valores de la relación m/z de los mismos está íntimamente relacionado con la
estructura de la sustancia.
Con fines analíticos, en un sistema HPLC-MS se registra un cromatograma de
corriente iónica total (TIC) contra el tiempo de retención. Puede también
registrarse la corriente de un ión característico de cada componente de la
muestra, contra el tiempo: este método se denomina SIM por sus siglas
anglosajonas (selective ion monitoring).
Los análisis mediante el acople HPLC-MS son muy precisos. Por lo general se
logra una precisión entre 1% y 10% de la desviación estándar relativa para
concentraciones de decenas de pg a decenas de ng. Otra característica buena del
acoplamiento HPLC – MS es su rango lineal grande, que como mínimo es de 10 4.
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El acoplamiento HPLC – MS se aplica en la determinación de cualquier

compuesto, si se dispone de este de una columna adecuada y condiciones tales,
que permitan cromatografiarlo en un tiempo práctico. Así como es lógico, es
necesario que la masa molecular de la muestra sea compatible con el analizador
de masas del sistema que se disponga.
En la tabla 10.4 se resumen las características fundamentales de algunos
detectores usados en HPLC.
Tabla 10.4
Características y uso de algunos detectores
Detector Uso LD Linealidad Observaciones

Refractométrico Universal g/mL 103
UV Selectivo ng/mL 10 4 Uso frecuente
( fija)
(UV–visible) Selectivo ng/mL 10 3 Espectro de aplicación amplio
( variable)
Fluorescencia Selectivo pg/mL 103 − 10 4 -
Electroquímico Selectivo pg/mL - -

Conductividad Selectivo g/mL- 10 5 Para la detección de
de iones mg/mL sustancias conductivas e
iones
Dispersión de luz Universal g/mL 103 − 10 4 Detección “on – column” para
columnas de di  25 m
Detector de Selectivo fg/mL 10 3 Detección “on – column” para
fluorescencia en columnas de di  25 m
columna
Acople HPLC -MASA Selectivo ng/mL 10 4 Para flujos de 1 mL/min o
menores
10.3.7. Sistema de registro y procesamiento de la información

cromatográfica
Por lo general, la salida de la información producida por el detector ante el paso
de la muestra a través de la celda de flujo, puede registrarse directamente
valiéndose de un registrador convencional. Pero esto es ya algo que se está
utilizando cada vez menos. La introducción de las PC y de los softwares
especializados permite la captación de la información cromatográfica, su
almacenamiento y procesamiento en el momento que se requiera. Los softwares
especializados en cromatografía líquida le proporcionan al analista un número de
herramientas que hacen más fácil, seguro y exacto su trabajo.
La posibilidad de comparar los cromatogramas de la muestra, de los patrones
analíticos y los de los blancos correspondientes al análisis que se realiza es hoy
tarea rutinaria en el análisis por HPLC.

El cálculo cuantitativo se facilita pues además de los tr, el sistema software –

computadora almacena el área y la altura de cada pico significativo.
10.3.8. El colector de fracciones
Para trabajos preparativos en los que se requiere colectar las fracciones eluidas
de la columna puede emplearse de modo opcional un colector de fracciones. El
colector de fracciones se coloca después que la señal del detector ha sido
registrada y de forma análoga a los automuestreadores, estos dispositivos son
programables en cuanto al volumen y número de muestras a colectar en función
del tiempo de análisis.
En la actualidad muchos equipos de HPLC se comercializan con un diseño
modular muy atractivo que posee la ventaja adicional de brindar una mayor
protección a cada uno de sus componentes (figura 10.9).
Figura 10.9. Diseño modular de un cromatógrafo líquido de alta resolución (HPLC) de la

serie 1200, comercializado por la firma alemana Agilent Technologies
Por otra parte el desarrollo alcanzado por las microelectrónica ha conducido a la

aparición de potentes aditamentos de pequeño tamaño capaces de monitorear
todo el proceso cromatográfico (figura 10.10), en tanto el auge de las
Tecnologías de la Información y las Comunicaciones (TICs) facilita el acceso a
enormes bases de datos en línea que permiten la obtención de información
cromatográfica de todo tipo.
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Figura 10.10. Controlador Instant Pilot Agilent. Serie 1200 que proporciona pleno
control instrumental y visualización de la señal en línea
10.4. MODOS DE OPERACIÓN EN HPLC

En líneas generales, los distintos tipos de cromatografía usados en HPLC pueden
llevarse a cabo de modos muy diferentes.
10.4.1. Régimen isocrático
La forma más simple de realizar una determinación en HPLC es cuando todos los
parámetros que influyen en la separación cromatográfica, permanecen
constantes. Entre ellos tiene relevancia la composición de la fase móvil. En este
caso el modo de operación se llama isocrático (de igual fuerza, en este caso, de
elución).
Hay razones muy fuertes para usar, siempre que sea posible, el modo de
operación isocrático:
• El equipamiento es más simple, menos costoso.
• El procedimiento es sencillo y relativamente rápido.
• El tiempo de la estabilización de la columna después de cada análisis es
muy corto, en ocasiones no se requiere esta etapa.
• Los resultados son muy reproducibles y el procedimiento está poco
influenciado por algunas impurezas en los solventes que originan
problemas en otros modos de operación.
Sin embargo, la operación isocrática tiene inconvenientes y limitaciones. Así,
por ejemplo:
• No puede usarse, cuando no es posible lograr que los componentes de una
muestra tengan valores de K en el rango 0,5 < K < 20.
• Es muy difícil obtener resultados adecuados (reproducibles), si la masa

molecular de los componentes de la muestra es superior a 1000 Da. En
estos casos, variaciones muy pequeñas en el porcentaje del modificador
orgánico (% B), ocasionan grandes cambios en los tiempos de retención.
• Si las muestras que se analizan tienen impurezas con K >> 20, además de
dañarse la columna, provocan dificultades en la interpretación y calidad de
análisis sucesivos (eluyen en zonas evaluables de los cromatogramas
siguientes).
• En ocasiones es muy difícil eliminar con medios isocráticos las colas de
algunos componentes de las muestras.
Para dar solución a los problemas cromatográficos expuestos, se ha desarrollado
algunos modos de operación en HPLC. En los epígrafes siguientes se describirá
los tipos principales de programación en HPLC y se hará énfasis en la
programación de gradiente (composición variable de la fase móvil), debido a la
importancia que tiene esta variante tanto en HPLC analítica como en procesos
preparativos a cualquier escala.
10.4.2. Programación de la composición de la fase móvil (gradiente de
elución)
Este es el tipo de programación más usado en HPLC a pesar de que tiene algunas
desventajas (equipamiento costoso, en especial la bomba, además requiere
tiempo para reequilibrar la columna después de cada análisis, lo que implica un
consumo mayor de fase móvil).
Además de las circunstancias que fueron señaladas en el epígrafe 5.5 que indican
como opción la vía de programación en HPLC, en el caso concreto del gradiente
de elución hay que añadir que se mejora sustancialmente la sensibilidad (los
picos son la mitad del ancho y el doble de altos que en la separación
correspondiente de forma isocrática).
Como ya se ha mencionado con anterioridad, en la cromatografía de gradiente de
elución se utiliza como mínimo dos solventes. El solvente A es débil mientras que
el solvente B es fuerte. El porcentaje de este segundo solvente se hace variar en
función del tiempo, de modo de lograr la separación requerida.
Cuando se usa gradiente de elución es útil trabajar con el parámetro tiempo de
gradiente (tG), el cual mide el tiempo en que la fase móvil cambia desde A puro
(100 %) hasta B puro (100 %) en forma lineal (figura 10.11). Por razones
prácticas este cambio se expresa siempre en % V/V.
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Figura 10.11. Incremento lineal del solvente B. Tiempo de gradiente (tG)
10.4.2.1. La Elección de los Solventes A y B

Si el solvente A es más fuerte que el B, la utilización de gradiente de elución
tiene un efecto adverso al deseado pues empeora el cromatograma. Si por el
contrario A es muy débil mientras que B es demasiado fuerte, por lo general los
componentes de la muestra se reúnen muy unidos, con poca resolución, en un
punto del cromatograma. En este caso es aconsejable variar A (seleccionar otro
A) hasta lograr que los picos con tr pequeño no se superpongan.
Si aún con el solvente A más débil los picos tienden a agruparse poco tiempo
después de la inyección, entonces se requiere trabajar con una columna con un
número de platos teóricos mayor (más larga) o cambiar el tipo de fase
estacionaria hasta lograr el objetivo requerido.
La elección del Solvente B reviste una particular importancia en los sistemas de
gradiente. El parámetro tG es muy útil en su selección pues si cuando se alcanza
el tiempo tG, no han eluido aun todos los componentes de la muestra, ello es
indicativo de que es preciso incrementar la fortaleza de B.
10.4.2.2. Tipos de gradiente
Hay varias formas de realizar el gradiente de elución de acuerdo a la forma en
que se varíe la concentración de B en función del tiempo. En este sentido los
gradientes pueden ser lineales, logarítmicos y exponenciales. Los cromatogramas
obtenidos al aplicar cada una de estas variantes poseen características
diferentes.
El gradiente lineal es aquel en el cual el porcentaje de B varía linealmente en
función del tiempo lo que produce de forma general un cromatograma cuyos
picos son equidistantes y tienen anchos en las semialturas muy similares (figura
10.12).

Figura 10.12. Gradiente lineal: (A) representación gráfica, (B) cromatograma

característico.
Cuando se hace crecer B de forma logarítmica en función del tiempo el

cromatograma resultante se caracteriza por el hecho de que los picos con tr
pequeños son más estrechos que los de tr mayor y se produce además un
incremento entre las distancias entre picos a medida que aumenta el tr (figura
10.13)
Figura 10.13. Gradiente logarítmico: (A) representación gráfica,

(B) cromatograma característico.
Finalmente, si la concentración de B se hace crecer exponencialmente en función

del tiempo, el cromatograma resultante presenta picos que van siendo mayores,
más estrechos y con menores distancias entre dos consecutivos tal como se
muestra en la figura 10.14.
Figura 10.14. Gradiente exponencial: (A) representación gráfica,

(B) cromatograma característico.
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Cada una de las tres formas de realizar el gradiente de elución tiene sus ventajas
y su campo de aplicación.
La programación lineal se usa para casos normales, Sus resultados son muy
buenos, especialmente la calidad de sus cromatogramas. En ellos hay casi la
misma resolución para los picos con tr pequeños que para los que tienen tr
grandes.
En el caso del gradiente logarítmico mejora la resolución para los picos con tr
grande, pero hay pérdida de sensibilidad. Mientras que con el gradiente
exponencial ocurre todo lo contrario: los compuestos de mayor tr salen más
finos, con menos resolución, pero se gana en sensibilidad.
Un aspecto que es general para cualquier forma de realizar el gradiente de
elución está relacionado con la capacidad de carga de la columna. Si se trabaja
isocráticamente la sobrecarga de la columna (un tamaño excesivo de muestra)
se manifiesta por una disminución de los tr así como del número de platos
teóricos. La sobrecarga es mayor, en igualdad de condiciones, para los
componentes de la muestra con mayores valores de K.
Esto se pone de manifiesto cuando se analiza una mezcla de varios analitos,
todos con la misma concentración. Si esa concentración es tal que se satura la
columna para el componente con menor tr, esa misma concentración sobresatura
los demás componentes (con tr mayores).
Esto no se presenta cuando se trabaja con gradiente de elución. En este caso,
como que K decrece con el gradiente, la columna no se sobrecarga. Tampoco es
frecuente ver picos con colas cuando se trabaja con gradiente, puesto que la
zona posterior de este está en contacto siempre con una fase móvil más fuerte
que la de su frente.
Por las razones expuestas, es frecuente que los trabajos preparativos en HPLC (a
cualquier escala) se realicen con gradiente de elución.
10.4.3. Programación de flujo o presión de la fase móvil
Este es un tipo de programación sencillo. Puesto que los tr de los componentes
de una muestra son inversamente proporcionales al incremento de la presión (o
del flujo correspondiente) si se programa éste, acorde a una cierta ley
(incremento lineal, exponencial), se logrará un cromatograma más corto, con las
ventajas que esto conlleva.
En la actualidad y con el uso de software especializados, es factible hacer una
programación de presión acorde a una necesidad analítica concreta.
Aunque el método no requiere una estabilización del sistema posterior al análisis,
se usa poco pues tiende a compactar el relleno de la columna si se usa
repetidamente.

10.4.4. Programación de temperatura

Este tipo de programación requiere como es natural disponer de un horno con
regulación de la temperatura. El efecto del incremento de la temperatura sobre
la separación cromatográfica tiene que ver con la modificación de las constantes
de distribución de los solutos.
Pero además de la disminución de los tr que esto lleva aparejado, y debido al
efecto que tiene la fase móvil en la HPLC:
• Se mejora la capacidad de muestra (la columna admite una muestra de
mayor tamaño sin saturarse)
• Disminuye progresivamente la viscosidad de la fase móvil, aumenta la
permeabilidad del relleno y en consecuencia la presión necesaria para
mantener un flujo preestablecido es cada vez menor.
Desde el punto de vista práctico, es necesario programar también la temperatura
de la fase móvil que entra a la columna. Para ello basta con introducir en el
horno de 0,5 m – 1 m del tubo conductor de la fase móvil.
10.5. TRATAMIENTO DE MUESTRAS PARA HPLC

La etapa de la preparación de la muestra es una etapa crítica en cualquier
método analítico y de ella depende en gran medida el éxito de la determinación.
A pesar de que el objetivo de la cromatografía es precisamente la separación de
los componentes de una mezcla y de la formidable fortaleza de HPLC para la
separación de mezclas de altísima complejidad, está técnica no está exenta de
necesitar un cuidadoso tratamiento de las muestras debido a que la impurezas y
contaminantes presentes en la matriz original pueden entorpecer la eficiencia de
la separación y lo que es peor dañar la columna cromatográfica.
De cualquier modo, el objetivo de la etapa de preparación de la muestra es el
mismo que para cualquier método analítico, es decir, extraer el grupo de
compuestos a cromatografiar del modo más eficiente posible, en ausencia de
sustancias interferentes.
Para ello pueden emplearse métodos de extracción convencionales tales como
extracciones sucesivas con disolventes (en función de la polaridad de los
compuestos de interés) y posterior concentración del extracto, procedimientos de
destilación, reflujo, clarificación, digestión, e incluso la aplicación de la
cromatografía en columna convencional como un paso previo a la inyección en
HPLC; pero estos procedimientos tienen la desventaja de consumir grandes
cantidades de solventes y matrices así como largos tiempos de análisis, con
vistas a garantizar porcentajes de recuperación adecuados.
En los últimos años han surgido otras técnicas que permiten un tratamiento de
las muestras menos laborioso y más eficiente. A continuación, se expondrán
brevemente dos de las más empleadas en la actualidad: la extracción en fase
sólida y la microextracción en fase sólida.
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10.5.1. Extracción en fase sólida

La extracción en fase sólida (SPE, del inglés Solid Phase Extraction) es una
excelente opción en la preparación de muestras para análisis por cromatografía
de una enorme gama de componentes presentes en los alimentos (grasas,
proteínas, aminoácidos, azúcares, vitaminas, etc.), con la ventaja de que
requiere de pequeñas cantidades de muestras y solventes orgánicos, así como
cortos tiempos de análisis en comparación con otras técnicas clásicas de
tratamiento de muestras.
El método consiste en hacer pasar la muestra a través de unas pequeñas
columnas cromatográficas, llamadas también cartuchos de SPE, rellenas de un
soporte que contiene la fase estacionaria con la cual interactúan los componentes
de la muestra (figura 10.15).
El objetivo de este procedimiento es la separación del grupo de compuestos (que
posteriormente serán analizados por HPLC o cromatografía de gases), de otros
sustancias contaminantes o interferentes presentes en la muestra, que pudieran
dificultar la posterior separación o incluso dañar la columna cromatográfica. Para
ello debe existir una diferencia apreciable de afinidad por la fase estacionaria
entre los compuestos de interés y las interferencias; así, la purificación y/o
extracción de estos componentes en SPE puede ocurrir de dos formas diferentes:
1. Las sustancias contaminantes interactúan con la fase estacionaria y los
componentes que se desean extraer eluyen rápidamente sin interaccionar con
ésta y se recogen para su posterior separación cromatográfica.
2. Los componentes que se desean extraer quedan en la fase estacionaria
mientras que las sustancias interferentes eluyen. En este caso habría que
hacer pasar con posterioridad a través del cartucho SPE un solvente adecuado
para eluir los compuestos de interés y recogerlos para su análisis.
Figura 10.15. Cartucho de extracción en fase sólida
En la actualidad se comercializan cartuchos SPE desechables de vidrio o material

polimérico que se usan para remover contaminantes o para realizar
fraccionamientos previos. Esta técnica es altamente selectiva y versátil debido al
gran número de fases estacionarias introducidas en los últimos 15 años; además
de la conocida sílica gel, se emplean cartuchos SPE de fase ligada (amino, diol,
ciano), fase ligada reversa (C-8 y C-18) y fase ligada de grupos siloxano y amino
cuaternario para intercambio iónico.
Las tablas 10.5 y 10.6 muestran dos procedimientos de SPE para la preparación
de muestras lipídicas.
Tabla 10.5
Extracción de la fracción de esteroles en aceites
ETAPA ACCIÓN
A Saponificación de la muestra
(0.25-0.50 g aceite + 5 ml 0.5 mM KOH alcohólico, 20 min a reflujo, 80ºC)
B Adición de betulina como estándar interno
(1 mL de betulina en 5 mL de cloroformo
C Ajustar pH y filtrar
(HCl 5 M, filtro de membrana de nylon 0.45 mm)
D Pasar a través de cartucho C18
Tabla 10.6
Elución combinada de colesterol oxidado usando columnas SPE de sílica y NH2
ETAPA ACCIÓN
A Columna SPE de sílica (300mg/3ml); acondicionada con 3 ml hexano
B Aplicación de la muestra
C Elución con 10 ml n-hexano/eter etílico (95:5,v/v); 25 ml n-hexano/eter etílico
(90:10),15ml n-hexano/eter etílico (80:20, v/v), vacío 29 kPa, flujo 0.6 ml/min
v/v]
D Elución de colesterol oxidado con 5 mL de acetona
E Concentración del eluato a 1ml de n-hexano/eter etílico (90:10), v/v
F Aplicación en columna SPE NH2
G Elución con 15 ml n-hexano/eter etílico (90:10), v/v
H Elución de colesterol oxidado purificado con 10 mL de acetona
10.5.2. Microextracción en fase sólida

La microextracción en fase sólida (SPME, del inglés Solid Phase Micro Extraction)
es una técnica de preparación de la muestra en la que se emplea muy poca
cantidad de disolventes. El principio de funcionamiento es muy similar a la
extracción en fase sólida (SPE), pero aquí la fase estacionaria está contenida en
un finísimo capilar (de diámetro interno en el orden de los micrómetros), que
sustituye a la aguja de una jeringa especial. La figura 10.16 muestra un
esquema de la jeringa con el capilar que contiene la fase estacionaria
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Figura 10.16. Jeringa con el capilar contentivo de la fase estacionaria
El procedimiento general consiste introducir un volumen de muestra en la jeringa

y ejercer una presión controlada sobre el émbolo con ayuda de una bomba. La
muestra se adsorbe en fase estacionaria y los eluatos se desechan.
Posteriormente se repite el procedimiento con una solución de lavado para
terminar de eluir las interferencias que no interactuaron con el adsorbente y
nuevamente los eluatos son desechados. Finalmente se hace pasar un disolvente
que actúa como fase móvil y eluye el o los compuestos de interés, los cuales
quedan listos para el análisis por HPLC.
En la figura 10.17 se muestra un esquema de un procedimiento SMPE aplicable a
muestras de mieles, leche y huevos, para la posterior determinación de
cloranfenicol por HPLC. En este caso se empleó un capilar cuyas dimensiones
fueron 2 cm x 530 nm, contentivo de un polímero monolítico como fase
estacionaria.
Figura 10.17. Extracción de cloranfenicol el mieles, leche y huevos utilizando

microextracción con polímeros monolíticos (ácido metacrílico-dimetilcrilato de
etilenglicol)
10.6. APLICACIONES ANALÍTICAS DE HPLC

El objetivo del análisis por HPLC es el mismo que el de cualquier otro tipo de
análisis cromatográfico, esto es, lograr la separación lo más completamente
posible de los constituyentes de una mezcla, para luego identificarlos y
cuantificarlos por algún medio apropiado. En este aspecto HPLC es muy buena
pues las separaciones que se logra con ella son excelentes. En los demás
métodos de análisis conocidos, se precisa separar los constituyentes de una
mezcla (incluidos como tales también las impurezas), para con posterioridad
identificarlos y/o cuantificarlos. En cuanto a la rapidez del método no es
necesario insistir mucho. Así por ejemplo a principios del pasado siglo uno de los
grandes químicos de la época, Emil Fischer, desarrolló un método para analizar
hidrolizados de proteína, el cual requería por lo menos una semana de trabajo
para su terminación. Actualmente el análisis de un hidrolizado de proteína por
HPLC es tarea de unas pocas horas.
Es premisa en todo análisis obtener un grado satisfactorio de aislamiento de los
componentes de la mezcla a analizar. El trabajo se facilita mucho cuando se
supone o conoce el origen de la muestra o la posible presencia de algunos
constituyentes particulares.
Para llevar a cabo una separación por HPLC es preciso tener en cuenta dos
factores importantes: la naturaleza físico-química de la columna y las condiciones
de operación del equipo.
De importancia en cualquier separación cromatográfica es la naturaleza de la FE.
De la elección acertada de ésta depende en gran medida el éxito del análisis.
Cuando no se dispone de datos sobre la naturaleza de la muestra a analizar, es
preciso hacer análisis de tanteo con fases estacionarias de naturaleza químico-
físicas diferentes, con vistas a elegir entre ellas la que presente las mejores
características.
Una vez elegida la FE es preciso tener presente todos los parámetros que afectan
la eficiencia de una columna, los cuales han sido discutidos en detalle al tratar
sobre la ecuación de Van Deemter y que como es lógico, no es necesario repetir
aquí. Solo es preciso señalar que aun eligiendo los parámetros óptimos para una
separación, los resultados pueden ser pobres o insatisfactorios, si no se ha
procedido correctamente al impregnar el soporte con la FE; si con posterioridad
no se empaquetó correctamente el relleno en la columna; si el
acondicionamiento de ésta fue inadecuado, etc. En resumen, los mejores
resultados se obtienen solamente cuando todos los pasos requeridos para la
preparación y puesta en operación de una columna cromatográfica han sido
realizados teniendo en cuenta los principios e indicaciones dados en párrafos
anteriores.
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Condiciones de operación
Los parámetros de operación fundamentales son la composición de la fase móvil,
el sistema de elución empleado y la velocidad de flujo.
En HPLC, la composición de la fase móvil y el sistema de elución empleado
(isocrático o de gradiente) juegan un papel esencial en el proceso por cuanto
determinan la fuerza con que la misma va a arrastrar a los solutos durante el
proceso de separación y por tanto su capacidad de solubilizarlos con mayor o
menor facilidad influye grandemente en la eficiencia de la separación.
En relación a la velocidad de flujo se sabe que existe un flujo óptimo para cada
constituyente, pero la mezcla se cromatografía a un flujo de compromiso. En
cada caso particular habrá que variar el flujo y observar el efecto que esta
variación produce sobre la resolución.
Finalmente es preciso considerar la concentración de la muestra y el volumen de
esta a inyectar. La cantidad de cada componente inyectado debe encontrarse
dentro del rango lineal de respuesta del detector. De no ser así debe realizarse
diluciones hasta satisfacer este requisito. Además, el volumen a inyectar debe
ser el menor posible.
10.6.1. Análisis cualitativo
Para identificar los componentes de una mezcla separados por HPLC se utilizan
diversos métodos, los cuales pueden ser cromatográficos y no cromatográficos.
Los métodos de identificación basados en las propiedades cromatográficas son
relativamente rápidos y sencillos en sus principios. Tienen sin embargo sus
limitaciones. Así, por ejemplo, si se mide el tr y el ancho de la altura media de
un compuesto desconocido y no coinciden con los valores respectivos de un
patrón X cromatografiado bajo idénticas condiciones, se puede afirmar
categóricamente que el producto desconocido no es X. Pero si al realizar las
mediciones de tr y ancho en la altura media se encuentra una buena
concordancia entre los valores respectivos del patrón X y del compuesto
desconocido, (teniendo en cuenta el error normal de medición), no se puede
afirmar que sean la misma especie química. Hay sin embargo una buena
probabilidad de que sean el mismo compuesto; la probabilidad aumentará a
medida que se use otros métodos de identificación (cromatográficos o de otro
tipo).
Es claro que el conocer el origen de la muestra facilita el trabajo. Si se sabe que
un cultivo se trata con insecticidas fosforados y al analizar una muestra de
tomate se presenta un pico con igual tr, ancho en altura media, etc, que el
malathion debemos darnos por satisfechos y aceptar que la sustancia
desconocida corresponde al referido insecticida.
En una identificación de rutina, en la que se use un detector selectivo, es
suficiente la coincidencia de dos o tres parámetros cromatográficos para dejar

sentada la identidad de un compuesto, si se dispone además de datos sobre el

origen de la muestra.
Una identificación más rigurosa se requiere cuando se tiene poca información
sobre la matriz y sobre su composición. En este caso es necesario, como es
lógico, más trabajo sobre la muestra. En primer lugar, hay que hacer selectiva la
identificación desde las etapas preliminares del análisis, esto es desde la
extracción y limpieza. De ser posible habrá de usarse métodos que permitan
separar los analitos en grupos. La información derivada de los métodos de
partición y elución selectiva en columna es muy valiosa para ayudar a interpretar
los resultados cromatográficos. Además de estos métodos, ha de usarse
identificaciones por capa delgada, de ser posible con revelados selectivos. Se
completa el trabajo recogiendo el compuesto separado cromatográficamente en
una trampa adecuada y sometiéndolo a identificación adicional por UV, IR u otra
técnica adecuada.
De cualquier modo, en el análisis de los alimentos el análisis cualitativo se realiza
de forma general con fines corroborativos pues la inmensa mayoría de los
componentes presentes en los alimentos se conocen, así como también se sabe a
priori la procedencia de las muestras y se cuenta con un gran número de
patrones de referencia de estos compuestos.
A continuación, se describen los métodos más empleados para el análisis
cualitativo en el caso de matrices alimentarias.
10.6.1.1. Comparación de los tiempos de retención
Es un método muy sencillo que consiste en comparar los tiempos de retención
obtenidos para un pico cromatográfico de una muestra cromatografiada, con el
tiempo de retención obtenido para un patrón de referencia de la sustancia que se
sospecha esté presente en la muestra.
Es útil cuando se dispone de patrones analíticos y se conoce la procedencia de la
muestra. Se analiza ésta y aquellos bajo iguales condiciones, preferentemente
alternando la inyección de la muestra con la de los patrones y, con las limitantes
ya conocidas, la igualdad de tiempos de retención entre muestra y patrón es un
buen indicio de identidad.
Los tiempos de retención publicados en la literatura no deben usarse como
criterio de identificación. Esto se debe a que el tr depende de numerosos factores
(naturaleza y porcentaje de FE, longitud y diámetro interno de la columna,
velocidad de flujo, entre otros) y no es posible reproducir las mismas condiciones
en otro laboratorio, máxime cuando el porcentaje de FE es variable en función
del tiempo, ya que ésta varía paulatinamente.
10.6.1.2. Anchura en la altura media
La anchura del pico de un analito medido en la mitad de la altura es una
característica distintiva de este. Así, cuando un compuesto desconocido presenta
el mismo tiempo de retención que un patrón analítico y además sus anchuras
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respectivas en la semialtura son iguales, se puede afirmar con mucha

probabilidad de no equivocarse, que ambos son la misma sustancia. Si para
tiempos de retención iguales de muestra y patrón las anchuras respectivas son
diferentes, se puede descartar definitivamente la igualdad. Debe recordarse que
el proceso de ensanchamiento de una banda cromatográfica es muy complejo y
está determinado por numerosos factores, la mayoría de los cuales depende de
la naturaleza físico-química del soluto que se cromatografía. Es lógico que si dos
compuestos tienen naturalezas físico-químicas distintas, sus ensanchamientos
respectivos sean diferentes.
10.6.1.3. Enriquecimiento de pico
Es una variante de la comparación de los tiempos de retención. En este caso una
vez cromatografiada la muestra, se añade a esta una cierta cantidad de patrón
de referencia del compuesto que se sospecha esté presente. La muestra con el
patrón adicionado se vuelve a cromatografiar y si uno de sus picos aumenta su
área es indicativo que se corresponde con el patrón adicionado. Si por el
contrario aparece un nuevo pico en el cromatograma puede afirmarse que el
patrón de referencia no se corresponde con ninguno de los componentes
presentes en la muestra.
10.6.1.4. Utilización de un detector con arreglo de diodos
El empleo de un detector espectrométrico UV-Vis con arreglo de diodos brinda
enormes posibilidades para la identificación de compuestos por cuanto, además
de ofrecer información sobre los tiempos de retención de los componentes y por
tanto ser sensible a la aplicación de los métodos de identificación anteriormente
mencionados (comparación de los tiempos de retención, anchura en la altura
media y enriquecimiento de pico), este detector es capaz de realizar un barrido
en un amplio rango de longitudes de onda a cada uno de los componentes
eluidos obteniendo el espectro de absorción de cada uno.
El uso de computadoras y software especializados permiten en la actualidad
almacenar una enorme cantidad de espectros en bibliotecas digitales llamadas
espectrotecas y realizar comparaciones con los espectros obtenidos por el
detector de cada uno de los componentes cromatografiados lo que permite
realizar el análisis cualitativo basado no solo en las propiedades cromatográficas
de los eluatos sino también, en sus características espectroscópicas.
La figura 10.18 muestra un gráfico en tercera dimensión donde se relacionan los
tiempos de retención y los espectros de absorción de una mezcla compleja.

Figura 10.18. Gráfico tridimensional de una mezcla compleja obtenida con un detector de
arreglo de diodos.
10.6.1.5. Acoplamiento en línea de HPLC con técnicas espectroscópicas

En la actualidad están tomando mucho auge un grupo de equipos analíticos que
constan de un cromatógrafo acoplado a un espectrómetro de masas (MS) o a un
equipo de resonancia magnético nuclear (RMN). Estos equipos son muy costosos,
aunque las ventajas que brindan son innegables por cuanto aprovechan al
máximo las inigualables potencialidades de estos métodos espectroscópicos en la
identificación de prácticamente todo tipo de compuestos.
En la actualidad es posible disponer comercialmente de cromatógrafos líquidos
de alta eficiencia acoplados a espectrómetros de masas (HPLC–MS), como
equipos compactos, en los cuales el espectrómetro de masas se ha convertido en
un detector muy valioso en la identificación y cuantificación. De forma análoga al
detector con arreglo de diodos el uso de computadoras y software especializados
permiten en la actualidad almacenar una enorme cantidad de espectros de
masas en espectrotecas y realizar comparaciones con los espectros obtenidos por
el detector de cada uno de los componentes cromatografiados, sin que el analista
tenga que ser un especialista en espectrometría de masas para arribar a
conclusiones sobre la composición cualitativa de los compuestos
cromatografiados.
10.6.1.6. Colección de analitos eluidos e identificación por técnicas
espectroscópicas, de microanálisis y por cromatografía de capa delgada
La colección de los componentes separados por HPLC de una mezcla compleja
puede realizarse automáticamente colocando un colector de fracciones al final del
sistema cromatográfico. Una vez colectada la cantidad requerida del analito o
analitos de interés, los mismos se analizan mediante métodos espectroscópicos
tales como la espectrometría de masas (MS), la espectroscopia infrarroja (IR) o
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la espectroscopia de resonancia magnético nuclear (RMN) aprovechando las

potencialidades de los mismos como métodos de identificación.
Las técnicas de microanálisis generalmente están muy bien establecidas y
pueden aplicarse con éxito para la identificación de los solutos separados y
aislados por los procedimientos descritos. La especificidad de estos métodos de
identificación es muy grande, razón por la cual se han desarrollado mucho en los
últimos años.
Finalmente, el uso de la cromatografía de capa delgada en la identificación
cualitativa puede tener lugar tanto en el extracto que se inyecta en el
cromatógrafo como en los compuestos eluidos y aislados por los métodos
descritos. La cromatografía de capa delgada tiene un gran poder de separación,
por lo que en la mayoría de los casos puede prescindirse de la separación por
HPLC y se identifica el extracto directamente por este procedimiento.
10.6.2. Análisis cuantitativo
La aplicación de HPLC al análisis cuantitativo tiene sus premisas, sin las cuales
los resultados son poco valiosos o erróneos. Sin que el orden siguiente implique
la importancia, las premisas fundamentales de todo análisis cuantitativo por
cromatografía líquida de alta resolución son:
• Los picos a evaluar han de corresponder a una sola especie química. Es por
tanto importante que la separación haya sido eficiente. Picos con colas o
frentes difusos amplios o con costados ligeramente deformados pueden
enmascarar el resultado cuantitativo. Es importante que la simetría del pico
de una muestra dada sea igual al del patrón correspondiente, cosa esta a
veces difícil de lograr, especialmente cuando se analiza extractos vegetales,
material biológico, etc., en los cuales pueden existir interferencias menores
que afecten la simetría.
• La segunda premisa del análisis cuantitativo tiene que ver con la respuesta
del detector. Esta tiene que ser lineal dentro del rango de concentraciones.
Este rango se determina previamente para cada compuesto o componente de
una mezcla con el detector que se vaya a usar en el análisis, utilizando
patrones puros. Si al analizar la muestra ésta se encuentra por encima del
rango lineal de respuesta, es preciso diluirla hasta que una nueva inyección
caiga dentro del rango. Como ya se señaló al tratar los detectores, es
conveniente determinar el rango lineal midiendo las áreas de los picos.
• Las condiciones de operación han de ser constantes. Esto quiere decir que
durante la realización del análisis debe permanecer invariable la velocidad de
flujo, la naturaleza de la fase móvil y el sistema de elución empleado, el tipo
de columna y los parámetros operacionales del detector.
• La repetibilidad en la inyección de la muestra ha de ser buena. La
introducción de la muestra ha de ser rápida, siempre igual y tener muy
presente inyectar los mismos volúmenes de muestra y patrón. La razón es

sencilla. El ancho del pico cromatografiado depende de la duración de la

inyección, de la temperatura y de la cantidad de muestra inyectada. Es
también imprescindible usar el mismo solvente para diluir la muestra y los
patrones.
En esencia, la cuantificación por HPLC se basa en la correspondencia lineal que
hay entre la concentración o la cantidad de soluto presente en la muestra
inyectada (y que pasa por el detector en un momento dado) y el área o la altura
del pico correspondiente.
Así, la cuantificación de un pico cromatográfico puede realizarse según los
criterios siguientes:
• Usando la señal máxima (altura máxima de pico) como una medida de la
cantidad o concentración.
• Utilizando la señal integrada del detector (área del pico) como una medida de
la cantidad o concentración.
En realidad, siempre que se pueda, la señal a elegir debe ser el área del pico por
cuanto su proporcionalidad con la concentración no se ve afectada por el
fenómeno de ensanchamiento de pico, lo que si ocurre con la altura. Sin
embargo, cuando los picos son estrechos, la evaluación es más exacta y sencilla
si se miden solamente sus alturas. El error que se introduce al medir la anchura
(en la base o en la semialtura) de un pico estrecho es siempre considerable.
En la actualidad el procesamiento de la información cromatográfica se realiza
mediante computadoras y software cromatográficos especializados, los cuales
captan y almacenan la información que brinda constantemente el detector.
Esta información comprende las áreas, alturas y tiempos de retención de todos
los picos de un cromatograma correspondiente a una muestra dada, el
cromatograma completo y otros datos de interés. Esos softwares permiten
además realizar operaciones tales como: comparación de cromatogramas (muy
útil para el trabajo cualitativo) y determinaciones de concentraciones. El analista
puede en cualquier momento y con una rapidez extraordinaria, disponer de esa
información tabulada y/o graficada.
Los métodos de cuantificación de muestras dependen fundamentalmente del
objetivo que se persiga y del tipo y característica de la muestra particular. A
continuación, se describirán los procedimientos de mayor empleo.
10.6.2.1. Método de la curva de calibración
Es posiblemente el método de cuantificación más empleado en HPLC. Consiste en
preparar varias soluciones de un patrón de referencia del analito (PR) a
concentraciones crecientes y exactamente conocidas e inyectarlas
individualmente bajo las mismas condiciones cromatográficas que se emplearon
para obtener el cromatograma de la muestra.
40d78409-8f5a-44ad-af96-811f110af4ad
Los cromatogramas obtenidos de los PR contendrán un solo pico de igual tiempo

de retención (pues se trata del mismo componente bajo las mismas condiciones
cromatográficas) pero los valores de área irán aumentando en la medida que
aumente su concentración.
En la figura 10.19 Se muestra un esquema simplificado de este procedimiento,
así como los cromatogramas obtenidos.
Figura 10.19. Esquema del procedimiento de curva de calibración
El equipo integra las áreas obtenidas en cada cromatograma y con estos

resultados se obtiene una data de área (o altura) de los picos de los PR vs.
concentración (o masa) de los PR. Esta data se procesa por regresión lineal y se
obtiene una ecuación del tipo:
y= mx + a
donde:
m es la pendiente
a es el intercepto
x es la concentración (o la masa) del analito en la muestra inyectada
y es el área (o la altura) del pico del analito en el cromatograma de la muestra

Se obtiene además el valor del coeficiente de determinación (R2), que debe ser
muy cercano a 1 ( 0.99) y es una medida de la linealidad y por lo tanto de la
proporcionalidad entre el área (o la altura) y la concentración (o la masa),
brindando información sobre la calidad del trabajo realizado.
Veamos un ejemplo:
Se requiere cuantificar con exactitud el contenido de Riboflavina en un extracto
vegetal en el rango de 2.0 g/l a 10,0 g/l. Se preparan entonces soluciones
conteniendo patrón de referencia (PR) de Riboflavina en las concentraciones 2,0
g/l; 4,0 g/l; 6,0 g/l 8.0 g/l y 10,0 g/l. Se inyectan volúmenes iguales
de estas soluciones obteniéndose los resultados que se muestran en la tabla
10.6.
Tabla 10.6.
Valores numéricos del gráfico de calibración
Concentración de PR de Área de PR de
Riboflavina (g/l) Riboflavina (mm2)
2.0 187
4.0 399
6.0 601
8.0 814
10.0 995
Los resultados obtenidos se procesaron por regresión lineal obteniéndose la

siguiente ecuación:
y = 101.55 x - 10.1
R2 = 0.9993
Para el análisis de la muestra se inyecta el mismo volumen utilizado en las
determinaciones del gráfico de calibración, obteniéndose un área de 862 mm2
para el pico correspondiente a la Riboflavina en la muestra. Este valor se lleva a
la ecuación de regresión y despejando se obtiene una concentración de 8.59 /l
para la Riboflavina en la muestra, según:
862 + 10.1
x= = 8.59 g / l
101.55
10.6.2.2. Método del patrón externo
Es un método muy usado, especialmente en determinaciones rutinarias donde no
se requiera mucha exactitud. No requiere del uso de una curva de calibración,
pero hay que disponer de todos los patrones analíticos de los constituyentes
presentes en la muestra. Con esta premisa, se inyecta el patrón de referencia del
analito (PR) a una concentración exactamente conocida y con los datos de las
áreas (o alturas) de los picos correspondientes al patrón de referencia y al
componente objeto de cuantificación se plantea la siguiente regla matemática:
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Área del patrón de referencia (A PR) → m (PR)

Área del pico de interés en la muestra (AM) → m (M)
entonces:
AM . m ( PR )
m (M ) =
APR
El método se ilustra con el ejemplo siguiente.

Se extrae 50 g de muestra vegetal para determinar el plaguicida methyl
parathion. Después de terminado el procesamiento de la muestra, se diluye el
extracto a 3.0 ml y se inyecta de éste 2 l en el cromatógrafo, equipado con un
detector adecuado, originándose un pico estrecho de 6 cm de altura.
Posteriormente se inyecta 2 microlitros ( l ) de un patrón de methyl parathion de
2 ng/ l que originan un pico de 8 cm. Se desea saber los ng/kg de methyl
Parathión en la muestra.
Primeramente, calculamos número de ng de patrón inyectado según:
2ng
2l  = 4ng
l
Se establece entonces la relación matemática:
Altura del pico del patrón de referencia = 8 cm → 4 ng de PR
Altura del pico de interés en la muestra = 6 cm → m (M)
6 cm . 4 ng )
m (M) = = 3 ng
8 cm
Esos 3 ng fueron tomados en 2 l del extracto final. Por tanto, su concentración
es 3/2 ng/ l = 1.5 ng/ l .
Si se multiplica la concentración hallada del extracto por su volumen, habremos

determinado la cantidad de methyl Parathión en los 3 ml del extracto, esto es:
1.5 ng . 3000 l = 4500 ng = 4.5 g
Finalmente, la concentración se puede expresar en ppm según:
4,5 g
g / g = mg / kg = ppm = = 0,09 ppm .
50 g
El cálculo en base a áreas se realiza de modo análogo.
Finalmente es importante señalar que para la aplicación de este procedimiento se
debe tener la garantía de que la concentración del patrón de referencia inyectado
se encuentre dentro de un rango de linealidad con los valores de área o altura de
los picos cromatografiados.

10.6.2.3. Método del patrón interno

Es un método muy exacto, de obligatorio uso cuando los resultados analíticos
requieran de una gran confiabilidad. Este método posee la ventaja de compensar
las pérdidas de analito que pueden producirse durante la inyección de la muestra
o durante el proceso de separación antes de llegar al detector.
Supongamos que necesitamos cuantificar un analito M presente en una mezcla.
Se dispone del patrón de referencia (PR) correspondiente a M (si no se tiene el
patrón correspondiente a un componente de la mezcla éste no se puede
determinar) y además se posee otro patrón, que llamaremos patrón interno (PI)
de propiedades físico-químicas semejantes a la de la muestra M, pero que tenga
un tiempo de retención diferente, aunque próximo a ésta, y que por supuesto no
esté presente en la muestra.
De acuerdo al rango de respuesta lineal del detector, tanto para M como para PI
(que debe conocerse previamente) se preparan soluciones en las cuales están
presentes PR y PI. El patrón de referencia (PR) en concentraciones crecientes y
exactamente conocida, mientras que el patrón interno (PI) tiene que tener la
misma concentración en todas las soluciones (idéntica además a la adicionada a
la muestra). Para 4 puntos de la curva, las concentraciones (en las unidades
propias del problema particular) pudieran ser por ejemplo:
Punto PR PI
1 2,0 2,0
2 4,0 2,0
3 6,0 2,0
4 8,0 2,0
Estas soluciones se preparan a partir de los patrones puros de PR y PI,

enrasándose al mismo volumen. Se inyectan entonces, individualmente y por
separado, volúmenes iguales de las soluciones, bajo las mismas condiciones
cromatográficas que se emplearon para obtener el cromatograma de la muestra.
Los cromatogramas obtenidos de los PR+PI contendrán 2 picos de diferentes
tiempos de retención (pues se trata de dos compuestos). Los valores de área de
los picos correspondientes al patrón de referencia (PR) irán aumentando en la
medida que aumente su concentración, mientras que el área de los picos
correspondientes al patrón interno (PR) se mantendrá constante puesto que su
concentración en todas las soluciones inyectadas es la misma.
La figura 10.20 ilustra este proceso para el caso del ejemplo considerado.
40d78409-8f5a-44ad-af96-811f110af4ad
Figura 10.20. Esquema del procedimiento de curva de adición de patrón
El equipo integra las áreas obtenidas en cada cromatograma y con estos

resultados se calcula para cada punto, el cociente de las áreas PR/PI. Así, se
obtiene ahora una data de concentraciones de los patrones de referencia (PR) vs.
las relaciones de áreas (APR/API) obtenidas experimentalmente. Esta data se
procesa por regresión lineal y se obtiene una ecuación del tipo:
y= mx + a
donde:
m es la pendiente
a es el intercepto
x es la concentración (o la masa) del analito en la muestra inyectada
y es la relación de área (APICO DE INTERËS /API) en el cromatograma de la muestra
Cuando se va a analizar la muestra se añade a ésta la misma cantidad de patrón
interno (PI) que fue usada para obtener los distintos puntos del gráfico de
calibración y se enrasa al mismo volumen. Se inyecta de la muestra el mismo
volumen que se usó para obtener los cromatogramas de calibración obteniéndose
un cromatograma en que aparece un pico adicional, correspondiente al patrón
interno (PI). La figura 10.21 ilustra este proceso.

Figura 10.21.
Cromatogramas de una mezcla de vitaminas. A la izquierda, el cromatograma de la muestra
sin adición de patrón interno (PI); a la derecha, el cromatograma con adición de PI a la muestra.
Nótese la aparición de un nuevo pico entre los picos 5 y 6.
Una vez obtenido el cromatograma de la muestra que contiene PI, se integran

los picos de los componentes de interés y del PI de la misma forma usada en el
caso del gráfico se calcula el cociente (Área del pico de interés en muestra/Área
de PI). Este valor se sustituye en la variable “y” de la ecuación de regresión y
despejando “x” se obtiene el valor de la concentración de la muestra, en la
misma unidad de concentración con la que se prepararon las soluciones de
calibración.
y = mx + a
A PICO DEL ANALITO
−a
y −a A
x= o sea c ( analito) = PI
m m
Si la muestra tiene varios picos que se desea cuantificar, habrá que establecer
para cada uno de ellos un gráfico de calibración del modo descrito, lo que resulta
en extremo trabajoso. En estos casos, resulta práctico aplicar una variante más
sencilla del método del patrón interno a la que llamaremos en este texto
método del patrón interno simplificado.
El proceso que se sigue es el siguiente:
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En primer lugar se inyecta una mezcla de los

patrones de referencia de los componentes
previamente identificados cuyas masas son
exactamente conocidas. Dicha mezcla contiene
también una cantidad exactamente conocida
del patrón interno. Para el ejemplo considerado
con anterioridad de la separación de vitaminas,
se obtendría un cromatograma con 8 picos
(figura 10.22).
Con los datos de masas y áreas de los patrones
de referencia y el patrón interno se calcula un
factor f (conocido como factor de respuesta del
detector) para cada uno de los patrones. El
factor de respuesta emerge de la siguiente
relación:
mPR1 ⎯→ APR1
mPI ⎯→ API
entonces, Figura 10.22. Cromatograma de la mezcla
de los 7 patrones de referencia de las
mPR1 API vitaminas (PR) y el patrón interno (PI)
f1 = ∙
APR1 mPI
Aplicando el mismo procedimiento para cada uno de los patrones se obtendrían
un total de 7 factores de repuesta según:
mPR2 API m A mPR7 API
f2 = ∙ , f3 = PR3 ∙ PI , … … f7 = ∙
APR2 mPI APR3 mPI APR7 mPI
donde: mPI y API es la masa del patrón interno y su área correspondiente; mPR1,
mPR2, … mPR7 y APR1, APR2, … APR7 son las masas y áreas respectivas de los
patrones de referencia de cada componente.
Si se quiere determinar la cantidad de cada componente en una muestra cuya
masa es Pm, se añade a ésta la misma masa de patrón interno utilizado para el
cálculo de los factores de respuesta. Se cromatografía esta mezcla y se integran
las áreas de los picos correspondientes a los componentes de la muestra (AM) y
al patrón interno (API). La cantidad de cada componente se calcula según:
Para el pico 1
m del componente 1 (mM1) ⎯→ Área del pico 1 en la muestra (AM1)
m del PI (API) en la muestra ⎯→ Área del PI (API) en la muestra
así quedaría:

AM1 . mPI
mM1 = y se multiplica por el factor calculado para el componente
API
AM1 . mPI
correspondiente al pico 1, según mM 1 = . f1
API
Este mismo procedimiento se emplea para determinar la masa de cada uno de

los componentes de la mezcla usando en cada caso el factor de respuesta
calculado para cada componente.
Nótese que a través de este método (patrón interno simplificado) no es necesario
realizar una curva de calibración para cada componente a cuantificar, lo que
conduce a un significativo ahorro de reactivos y de tiempo.
Cualquiera de los métodos del patrón interno explicados anteriormente, presenta
como ventaja fundamental que, debido a que la determinación es relativa, se
elimina el error de inyección, dependiendo la exactitud de la determinación del
cuidado y exactitud con que se haya preparado el gráfico de calibración y la
solución de la muestra. Así mismo, en este caso, pequeñas fluctuaciones en los
parámetros de operación carecen de efecto medible sobre los resultados.
El método del patrón interno, es tanto más exacto cuanto más se ajuste el
compuesto elegido como patrón interno a los siguientes requisitos:
• Debe estar relacionado estructuralmente con la muestra que se vaya a
determinar.
• El pico del patrón interno debe encontrarse próximo al del compuesto que se
vaya a analizar. Si la muestra tiene más de un compuesto, el Pi debe eluir
aproximadamente hacia la mitad del cromatograma.
• La concentración del PI debe ser semejante a la de la muestra. En caso de
una mezcla, este requisito no es fácil de satisfacer, pero al menos muestra y
patrón han de poder determinarse con la misma atenuación del electrómetro.
• El PI no debe interactuar químicamente con los componentes de la muestra.
Veamos a continuación un ejemplo numérico:
Se requiere cuantificar con exactitud un compuesto M en el rango de 2,5 g/l a
10,0 g/l. Se conoce para este compuesto un patrón que llena los
requerimientos de un patrón interno (PI) . Se prepara entonces soluciones
conteniendo patrón de referencia de M (PRM) en las concentraciones 2,5 g/l;
5,0 g/l; 7,5 g/l y 10,0 g/l, mientras que en todas ellas PI tiene una
concentración de 5,0 g/l. Se inyecta volúmenes iguales de estas soluciones
obteniéndose los resultados que se muestran en la tabla 10.7.
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Tabla 10.7.
Valores numéricos del gráfico de adición de patrón
Conc. de PRM Conc. de PI Área (mm2) Relación

g/l g/l PRM PI Área PRM/Área PI
2,5 5,0 340 590 0,576
5,0 5,0 653 565 1,156
7,5 5,0 958 552 1,735
10,0 5,0 1251 543 2,304
Los resultados obtenidos de /l de PRM vs. Área PRM/Área PI se procesaron por
regresión lineal obteniéndose la siguiente ecuación:
y = 0.2305 + 0.002
R2 = 1
Para el análisis de la muestra se añade PI y cantidad suficiente de solvente de
modo que la concentración de éste sea exactamente de 5,0 g/l. Se inyecta el
mismo volumen utilizado en las determinaciones del gráfico de calibración,
obteniéndose un área de PRM igual a 538 mm2 mientras que esta vez el patrón
arrojó un valor de 572 mm2.
538
La relación = 0.94 se lleva a la ecuación de regresión, obteniéndose una
572
concentración de 4.06 g/l para la muestra. Se recomienda que el lector analice
con detenimiento las relaciones concentración de muestra-área; concentración PI
–área y finalmente la relación área PRM – área PI.
10.6.2.4. Método de normalización interna
Este procedimiento, también denominado método del área total, se aplica
exclusivamente cuando cada uno de los componentes de una muestra compleja
está representado por un pico en el cromatograma. Esto quiere decir que si la
muestra consta de n componentes, su cromatograma deberá tener n picos
resueltos. El porcentaje de cada componente en la mezcla se determina
mediante la expresión:
Ay
% componentey = y =n
 100
 Ay
y =1
y =n
En donde Ay es el área de cualquiera de los n picos y A
y =1
y es la suma de las
áreas de todos los picos. Si el detector usado respondiera igual ante todos los
componentes de la muestra, el resultado del análisis de la mezcla sería
satisfactorio. Pero en la práctica los detectores no responden igual ante
compuestos diferentes. Para eliminar esta dificultad se ha introducido factores de
corrección, los cuales se calculan para cada componente según la expresión:

Py
fy =
A' y
Py es la masa del constituyente y de la mezcla y A’y el área del pico de éste.
Si se usa los factores de corrección, la expresión para el cálculo sería:
f y  Ay
% componentey = y =n
 100
f
y =1
y  Ay
El método descrito es muy usado cuando se requiere determinar la composición

relativa de una mezcla.
Ejemplo. Se desea conocer la composición de una mezcla que tiene cuatro
constituyentes. Al analizar por HPLC están presentes en el cromatograma cuatro
picos de áreas: a= 225mm2; b= 375 mm2; c= 250 mm2; d= 150 mm2.
La composición de la mezcla es la siguiente:
 Áreas a + b + c + d = 225 + 375 + 250 + 150 = 1000mm2
225
a: = 0.225 (22,5%)
1000
375
b: = 0,375 (37,5%)
1000
250
c: = 0,25 (25,0%)
1000
150
d: = 0,15 (15,0%)
1000
Esta sería la composición de la mezcla en caso de que el detector responda igual
ante los cuatro componentes. Si el detector no fuera ideal (por ejemplo un
espectrómetro UV, en el que cada componente tiene un valor de max diferente),
habría que preparar una muestra sintética con cantidades conocidas de cada uno
de los componentes y luego de analizadas por cromatografía, se determinarían
con ella los factores fy con lo que se aplicaría entonces la expresión
correspondiente.
10.6.3. Límite de detección y límite de cuantificación
El límite de detección (LD), es la concentración más pequeña, que puede ser
detectada por el método analítico con un grado aceptable de confiabilidad.
El LD está relacionado con la señal del compuesto y con el ruido en el momento,
y con las condiciones cromatográficas con que se trabaja y por lo general es
definido como el pico cuya relación señal/ruido es al menos de 3:1.
40d78409-8f5a-44ad-af96-811f110af4ad
La forma más adecuada de disminuir el LD es mediante la reducción del ruido. En

ocasiones el ruido depende de factores intrínsecos del detector y del sistema
electrónico asociado. Este por lo general es un parámetro propio del equipo y
depende de su calidad, asumiendo que no es debido a desperfectos.
Pero los factores que más inciden en la presencia del ruido en el cromatograma
son las impurezas de los solventes, la contribución de la matriz de la muestra y
en ocasiones el sangramiento de la fase estacionaria. Un análisis de trazas a
niveles del orden de los /kg o inferior requiere de cuidados extremos: un local
protegido de contaminación, incluso proveniente del aire (ambiente); cristalería
limpia y un control rutinario de la contribución al ruido de los factores
mencionados. Excepto la contribución de la matriz de la muestra, los demás
pueden ser objeto de reducción y mantenimiento al mínimo práctico.
El límite de cuantificación (LC) es por su parte la concentración menor que puede
cuantificarse de forma confiable con un nivel aceptable de exactitud y precisión.
El LC está igualmente relacionado con el ruido, de tal modo que se plantea que
para poder cuantificar un pico de modo confiable, se requiere que la relación
señal/ruido sea al menos 10. Para valores de concentración pequeños es
importante conocer el LC y este carece de significación si la concentración de la
muestra es grande.
En la figura 10.23 Se esquematizan los criterios para la determinación del límite
de detección y cuantificación en función del ruido.
Figura 10.23. Criterios para la determinación del LD (a) y el LC
10.7. HPLC PREPARATIVA

El objetivo de este tipo de cromatografía líquida es el de obtener cantidades
pequeñas de compuestos puros (ng – mg), utilizando el equipamiento analítico
convencional, aunque no se excluye la posibilidad de uso de bombas, inyectores
y columnas especiales.

Si es posible establecer unas condiciones cromatográficas tales que el compuesto

de interés está bien separado de otros compuestos y/o impurezas, entonces
puede aplicarse una sobrecarga a la columna y obtener así cantidades mayores
del producto deseado.
Cuando la inyección de la muestra contiene 25 g o menos (para una columna de
4,6 mm de diámetro interno), el ancho de la banda y el tiempo de retención no
dependen del tamaño de la muestra. Si la inyección es mayor que el valor
indicado, el pico se ancha, se distorsiona. El tamaño puede aumentarse
gradualmente hasta que la banda de interés se aproxime (sin solaparse) con la
banda del compuesto que la precede.
Por lo general es preciso disponer de las condiciones cromatográficas analíticas
antes de intentar una separación preparativa. Además, se necesita conocer
aspectos de la HPLC preparativa que ayudan a elegir adecuadamente el
procedimiento a seguir. En los párrafos siguientes se expondrá estos aspectos,
sin que el orden indique la importancia. Todos son sin duda importantes.
10.7.1. La fase móvil
Para obtener un producto puro es necesario eliminar la fase móvil de la fracción
colectada donde se encuentra el compuesto de interés. Por ello es preferible
siempre trabajar con la modalidad HPLC – fase normal, pues es mucho más fácil
evaporar los solventes orgánicos que le son típicos, comparado con las fases
móviles acuosas usadas en la cromatografía de fase reversa.
Además, si el objetivo es trabajar a una escala mayor, es importante también
tener en cuenta que el gel de sílice no modificado es la fase estacionaria menos
costosa, comparado incluso con los derivados ciano, diol y amino. Si se exceptúa
la solubilidad ligera en las fases móviles básicas, el gel de sílice no tiene otro
inconveniente.
De ser posible hay que evitar el uso de aditivos a la fase móvil que puedan hacer
difícil el aislamiento puro del compuesto de interés (como tampones, sales del
buffer). Si esto no fuera posible debe usarse aquellos aditivos que tengan mayor
volatilidad (ácido acético, ácido fórmico, carbonato de amonio), los cuales son
más fáciles de eliminar.
10.7.2. Solubilidad de la muestra en la fase móvil
Hay que tener en cuenta también la solubilidad de la muestra en la fase móvil.
En HPLC analítica esto no es importante y se recordará que se recomienda en
algunos casos inyectar la muestra en un solvente poco miscible en la fase móvil.
Pero en HPLC preparativa se requiere una masa grande de muestra en el
volumen menor posible de fase móvil. Esta es otra razón para elegir HPLC- fase
normal, pues las fases móviles en cromatografía reversa no disuelven
adecuadamente la mayoría de los compuestos orgánicos.
40d78409-8f5a-44ad-af96-811f110af4ad
10.7.3. Importancia relativa del número de platos teóricos y el factor de

selectividad
En HPLC preparativa el número de platos teóricos (n) y la selectividad () tienen
una importancia relativa. Así cuando el tamaño de muestra que se inyecta es
cada vez mayor, el número de platos teóricos se convierte cada vez más en una
función de este y es más independiente de la longitud de la columna, del flujo de
fase móvil y del tamaño de partículas del relleno. Eso permite trabajar HPLC
preparativa con partículas de relleno grandes y con flujos elevados. Si con estas
condiciones  es también grande para el compuesto de interés y su impureza
más próxima, entonces se puede inyectar muestras mayores.
10.7.4. La masa de la muestra a inyectar
En la práctica, la masa máxima de la muestra para la obtención de fracciones
puras en condiciones límites de resolución (próximas a la superposición de las
bandas contiguas), se logra experimentalmente. Más adelante se verá que
también puede hacerse un estimado teórico. Este tamaño máximo va a depender
mucho de la naturaleza de la muestra y de las condiciones cromatográficas.
Así, si se logra aumentar  eligiendo adecuadamente los parámetros
cromatográficos, entonces la masa máxima de muestra a inyectar puede ser
grande. Acorde a la teoría, si  para una columna analítica de 250 mm x 4.6 mm
es por ejemplo 1,05, la cantidad máxima de muestra debe ser ≤ 30m. Pero si
se logra modificar las condiciones de modo que se obtenga un valor de = 3,
entonces la cantidad de muestra máxima es 6 mg (2000 veces mayor) para la
misma columna.
Un incremento de  por selección adecuada de las condiciones en HPLC, además
de permitir un tamaño mayor de muestra cómo se indicó, hace posible trabajar
con n pequeño (esto significa entre otras cosas, partículas de relleno de
diámetros mayores y consecuentemente flujos de fase móvil más altos). Se
reduce así el tiempo para cada corrida, o lo que es igual, se aumenta la
productividad.
Esta es otra de las razones, además de las expuestas con anterioridad, de
seleccionar el gel de sílice como relleno en la HPLC preparativa. Con él es posible
lograr variaciones grandes de  con cambios pequeños en las condiciones
cromatográficas.
10.7.5. Rendimiento
Como el objetivo de la HPLC preparativa es obtener producto puro, se define la
velocidad de producción Pi como la cantidad Qi separada en el tiempo t ri . Esto
es:
Qi
Pi =
t ri

A su vez Pi puede expresarse en función de parámetros cromatográficos y las

dimensiones de la columna:
1
1 h 
2
Pi = A  B  u  C  D  − o 
N L 
donde:
A = sección transversal de la columna
B = porosidad del relleno
u = velocidad lineal de la fase móvil
C= concentración de la muestra
D= relación entre el volumen inyectado Vi y 0, a su vez 0 mide la dispersión del
volumen de muestra inyectado a la entrada de la columna. En la práctica se trata
de lograr que 0 sea lo más pequeño posible
N = número de platos teóricos
h0 = valor que toma h (altura del plato teórico) cuando V i tiende a cero
L = longitud de la columna
Esta expresión, además del resultado cuantitativo, permite hacer un análisis
cualitativo del efecto de cada uno de los factores que influyen sobre la velocidad
de producción.
10.7.6. Alcance y requerimientos materiales de la HPLC preparativa
La HPLC preparativa puede ser de tres tipos acorde al objetivo que se persiga y
los requerimientos materiales necesarios para llevarla a cabo.
A escala de laboratorio puede ser de dos tipos: HPLC preparativa con fines
analíticos y/o con fines de obtener compuestos puros a pequeña escala para
investigación o uso en el laboratorio. Cuando el objetivo es separar cantidades
grandes se tiene la HPLC a escala productiva o comercial.
• La HPLC preparativa con fines analíticos se utiliza para separar
componentes de una mezcla para ser usados en su identificación por vías
no cromatográficas. En la actualidad, y con la introducción de las técnicas
acopladas esta modalidad continúa usándose debido al costo elevado de
esos equipos. Para lograr una separación con la finalidad indicada no se
requiere equipo adicional (solo el analítico convencional). El diámetro de
las partículas de relleno usable debe estar entre 3 m y 10 m. Por lo
general se trabaja con presiones inferiores a 300 bar, mientras que los
flujos no exceden de 10 ml/min. Las bombas analíticas en uso hoy
alcanzan esa entrega. Las columnas pueden tener hasta 10 mm de
diámetro interno y de 250 mm a 500 mm de longitud.
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• La HPLC preparativa a escala de laboratorio persigue obtener cantidades

del orden de los gramos de compuestos puros para realizar ensayos
toxicológicos, determinación de estructura o simplemente para obtener
patrones con un grado elevado de pureza. El diámetro de las partículas
(casi siempre de gel de sílice) se encuentra entre 5 m y 10 m. Se
trabaja con flujos desde 1 ml/min hasta 100 ml/min. Esto requiere
bombas especiales, aunque la presión no excede los 100 bar. Las
columnas usadas son de vidrio, con diámetros en el rango de 2,5 cm a 7,5
cm, y longitudes de 50 cm como máximo. Son columnas especiales para la
finalidad indicada.
• A escala productiva, la HPLC preparativa usa columnas de vidrio y/o acero
inoxidable, con diámetros internos desde 2,5 cm hasta 100 cm y
longitudes entre 50 cm y 250 cm. Los rellenos usados casi exclusivamente
son el gel de sílice, la alúmina y la celulosa. El tamaño de partículas es del
orden de los 100 micrómetros. Las presiones de trabajo son en
consecuencia, bajas. Por razones económicas y en dependencia de la
separación que se lleva a cabo, con frecuencia se desecha el relleno
después de usado, debido al costo elevado de los volúmenes de solventes
requeridos para la regeneración de las columnas.
1. Consulte los apéndices C-5, C-7 y C-8, en los que aparece un
resumen de la instrumentación empleada en (HPLC) así como de
los procedimientos de identificación y cuantificación utilizados en
esta técnica.
14.2. Problemas integradores.
epígrafe 14.3. Análisis de documentación científica.
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11 Cromatografía de gases
11.1. GENERALIDADES
Las primeras separaciones por cromatografía de gases fueron realizadas por
Hesse y colaboradores en 1941, los cuales hicieron pasar una mezcla de
compuestos orgánicos volatilizados a través de una columna empacada con gel
de sílice. Surgía así la cromatografía gas-sólido, que fuera más tarde
desarrollada por Cremer en 1951 y tuvo su impulso decisivo un año más tarde
cuando Martin y James lograron separaciones en fase gaseosa utilizando el
mecanismo de reparto; surgía así la cromatografía gas-líquido, ampliando
extraordinariamente el campo de aplicación de la cromatografía de gases.
El impacto de esta técnica cromatográfica fue tan grande que ya en 1954
aparecieron los primeros cromatógrafos de gases en el mercado y en 1980 se
estimaban en más de 200 000 el número de equipos en el mundo y en más de
30 000 las publicaciones del tema. En la actualidad la cromatografía de gases es
la mejor opción para la separación de compuestos volátiles o volatilizables.
La cromatografía gaseosa es un método de separación físico aplicable a
compuestos que puedan volatilizarse directamente o mediante la formación de
un derivado adecuado. La difusión amplia y aplicación del método se basa en
que permite una identificación y cuantificación rápida, simple y sensible de un
grupo numeroso de compuestos de interés científico, económico o ambiental, a
un costo moderado.
Todo tipo de cromatografía hace uso de dos fases, una de las cuales es
estacionaria y la otra móvil. El soluto, llevado por la fase móvil a través de la
fase estacionaria, interactúa con ésta y como resultado de esa acción recíproca
será retardado en su avance, resultando la separación cromatográfica, ya que en
general solutos diferentes no avanzarán con la misma velocidad. En el caso
específico de la cromatografía gaseosa, la fase móvil es un gas y la estacionaria
puede ser un sólido o un líquido que recubre a un sólido “inerte” de gran
superficie. La primera posibilidad da origen a la cromatografía gas – sólido y la
segunda a la cromatografía gas – líquido. Por su importancia y grado de
aplicación se dedicará los siguientes epígrafes a la cromatografía gas – líquido
(GLC, del inglés Gas Liquid Chromatography). Sin embargo, gran parte de los
conceptos y principios que se expondrán son aplicables a la cromatografía gas –
sólido.
11.2. DESCRIPCIÓN DEL PROCESO CROMATOGRÁFICO

De forma muy simplificada puede decirse que el proceso consiste en impulsar, a
una velocidad de flujo controlada, el gas portador a través de una tubería capilar
278
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11. Cromatografía de gases
hasta una cámara de inyección a altas temperaturas donde se introduce la

muestra que se desea analizar.
La muestra se introduce en ésta cámara por inyección a través de una
membrana perforable, valiéndose de una microjeringuilla. La temperatura de la
cámara y la capacidad calorífica de esta permiten un rápido paso a la fase de
vapor, tanto del solvente usado en disolver la muestra como de los componentes
sólidos de esta. Una vez en estado de vapor, la muestra es arrastrada por el gas
portador, introduciéndola y llevándola a través de la columna cromatográfica, la
cual se encuentra situada en un horno aislado térmicamente a temperatura entre
50ºC y 350ºC.
En la columna cromatográfica ocurre la separación de los componentes de la
muestra en función de las diferencias en afinidad de los analitos por la fase
estacionaria mientras son arrastrados por el gas portador.
A la salida de la columna se encuentra conectado el detector, el cual es un
dispositivo capaz de responder a las pequeñas variaciones en las propiedades
físicas del gas portador cuando se encuentra acompañado por el analito. En
general cada detector está diseñado para responder ante una variación específica
del gas portador, por ejemplo conductividad térmica, ionización, absorción
electrónica, etc. Estas variaciones darán origen a otros tantos tipos de
detectores.
La señal producida por el detector de naturaleza eléctrica o transformable en
ella, es amplificada mediante un accesorio adecuado llamado electrómetro, que
permite variar dentro de amplios márgenes la señal que envía al registrador
donde se origina el cromatograma correspondiente de señal contra tiempo de
retención. De forma análoga a la HPLC, la señal puede procesarse mediante un
software especializado con las ventajas inherentes que brindan las Tecnologías
de la Información y las Comunicaciones (TICs).
En la figura 11.1 se presenta un esquema correspondiente a un sistema de
cromatografía de gases como el que se ha descrito en los párrafos precedentes.
Figura 11.1. Esquema de un sistema de cromatografía de gases

11.3. EL CROMATÓGRAFO DE GASES

11.3.1. Los gases.
Los gases usados en la cromatografía a la cual han dado su nombre, están
contenidos normalmente en recipientes o balones de acero con capacidad real de
20 litros - 50 litros. La presión a la que pueden estar sometidos los gases en los
balones mencionados no debe sobrepasar de 200 kg/cm2. Cada balón requiere
de un manoreductor cuya función es la de entregar una presión constante y que
en la mayoría de los casos no es superior a los 5 kg/cm2. A través de tubos
adecuados, los gases llegan a los puntos de entrada del cromatógrafo, pasando
por filtros especiales antes de llegar a las válvulas que regulan con exactitud la
presión de estos. En todos los cromatógrafos hay dispuestos manómetros, con
ayuda de los cuales es posible fijar con exactitud la presión de trabajo de los
distintos gases. En algunos equipos hay rotámetros que permiten leer
directamente el flujo de gas que está entrando al cromatógrafo.
En la actualidad, con excepción de los gases nobles, los demás pueden generarse
en el Laboratorio, usando equipos que dan una entrega adecuada para el trabajo,
tanto de flujo como de presión. Además, la calidad es por lo general excelente.
Los gases cromatográficos son de dos tipos fundamentales: portadores y
auxiliares.
A. Gases portadores
Los gases portadores comúnmente usados son los siguientes: Nitrógenos, Argón,
Helio, Hidrógeno y CO2.
La elección del gas portador que debe usarse en un trabajo determinado
depende del tipo de detector que se vaya a usar. Así por lo general, para
trabajar con un detector de conductividad térmica se requieren gases con valor
alto de esta característica y la elección recaerá sobre el H 2 o He; para captura
electrónica se usan Nitrógeno o Argón impurificado y con los detectores de
ionización por llama se puede utilizar cualquiera de los gases arriba
mencionados.
Justamente el problema más difícil que se puede presentar tiene lugar cuando
para un detector dado sea posible usar más de un gas portador. En este caso la
elección del gas habrá que hacerla tomando como base requerimientos técnico-
económicos.
Si bien es cierto que hay una pérdida de eficiencia cuando se usa He en lugar de
Nitrógeno o Argón, es también cierto que la velocidad óptima del gas portador es
mayor en el primero respecto a los otros dos gases. Esto quiere decir que un
análisis se realiza en menos tiempo cuando se usa He como portador que cuando
se usa Nitrógeno o Argón, aunque con una pequeña pérdida de eficiencia.
En la práctica se trabaja dentro de un rango bastante amplio de velocidades sin
que esto menoscabe apreciablemente la eficiencia cromatográfica. La razón para
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ello es que el punto mínimo de la ecuación de Van Deemter se encuentra en una

región bastante llana, de modo que variaciones apreciables de u apenas influyen
sobre h , siendo esto tanto más acentuado cuanto mayor sea la densidad del gas
portador.
En lo referente a las razones económicas, el precio de los distintos gases es muy
variable y no se indicará cifras. Sólo es preciso señalar que el precio del He es
elevado respecto a los demás gases, con el agravante de que se consume mucho
más que de los otros. Es solo aconsejable su uso en conductividad térmica por
razones de seguridad, o en casos especiales de separación, cuando se requiera
un portador poco denso.
B. Gases auxiliares
Los gases auxiliares en cromatografía se usan para los sistemas de detección por
ionización y en el detector fotométrico de llama. Para ambos casos se requiere
Hidrógeno y aire. Estos gases, contenidos en recipientes como los descritos para
los portadores, se conducen hasta el sistema de detección, luego de reducir su
presión adecuadamente con los manoreductores apropiados. La presión de
entrada al detector (y en algunos equipos el flujo) se indica en manómetros y/o
rotámetros situados en el cromatógrafo.
Con relación al uso del Hidrógeno es preciso hacer algún comentario. En primer
lugar él o los balones de hidrógeno no se deben situar dentro de un área de
trabajo cerrada. De ser posible deben colocarse en lugares abiertos protegidos
del sol y la lluvia. Si la ubicación del balón de Hidrógeno no puede ser la
indicada, estando dentro del área del cromatógrafo, normalmente climatizada, es
preciso entonces comprobar diariamente la fuga posible, valiéndose de una
solución jabonosa. La hermeticidad del sistema neumático del cromatógrafo
(desde la fuente hasta la salida del detector) se comprueba desmontando este
último y sellando la salida al exterior con un eyector ciego. Se fija una presión de
entrada al cromatógrafo de 2 kg/cm2, cerrando de inmediato la válvula de acceso
del gas que se va a comprobar. En estas condiciones debe mantenerse la lectura
de la presión en el indicador correspondiente por lo menos durante 5 minutos.
Otra medida a observar es ventilar completamente el área de trabajo al
comenzar un nuevo día, antes de encender cualquier conmutador eléctrico
(incluso el de la luz). Con estas medidas se evitan riesgos de explosiones.
11.3.1.1. Especificaciones de los gases cromatográficos
Aunque para muchos fines analíticos y tecnológicos los gases mencionados,
producidos industrialmente, poseen un grado de pureza suficiente, en el caso de
la cromatografía se requiere que ellos satisfagan determinadas especificaciones,
que de no cumplirlas los harían inservibles. En la tabla 11.1 se resumen las
características de los gases para uso cromatográfico.

Tabla 11.1.
Gases usados en cromatografía
Gas Denominación Impurezas máximas Usos

H2 Purísimo O2 < 300 ppm Ionización por llama
H2O < 80 ppm
H2 Especial purificado < 5 ppm de O2 Conductividad térmica
< 5 ppm de CO2
Helio 99.995 Trazas de CO2, H2, CH4 y Ar Uso general como gas
portador
Argón 99.95 < 100 ppm de O2 Uso como portador
trazas de N2
Nitrógeno seco certificado < 2000 ppm de Ar Uso general como gas
< 10 ppm de H2O Portador
< 5 ppm de O2
Aire seco Ionización por llama
11.3.2. Prefiltros.
Las impurezas que normalmente acompañan a los gases portadores, las cuales
no pueden ser eliminadas en los procesos de obtención, afectan en mayor o
menor grado los resultados cromatográficos. En la mayoría de los casos, la
presencia de impurezas se refleja en inestabilidad de la línea de base y sobre
todo ruido de fondo. En el caso de detectores sensibles como el de captura
electrónica, tanto el agua como el oxígeno disminuyen gradualmente su
sensibilidad hasta reducirla a cero.
Cuando se trabaja a temperatura programada con isoterma inicial baja, la
columna capta impurezas, que luego se eluyen cuando se eleva la temperatura.
Los cromatogramas resultantes son difíciles de interpretar.
Hay sin embargo un efecto de las impurezas que no se observa a corto plazo, a
no ser que estén en concentraciones muy grandes. Ese efecto es el deterioro
gradual de la fase estacionaria, en especial cuando la impureza es oxígeno y se
trabaja a temperaturas altas.
Para evitar el efecto adverso de las impurezas, la mayoría de los equipos están
dotados de filtros purificadores de gases. Estos filtros, situados inmediatamente
a la entrada del cromatógrafo, están cargados COn tamices moleculares, los
cuales retienen agua, grasa, etc. Estos tamices moleculares deben reactivarse
periódicamente, de ser posible cada vez que se cambia un balón.
Los filtros purificadores son de tres tipos:
• De gel de sílice. Para eliminar la humedad. Por lo general tienen indicador que
permite saber cuándo es necesario cambiarlos.
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• De tamices moleculares. Estos retienen impurezas orgánicas incluidos

hidrocarburos provenientes de los compresores usados en la obtención de los
gases portadores.
• Trampas de oxígeno. Por lo general regenerables, que eliminan trazas de este
gas. Este tipo de filtro es indispensable cuando se trabaja con detectores de
captura electrónica.
11.3.3. Control de flujo. Manoreductor
Es preciso reducir la presión elevada del gas contenido en el balón antes de que
llegue al cromatógrafo. Para ello se hace uso de un manoreductor el cual
garantiza que la presión que entra al cromatógrafo no sea superior a 5 kg/cm².
Esto es importante ya que dentro del equipo se encuentran situados reguladores
de caudal e indicadores de presión que no soportan grandes presiones. En la
mayoría de los equipos los indicadores de presión a la entrada de la columna no
sobrepasan los 3 kg/cm². En otros, aparte de los indicadores de presión tienen
medidores de flujo (rotámetros) a la entrada de la columna. Los medidores de
flujo pueden también estar situados a la salida de la columna. Cuando se usa
generadores de Hidrógeno o Nitrógeno estos equipos entregan esos gases con
presiones en los rangos requeridos para el trabajo cromatográfico.
11.3.4. La cámara de inyección
Inmediatamente a continuación del indicador de presión (o caudal) del gas
portador, se encuentra situada la parte del cromatógrafo conocida como cámara
de inyección. Este es el lugar por donde se introduce las muestras. La figura 11.2
muestra un esquema de una cámara de inyección típica.
Figura 11.2. Cámara de inyección clásica

El gas portador, calentado antes de entrar a la cámara, arrastra consigo los

vapores de la muestra, la cual se introduce a través de la membrana perforable
de goma de silicona, haciéndolos entrar y avanzar a través de la columna
cromatográfica.
El diseño de la cámara de inyección permite que las muestras que se introducen
en ella, a través de la membrana o septum, se vaporicen rápida y totalmente. La
temperatura y capacidad calorífica de la cámara, facilitan el paso al estado de
vapor.
El material, la forma y el tamaño del portamembranas garantizan una radiación
considerable de calor, evitando el deterioro de la membrana perforable.
De la cámara de inyección depende en gran medida el resultado de análisis
cromatográfico e incluso si este se puede realizar o no.
Se recordará que solo se puede analizar por cromatografía gaseosa aquellos
compuestos que de por sí o mediante algún procedimiento físico, químico o
físico-químico, pasan al estado de vapor o adquieren una presión de vapor tal
bajo las condiciones de operación, que le permita avanzar a través de la
columna. El fenómeno que tiene lugar en la cámara de inyección es precisamente
de naturaleza física (vaporización). Los otros procedimientos (químicos, químico-
físicos) son realizados por el analista sobre una muestra dada para aumentar su
volatilidad. Se describirán más adelante.
La importancia de la cámara de inyección es enorme. Si la muestra que se
introduce en ella no se volatiliza de inmediato o lo hace incompletamente, la
masa de vapor llega a la columna en forma de una banda ancha con una
densidad baja de vapor. Si la temperatura es demasiado alta, la muestra pasa
muy rápidamente al estado de vapor, entrando a la columna en forma de banda
estrecha y concentrada. Sin embargo, se corre el riesgo que parte de la muestra
se pirrolice.
La muestra que se inyecta a una temperatura insuficiente presenta una banda de
vapor ancha, la cual, al entrar en la columna abarca más de un plato teórico. En
casos extremos no hay respuesta del detector o se presenta una ondulación
simple de la línea de base en la región correspondiente al tiempo de retención
del analito.
Cuando la temperatura es adecuada, la banda de vapor ocupa la altura
equivalente a un plato teórico.
En resumen cabe destacar lo siguiente:
• En el análisis por cromatografía de gases son críticos los pasos de: inyección
con una microjeringa, evaporación instantánea de las muestras líquidas en la
cámara del inyector, y el transporte a la columna
• La temperatura del inyector debe ser mayor que la de la columna, para
producir la volatilización inmediata de la muestra, después de su inyección.
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Hay que cuidar que no sea excesiva para evitar la descomposición o la

isomerización de sus constituyentes.
• Aunque la microjeringa usada permita medir volúmenes menores, si la
muestra se introduce a un inyector caliente, es imposible inyectar algún
volumen menor que el de capacidad interna de la aguja.
• En la mayoría de las muestras, el factor determinante del proceso de
evaporación es el solvente (no el soluto). Por ser el componente mayoritario y
en especial si posee capacidad calorífica grande, puede consumir el 99 % de
de la energía térmica.
Hay una diferencia notable entre la cámara de inyección y la forma en que se
introduce la muestra en el sistema cromatográfico cuando se usan columnas
empacadas, respecto al inyector y el procedimiento en el caso de las columnas
capilares.
A continuación se expondrán las principales características de estas cámaras en
función del tipo de columna empleada.
11.3.4.1. La cámara de inyección para columnas empacadas
Como regla general la temperatura de la cámara de inyección debe situarse
entre 10ºC y 20ºC por encima de la temperatura a la cual se opere la columna
cromatográfica. En el caso de cromatografiarse mezclas, debe siempre ajustarse
dicha temperatura por lo menos al valor correspondiente al punto de ebullición
del componente menos volátil.
Ocurre en la práctica que mejora el aspecto de un pico cuando en lugar de
cromatografiarlo a la temperatura de cámara indicada, se hace a una superior.
Esto puede ser un fenómeno transitorio ya que, con mucha frecuencia, una
temperatura superior a la recomendada produce pirrólisis y carbonización en la
cámara, lo cual provoca más tarde destrucción de las sustancias inyectadas o
adsorción.
Otro requerimiento importante de esta parte del cromatógrafo es que sus
dimensiones y formas sean tales que garanticen una buena mezcla vapor – gas
portador, con un tiempo mínimo de transporte hasta las primeras capas del
relleno de la columna, reduciendo con ello la difusión en la fase gaseosa. En
realidad el tiempo de transporte depende del volumen de la cámara de inyección
(llamado volumen muerto del inyector) y ya viene reducido a un mínimo por el
fabricante del equipo. Sin embargo se puede favorecer el transporte rápido hacia
la columna elevando ligeramente la temperatura del inyector.
Inyección en la columna
Un método muy difundido actualmente es la inyección en la columna. En el la
muestra se introduce mediante una microjeringuilla a unos pocos mm de
distancia del relleno de la columna. Prácticamente la volatilización, tanto del
soluto como del solvente, ocurre en las primeras capas del relleno. Con ello se

minimiza el volumen muerto. Con frecuencia se sitúa un taponcito de lana de

vidrio desactivada a la entrada de la columna, sobre el relleno. Este tiene la
doble función de favorecer la evaporación y el mezclado de la muestra con el gas
portador.
En el método de inyección en la columna se introduce la muestra con una
microjeringuilla de aguja larga de modo que esta llegue al relleno o más
frecuentemente, se sube el nivel de este en la columna (Ver Fig. 3.25) lo cual
presenta desventaja. Al estar la fase líquida del relleno en la zona del cuerpo del
inyector expuesta a una temperatura superior a la de la columna, esta se
volatiliza y se condensa más adelante, si no es que llega al detector provocando
ruido de fondo. Con el transcurso del tiempo, el relleno de la entrada de la
columna se queda sin fase líquida y presenta fenómenos de adsorción de
solutos. En la práctica esto tiene una solución sencilla. Se desconecta la columna
del cromatógrafo y se extrae el relleno de su entrada en una longitud de unos 10
cm – 15 cm, sustituyéndose por relleno nuevo de la misma composición.
Volumen de muestra a inyectar
Para cada equipo y tipo de muestra (gaseosa o en solución) hay un volumen de
inyección que no debe sobrepasarse ya que esto produciría aumento en los t' r
así como ensanchamiento de las bandas de los solutos.
Como regla general, en columnas de relleno se puede inyectar entre 0,5 – 10 L
de muestras en solución y de 1– 10 mL cuando las muestras son gaseosas,
mientras que las columnas capilares admiten volúmenes muchos menores. Para
líquidos no se debe sobrepasar de 1 L.
Errores de la inyección
Como en toda operación analítica, la inyección en cromatografía gaseosa está
afectada por dos tipos principales de errores: error de método y error de
manipulación. El error de manipulación está asociado a la falta de repetibilidad,
fundamentalmente del tiempo en que se realiza la inyección de la muestra. El
tiempo de inyección de la muestra influye sobre la altura del pico y su tiempo de
retención. Cuando los picos tienen un tr grande, las variaciones en el tiempo de
inyección carecen de importancia pero hay que ser muy cuidadoso en el caso de
picos con tr pequeños, especialmente en análisis cualitativo, ya que las
variaciones entre una inyección y otra pueden en muchos casos producir dudas
respecto a la identidad de un compuesto.
El error de método está asociado al volumen de la muestra a inyectar. En este
sentido, el error disminuye exponencialmente en la medida que se inyectan
volúmenes mayores de muestra hasta 5 L. Sin embargo, cuando la eficiencia de
la columna no sea limitante, es factible inyectar volúmenes mayores.
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Métodos de inyección
Muestras líquidas: El error resultante en la inyección de muestras líquidas
depende en parte del método que se siga. En trabajos donde no se requiera una
exactitud grande, puede aceptarse como el volumen inyectado el valor de enrase
de la microjeringuilla. Los volúmenes entregados son en realidad mucho mayores
a los nominales. Esto se debe a que parte del líquido contenido en la aguja es
expulsado por efecto del calor de la cámara. Con esta forma de proceder, el error
relativo disminuye con el volumen de la muestra inyectada.
Muestras gaseosas: Para introducir muestras gaseosas se usan jeringuillas
hipodérmicas convencionales o un tipo especial de jeringuilla fabricado con la
finalidad cromatográfica. Estas últimas son muchos mejores, ya que las fugas de
muestra son mínimas, a pesar de que como sabemos, la presión que se genera
en la cámara de inyección es grande.
Muestras sólidas: La introducción de muestras sólidas es mucho más compleja
que las líquidas o gaseosas. Se requiere normalmente cámaras con aditamentos
especiales que permitan la introducción de cápsulas pequeñas de vidrio o
Indium, las cuales contienen la muestra sólida. Las cápsulas de vidrio se
fragmentan mecánicamente, mientras que las de Indium se funden (a 156 ºC),
liberando la muestra en ambos casos.
11.3.4.2. El inyector y los métodos de inyección para columnas capilares
Dada las características de las columnas capilares y semicapilares (wide bore)
que serán explicadas en epígrafes próximos, tanto el inyector como los métodos
de inyección varían sustancialmente con respecto a la parte del cromatógrafo ya
explicada.
En efecto, las columnas capilares tienen un diámetro interno muy pequeño, lo
que limita al volumen de inyección a 1L o menos. Además, la cantidad de fase
estacionaria en la columna y más importante, el espesor de la película, es muy
pequeño. Esto necesariamente limita el tamaño de muestra a inyectar y el
volumen en que esta se disuelve. Es por eso que la inyección en cromatografía
capilar, es lo que más influye en la precisión de los resultados analíticos
obtenidos con esa técnica.
Se ha desarrollado varios modos de inyección con vistas a minimizar o evitar los
errores que se introducen durante esa operación cromatográfica. Entre ellos, los
más usados son: a) el método Split, b) el método Splittless, c) la inyección en
columna fría y d) la inyección mediante el dispositivo PTV (vaporizador con
temperatura programada), entre otros.
a) Inyección Split
En el modo de inyección split solo una fracción del volumen inyectado se
introduce en la columna cromatográfica, el resto se desvía hacia el exterior. El
analista predetermina que volumen desea que se introduzca en la columna

(acorde a sus condiciones cromatográficas especialmente las características de la

columna)
En los equipos modernos esto se controla automáticamente, a través del mando
electrónico del cromatógrafo, haciendo uso de un inyector modificado conocido
como splitter, cuya función es precisamente facilitar la división del caudal
inyectado.
Un esquema simplificado de un splitter se muestra en la figura 11.3.
Figura 11.3. Esquema simplificado de un inyector Split
Un volumen “normal” de muestras de V L se introduce en el inyector split. Dada

la relación previamente establecida por el analista (relación split), se logra la
entrada a la columna del volumen deseado de muestra. Así, sí la relación split es
por ejemplo 10/1, solamente el 10 % de la inyección entra a la columna
mientras que el 90 % se elimina o va al exterior.
Este método de inyección es muy usado en la actualidad y posee sin dudas
ventajas, entre ellas:
• Es simple de operar.
• Se inyecta con microjeringuilla convencional.
• Por lo general puede usarse cualquier solvente para disolver la muestra.
• Hay poca perturbación por ensanchamiento de las bandas cromatográficas,
debido a transferencia lenta del inyector a la columna.
Se le señala sin embargo dos desventajas fundamentales:
1. Poca repetibilidad de las inyecciones: La falta de repetibilidad (error de
inyección) se pone de manifiesto sobre todo cuando se trabaja con
programación de temperatura y la isoterma inicial está por debajo de la
temperatura de ebullición del solvente usado para disolver la muestra. Se
debe a que la relación split prefijada (relación del flujo de gas portador que
llega al inyector respecto al que entra a la columna) no siempre es igual a la
relación split verdadera (fracción de la muestra que llega a la columna).
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De hecho, en la práctica la relación split prefijada es menor que el valor split

verdadero, debido a que entra más muestra que la correspondiente. Por eso
no es posible calcular la cantidad de muestra inyectada basado simplemente
en la relación split. Tampoco se reproduce adecuadamente la inyección. Debe
señalarse que esta deficiencia puede resolverse usando un patrón interno.
Para garantizar una exactitud adicional en las determinaciones cuantitativas,
es preciso mantener constante la relación split y la temperatura de la
columna, así como disolver la muestra y el patrón (en caso de usar patrón
externo), en el mismo solvente
2. Efecto discriminante de solutos: Los solutos de pesos moleculares diferentes
tienen por lo general volatilidades distintas, por lo que no se comportan del
mismo modo cuando se inyectan juntos mediante el método split. En general,
en este dispositivo hay zonas más calientes que otras. En las zonas menos
calientes, incluida la punta de la jeringuilla, se produce una condensación
parcial de los analitos menos volátiles de una mezcla dada. Además y puesto
que el tránsito hacia la entrada de la columna es muy rápido, no se alcanza
una distribución homogénea de estos en el vapor que se produce en el
inyector. Por ello la proporción que entra a la columna es menor que la de los
analitos más volátiles, produciéndose el fenómeno llamado discriminación
b) Método de inyección Splitless
En este procedimiento de inyección la totalidad de la muestra que se introduce
en el inyector accede a la columna. Por esta razón el volumen máximo de
muestra a inyectar debe ser muy pequeño. Por lo general nunca excede a un 1
L y aún con volúmenes inferiores al indicado, se origina zonas de vapor
condensado en los primeros 20 cm-60 cm a la entrada de la columna, cuando se
trabaja con isotermas iniciales relativamente bajas (del orden del punto de
ebullición del solvente o por debajo de este)
Además de este inconveniente y para garantizar una exactitud satisfactoria, debe
inyectarse con microjeringuillas de 1 L, las cuales tienen tendencia a tupirse con
facilidad.
c) Inyección en columna fría
Esta es una variante del método de inyección splitless, pero con la característica
que no utiliza un cuerpo de inyector sofisticado. Además, en este caso, la punta
de la microjeringuilla se introduce directamente en la columna cromatográfica,
para lo cual se requiere expansionar esta ligeramente.
La temperatura de la columna debe encontrarse en el rango de 40ºC a 50ºC.
Después que se introduce la muestra, se retira la microjeringuilla y se
programa de inmediato la temperatura del horno (entre 30ºC/min a
40ºC/min), hasta alcanzar la temperatura de operación.
Con este método se puede inyectar de 1 µL a 1,5 µL de muestra, con
resultados satisfactorios en lo que respecta a exactitud y ausencia de
discriminación.
El método sin embargo tiene algunas características que es preciso tener en
cuenta a la hora de seleccionarlo:
• Se requiere expansionar la punta de la columna.
• Es preciso usar microjeringuillas con agujas muy finas. Esto tiene el
inconveniente que se inutilizan fácilmente (se tupen, se doblan)
• Con este método no es posible automatizar la inyección.
• Residuos no volátiles de la inyección tienden a acumularse en el extremo de
la columna por donde se introduce la aguja, con efectos nocivos (catalíticos,
de absorción) a largo plazo.
Se señala además que la reproducibilidad de los primeros picos no es buena,
debido a que la inyección en la columna fría produce una zona inundada con la
solución de la muestra inyectada, que puede llegar hasta 60 cm de longitud
(en dependencia del volumen inyectado). Esta masa liquida se mueve
rápidamente impulsada por el gas portador, se expande dentro de la columna
hasta alcanzar una monocapa, comenzando a pasar a la fase de vapor. En
resumen, la muestra entra a la columna cromatográfica para iniciar la
separación como una banda ancha, por lo que los picos resultantes serán
también anchos.
Este fenómeno es mayor en columnas de menos de 25 m. En columnas
mayores el efecto es menor pero se presenta siempre, especialmente cuando
la muestra se inyecta en solvente polar.
d) Inyección con programación de temperatura del vaporizador
Este modo de inyección utiliza un inyector clásico modificado ingeniosamente. La
muestra se introduce manual o automáticamente en una cámara, que se
encuentra a temperatura ambiental. Al inyectar la muestra en frío, no hay
perdidas ni discriminación. Después que se saca la aguja se programa la
vaporización hasta el valor máximo preestablecido, a partir del cual comienza el
programa de calentamiento del horno, la apertura de la válvula del inyector hacia
la columna y el enfriamiento posterior de la cámara de inyección.
Con adaptadores apropiados, este inyector admite columnas desde 0,22 mm
hasta 1,2 mm de diámetro externo.
11.3.5. La columna cromatográfica
La columna se encuentra acoplada a la salida de la cámara de vaporización por
un extremo y por el otro a la entrada del cuerpo del detector. El acoplamiento de
la columna depende del tipo de ésta y del fabricante del equipo.
Las columnas de vidrio se acoplan mediante tuercas. La hermeticidad del
acoplamiento lo garantizan sellos de teflón u otro elastómero termorresistente.
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En caso de operación a temperatura elevada, el sello usado es de grafito (límite

de operación hasta 500 ºC).
De la columna cromatográfica depende el éxito del análisis. Es la parte más
importante del cromatógrafo, de cuya eficiencia y características resulta si una
mezcla se puede separar o no, si un compuesto puede o no cromatografiarse. Se
expondrá en detalle a continuación los elementos que entran a formar parte del
término columna cromatográfica.
Las columnas cromatográficas para cromatografía de gases son tubos de longitud
y diámetros apropiados de vidrio, acero inoxidable, aleaciones metálicas, cobre,
plástico, etc. El material de construcción se selecciona de acuerdo a las
características de los problemas a resolver. Sin embargo, debido a sus escasas
propiedades catalíticas, el vidrio es el material que más se ha usado en la
construcción de columnas, desde las simples en forma de U hasta las capilares,
las cuales alcanzan en algunos casos más de 100 m de largo. Con el avance de la
tecnología, se fabrican hoy columnas de sílice que compiten favorablemente con
las de vidrio.
Atendiendo a su función, las columnas pueden clasificarse en analíticas y
preparativas. La finalidad de las primeras es la separación de un compuesto de
otros para identificarlo y cuantificarlo, mientras que las columnas preparativas se
utilizan en la obtención de fracciones puras.
Ahora bien, si la clasificación se basa en la forma en que está dispuesta la fase
estacionaria en las columnas, éstas pueden ser: columnas de relleno o
empacadas, si la fase estacionaria recubre a un soporte inerte, más o menos
regular, el cual llena totalmente el interior de la columna y columnas capilares,
cuando las paredes interiores de un tubo muy fino sirven de soporte a la fase
estacionaria (figura 11.4).
11.3.5.1. Columnas empacadas
Las columnas de relleno o empacadas son aquellas en las que la fase
estacionaria recubre a un soporte inerte, más o menos regular, el cual llena
totalmente el interior de la columna
Las dimensiones de una columna empacada se escogen de acuerdo a las
características del problema analítico a resolver. Por lo general cuanto mayor es
la longitud de una columna, mejor será su poder separativo. El límite práctico de
longitud está determinado por la caída de presión del gas portador dentro de la
columna. El diámetro interno es también importante pues un aumento del
diámetro interno se traduce en picos anchos. Las columnas de pequeño diámetro
interno además de su eficiencia, son muy buenas en trabajos de programación
de temperatura, puesto que se establece muy rápidamente el equilibrio térmico
entre el horno y el relleno cromatográfico.

Las columnas de relleno tienen por lo general una longitud entre 0.3 y 10 metros
y diámetros internos entre 2 y 6 mm. Debido a la gran longitud de algunas
columnas es preciso enrollarlas.
Figura 11.4. Columnas para cromatografía de gases
11.3.5.1.1. El soporte de relleno de la columna

Las columnas se rellenan con un sólido o soporte granular más o menos
inerte, recubierto de una fase estacionaria líquida a la temperatura de
operación del cromatógrafo. La fase estacionaria es la que le confiere a la
columna sus características separativas.
Sirve como soporte cualquier material granular inerte, con una superficie
especifica menor de 10 m2/g, de modo que la película liquida que lo recubra
ofrezca un buen contacto con el analito (o sea, un rápido intercambio líquido-
gas). Debe ser además duro y termoestable, con una porosidad tal que favorezca
el paso del gas portador. En realidad son pocos los materiales, por no decir nin-
guno, que satisfacen estos requisitos. Se fabrican sin embargo productos cuyas
características permiten su uso como soporte.
Los soportes de gran uso en cromatografía gaseosa pueden ser clasificados en
dos grandes grupos; Diatomáceos y No Diatomáceos. Los Soportes Diatomáceos
usan para su fabricación la diatomita, también llamada tierra de infusorios o
Kieselguhr. Este material está formado por los esqueletos fósiles de algas
unicelulares, las diatomeas, las cuales se han acumulado en grandes cantidades
en los mares y lagos de algunas regiones del mundo. La característica
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sobresaliente de estas algas fósiles es la de tener un esqueleto poroso. El

diámetro medio de los poros es del orden de 1 micrómetro poco más o menos.
Los soportes no diatomáceos han encontrado algún uso por sus características
particulares y están llamados a ocupar un lugar destacado dentro de la
cromatografía gaseosa. Entre ellos se encuentra: el teflón, las bolas de vidrio y
los polímeros orgánicos. El Teflón es un soporte muy inerte, especial para
cromatografiar agua, alcoholes, aminas, amoniaco, SH2 y SO2. La eficiencia de
las columnas rellenas con teflón es baja por la poca uniformidad del
recubrimiento de este soporte. Por encima de 290 ºC no puede usarse ya que
emite vapores tóxicos.
Las micro bolas de vidrio son muy uniformes en tamaño (ideales) pero presentan
desventajas grandes. En primer lugar su superficie es muy pequeña y por tanto
retienen poco la fase estacionaria; son sólidos no porosos y además la fase
liquida se acumula en los espacios libres dejados entre las bolas, con espesores
mucho mayores a los de la película que recubre a éstas.
Las microbolas poliméricas presentan buenas características. El tamaño es muy
uniforme, son porosas y algunas no requieren fase líquida.
En la tabla 11.2 se presenta algunos de los soportes de gran uso cromatográfico.
Tabla 11.2.
Soportes de uso cromatográfico
Soportes Diatomáceos Soportes no Diatomáceos

Característica Micro bolas Micro bolas
Blanco Rosado Teflón
de vidrio orgánicas
Actividad
Alta Despreciable Despreciable Despreciable
superficial Moderada
Uniformidad de
No No No Buena Buena
partículas
3-10
Ancho de poro 1 micrómetro - No -
micrómetros
Superficie
1 m2/g 4 m2/g - - -
específica
Reacción Básica Ácida No No -

Chromosorb W
Porapak
Ejemplo de Chromosorb G
Chromosorb P Kel-F - Chromosorb
soporte Gas Chrom Q
102
Celite 545

11.3.5.1.2. La fase estacionaria en las columnas empacadas

La fase estacionarla, líquida a la temperatura a la que se realiza el análisis
cromatográfico, tiene una importancia extraordinaria. Ella recubre un soporte
más o menos inerte, en forma de película fina y constituye la parte activa del
relleno. Entre ella y el gas portador se realiza el proceso de partición, base de la
cromatografía gas-líquido.
La importancia que ha adquirido reciente la cromatografía gaseosa se debe a que
se ha podido disponer de una fase estacionaria adecuada para cada problema
analítico particular. Actualmente son adquiribles comercialmente fases
estacionarias cuyas propiedades físico-químicas varían dentro de un rango muy
amplio: utilizables desde temperatura ambiente o por debajo de ésta, hasta
fases estacionarias cuyo máximo de operación supera los 500 ºC; desde escasa o
nula polaridad hasta polaridades elevadas, disponiéndose en algunos casos de
fases estacionarias químico-específicas para resolver problemas analíticos
particulares.
La fase estacionaria requiere tener una serie de características. Las
fundamentales son las siguientes:
• Debe ser selectiva a los componentes de la mezcla que se desea separar. Esto
quiere decir que sea capaz de disolver bien el (los) analito (s) para dar lugar
a la separación de bandas cromatográficas. Si la solubilidad de los analitos en
la fase estacionaria es pequeña, habrá mala resolución, excepto si los analitos
a separar difieren considerablemente en sus puntos de ebullición.
• La fase estacionaria debe ser líquida a la temperatura de operación, con
viscosidad baja y una tensión de vapor pequeña. Las pérdidas de fase
estacionaria por evaporación y arrastre deben ser moderadas, no debiendo
causar su presencia en el detector ruido de fondo que altere la sensibilidad
del método.
• Debe ser estable a la temperatura de operación y no reaccionar con los
analitos a separar.
• Debe mojar bien el soporte, formando una película uniforme, lo cual no
depende solamente de la fase líquida, sino también del soporte empleado. La
falta de uniformidad de la película de FE se presenta en soportes de
microbolas de vidrio y también en soportes con superficie rugosa. En los
soportes diatomáceos la fase estacionaria tiene un espesor mayor en sus
poros y canales.
El éxito de una separación por cromatografía gaseosa en columnas de relleno
depende de varios factores, entre los que pueden citarse como más importantes:
A. la temperatura de uso de la fase estacionaria, B. la polaridad de la fase
estacionaria, C. la interacción fase estacionaria – soluto, D. la presión de vapor
de los analitos y E. la relación fase estacionaria – soporte.
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A. Temperatura de uso de la fase estacionaria

Aunque en principio no se usa la fase estacionaria a una temperatura por debajo
de su punto de fusión, en la práctica, el simple hecho de que ésta sea líquida a
una temperatura dada no implica necesariamente que se pueda usar. Es preciso
considerar la viscosidad de la fase líquida, especialmente cuando el espesor de la
película sea grande, ya que puede afectarse considerablemente la eficiencia de la
columna. En la práctica es posible trabajar una fase estacionaria a una
temperatura para la cual su viscosidad sea de 1 poise o algo menor. En caso de
películas delgadas de fase líquida se admiten viscosidades mayores y para
películas gruesas todo lo contrario.
En relación con la temperatura máxima a la cual se trabaja una FE, esta debe
estar lo suficientemente alejada de su punto de ebullición de modo que su
tensión de vapor no influya en la respuesta del detector. El límite práctico
máximo de operación se encuentra entre 200 ºC y 250 ºC por debajo del punto
de ebullición de la FE.
En la práctica el analista se siente tentado de trabajar a temperaturas altas ya
que con ello se aumenta las solubilidades de los analitos en la FE, los picos
tienden a ser más estrechos puesto que la viscosidad es menor, los tr también
son menores (siempre que se mantenga constante el flujo de gas portador). Pero
contrarrestando esas ventajas hay desventajas a largo y a corto plazo.
Una desventaja a largo plazo la tenemos en la duración de la columna. Esta,
debido a la volatilización y arrastre de la FE, durará tanto menos cuanto más se
use cerca del límite máximo de temperatura de operación.
La principal desventaja a corto plazo, de operar a temperatura elevada la
tenemos en la presencia perturbadora de los vapores de FE en el detector y en
muchos casos el ruido disminuye la calidad y sensibilidad de detección.
B. Polaridad de la fase estacionaria
El conocimiento de la polaridad de las fases estacionarias disponibles
comercialmente es de mucha utilidad práctica. El analista puede hacer una
elección correcta de una FE ante un problema concreto a resolver, o sacar
conclusiones acertadas acerca de la polaridad de los componentes de una
muestra, si conoce las características de la muestra con que trabaja. En
ocasiones es suficiente, para hacerle frente a los problemas que se presentan a
diario, disponer de una escala cualitativa de polaridades de las fases
estacionarias. Por lo general esa escala toma valores de 0 a 5. A las fases no
polares se les asigna el valor 0 mientras que a las de máxima polaridad le
corresponde el 5.
C. Interacción fase estacionaria-soluto.
La interacción FE - analito depende de la naturaleza de ambos. Esta interacción
será mayor cuanto más similares sean las propiedades del analito y de la FE Así
por ejemplo, si un analito A difiere notablemente en propiedades físico-químicas
de una FE dada, su solubilidad en ésta será escasa. Este analito permanecerá

poco tiempo en la fase estacionaria (por la falta de afinidad hacia ella) por lo que
el vapor se eluirá rápidamente. Su tr será pequeño. Por el contrario, si otro
analito B tiene propiedades en común con la FE, entonces su solubilidad en esta
será considerable, su permanencia en la columna será grande (ya que el analito
solo avanza a través de la columna cuando se encuentra en la fase gaseosa) y
por tanto su tr será mucho mayor que el del analito A.
Se sabe que los analitos polares se cromatografían bien en FE polares, mientras
que los analitos apolares lo hacen bien en FE apolares.
Debido a la poca afinidad entre un analito polar y una FE apolar, su tiempo de
retención en ésta será menor que el de un analito apolar de igual punto de
ebullición. De modo análogo, un analito apolar tendrá un tr menor en una FE
polar que el de un analito polar de igual punto de ebullición.
Así mismo, los tr de distintos analitos polares de iguales puntos de ebullición
serán proporcionales a sus polaridades respectivas, esto es, mientras mayor sea
la polaridad de un analito, mayor será su tr en igualdad del resto de las
condiciones. Finalmente, el orden de elución de los analitos apolares en FE
apolar, está regido por sus puntos de ebullición; los más volátiles tienen menores
tr que los menos volátiles.
Estas reglas cualitativas nos sirven para elegir una FE si se conoce la polaridad
de los componentes de una muestra. Inversamente, conocida la polaridad
relativa de una FE, es posible sacar conclusiones cualitativas acerca de la
naturaleza de los componentes de una mezcla separada por cromatografía
gaseosa, determinados sus tr respectivos.
D. Presión de vapor de los analitos.
Consideremos ahora la influencia de la presión de vapor sobre el tr. Para dos
analitos A y B en equilibrio con una FE a una temperatura T de operación del
análisis (en la cual la FE es líquida y los analitos A y B estarán disueltos en ella),
para una misma fracción molar el compuesto que exhiba una presión de vapor
mayor tendrá una proporción mayor de sus moléculas en la fase gaseosa y
consecuentemente su tr será menor que el correspondiente al compuesto que
tenga una menor presión de vapor.
E. Relación fase estacionaria - soporte
La influencia sobre el tr, el tamaño de la muestra, la eficiencia y la vida útil de la
columna están determinadas por la proporción de FE que recubre el soporte.
Después de la naturaleza de la FE, es la proporción de ésta en el relleno la que
decide la eficiencia y durabilidad de una columna. A medida que va siendo mayor
la cantidad de FE que recubre un cierto soporte, será mayor el espesor de la
película que recubra las partículas de éste. El aumento del espesor de la película
va acompañado de un aumento del tiempo de retención de los analitos, en
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igualdad del resto de los parámetros, lo que puede conducir a una disminución
de la eficiencia de la columna (crece h).
11.3.5.1.3. Vida útil de la columna. Envejecimiento
La vida útil de una columna es muy variable, desde algunos días hasta un año o
más. Una columna durará más mientras se trabaje a una temperatura lo más
alejada posible del máximo señalado para la FE en cuestión. De esta forma tanto
la volatilización como la descomposición de la FE serán mínimas, obteniéndose
resultados satisfactorios durante un periodo largo de tiempo. Todo lo contrario
ocurre cuando se trabaja muy cerca o por encima del valor máximo de la
temperatura de operación de la FE.
Otros factores que también influyen en la vida de la columna son:
• Calentar la columna sin antes haber desalojado el aire del sistema mediante
el gas portador (sobre todo cuando se cambia o instala columnas nuevas).
• Trabajar con gases portadores puros. Si los gases portadores contienen
impurezas (por ejemplo oxígeno) por encima de las indicadas la vida de la
columna se reduce considerablemente. En algunos casos pierde su efectividad
en unas pocas horas.
El proceso de pérdida gradual de la eficiencia de una columna cromatográfica se
conoce como envejecimiento. En condiciones normales es causado por la
volatilización de la FE y por fenómenos de cristalización de esta entre los
períodos de utilización y almacenaje.
11.3.5.2. Columnas capilares
El uso amplio que han tenido las columnas capilares desde su introducción en la
cromatografía gaseosa hasta nuestros días y las perspectivas que se vislumbran,
se debe sin duda a los resultados sobresalientes alcanzables con éstas,
especialmente en resolución y reproducibilidad. Esto se ha puesto aun más de
manifiesto con el uso de la sílice fundida como material de partida para la
fabricación de columnas, aprovechando de forma acertada la tecnología de
fabricación de las fibras ópticas. Esto ha permitido a la cromatografía gaseosa
capilar, conocida también por sus siglas HRGC (Cromatografía Gaseosa de Alta
Resolución), estar vigente hasta nuestros días a pesar del auge y la pujanza de
la HPLC.
11.3.5.2.1. Aspectos generales de las columnas capilares
Las columnas capilares son aquellas formadas por un capilar de diámetro interno
muy pequeño, en cuyas paredes interiores está dispuesta la fase estacionaria
El material constitutivo de las columnas capilares fue en sus comienzos el vidrio,
tanto el llamado vidrio soda (blando) como el vidrio duro Tipo Pyrex ó Durán. En
la actualidad sin embargo, la mayoría de las columnas se fabrican
industrialmente usando sílice purísima como material de partida. No obstante
debido a las características del material de partida y del producto final, las

columnas de vidrio encuentran aún uso analítico. Así, como se tratará más
adelante, las columnas de vidrio requieren un tratamiento físico y químico muy
complejo de su pared interior. Ello permite usar un número muy grande de fases
estacionarias para su recubrimiento y en dependencia de su naturaleza, es
posible trabajar con ellas a temperaturas por encima de los 400 ºC, lo cual está
vedado para las columnas de sílice fundida, que tienen como temperatura límite
300 ºC (debido a que el recubrimiento exterior de poliimida, usado para
aumentar su flexibilidad, se descompone alrededor de esa temperatura). A
diferencia de las columnas de vidrio, las de sílice fundida requieren poco
tratamiento de su pared interior, además de que el número de fases
estacionarias usables con ellas es limitado.
Las columnas capilares pueden tener una longitud hasta 10 veces mayor que las
columnas empacadas (10 – 100 m) y un diámetro interno mucho menor (0.1 –
0.75 mm), lo que unido a la ausencia de relleno, las hace mucho más eficientes.
Las figuras 11.5. y 11.6. Muestran el efecto de la longitud y el diámetro de la
columna sobre la resolución del cromatograma.
Figura 11.5. Efecto de la longitud de la columna sobre la resolución.
Figura 11.6. Efecto del diámetro interno de la columna sobre la resolución.
El espesor de la pared de las columnas de sílice es diez veces menor al de las

columnas de vidrio, y es del orden de 25 micrómetros. Por esto y por la dureza
de la sílice, es que estas columnas son tan frágiles y requieren del recubrimiento
protector de la poliimida.
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El espesor de fase estacionaria tanto de las columnas de vidrio como las de sílice
fundida se prepara en el rango de 0,02 a 8 m.
Acorde a la naturaleza de la superficie interna del capilar, las columnas pueden
ser activas y no activas (inertes). Las primeras son selectivas, resisten la
contaminación y tienen una vida útil larga, pero son operables solo por debajo de
250 ºC. Las columnas inertes no son selectivas, son muy sensibles a la
contaminación (mientras más inertes, más fácil se contaminan), pero son
operables a temperaturas altas (hasta 400 ºC). Su vida útil es corta y depende
de la pureza de los extractos que se inyectan.
Las impurezas de peso molecular alto, generalmente poco volátiles, se retienen
tanto en las columnas activas como en las inertes. En las primeras, estas
impurezas se neutralizan y prevalecen las características de la fase estacionaria,
mientras que en las columnas inertes van cambiando paulatinamente la
naturaleza del recubrimiento, especialmente cuando este es apolar.
11.3.5.2.2. La fase estacionaria en las columnas capilares
En función de la manera en que esté dispuesta la fase estacionaria en la pared
interior de la columna, estas se clasifican en tres tipos:
• Columna capilar con soporte recubierto (SCOT, del inglés Support Cover
Open Tubular). La fase estacionaria está unida a un soporte y este último se
encuentra recubriendo la pared interior de la columna.
• Columna capilar de pared recubierta (WCOT, del inglés Wall Cover Open
Tubular). La fase estacionaria está directamente adherida a la pared interior
de la columna cromatográfica.
• Columna capilar de sílice fundida (FSOT, del inglés Fusion Silice Open
Tubular). En este caso la fase estacionaria está inmovilizada o químicamente
enlazada a la pared interior del capilar.
En los dos primeros casos de columnas capilares, la fase estacionaria está
depositada físicamente como una película fina en el interior del capilar, por lo
que estas están sometidas a las mismas deficiencias que las columnas
empacadas: sangramiento, redistribución de la fase estacionaria y en ocasiones
hasta obstrucción del capilar.
En las columnas capilares de sílice fundida la inmovilización consiste en unir
químicamente entre sí algunas moléculas de la fase estacionaria o éstas con la
pared de la columna. En ocasiones tiene lugar los dos tipos de enlace.
Las ventajas de la inmovilización son varias:
• La fase estacionaria no se desplaza de su posición, aun en zonas cerca del
inyector donde está sometida a solventes o vapores concentrados de éstos,
por lo que la uniformidad del recubrimiento permanece constante durante
mucho tiempo.

• La columna puede ser lavada con solventes, lo cual contribuye a que esta
recobre su eficiencia después de un período prolongado de trabajo.
• La inmovilización es imprescindible en caso de recubrimientos con un espesor
de la película > 2 m.
En la tabla 11.3 Se relacionan las fases estacionarias más empleadas en
columnas capilares de sílice fundida.
Tabla 11.3.
Fases estacionarias para columnas de sílice fundida
Composición Polaridad Límite (en C) Aplicaciones
100 % goma de No polar -60 a 325 Fenoles, hidrocarburos,

dimetilpolisiloxano aminas, pesticidas, PCBs,
compuestos de azufre.
100 % fluido de No polar 0 a 280 Derivados de aminoácidos,

dimetilpolisiloxano aceites esenciales.
5 % fenil y 95 % No polar -60 a 325 Ácidos grasos, alcaloides,

dimetilpolisiloxano ésteres metílicos, drogas,
compuestos halogenados.
14 % cianopropil y Intermedia -20 a 280 Drogas, esteroides, pesticidas.

fenilpolisiloxano
50 % fenil y 50 % Intermedia 60 a 240 Drogas, esteroides, pesticidas,

metilpolisiloxano glicoles.
50 % cianopropil metil Intermedia 60 a 240 Ácidos grasos, ésteres

y 50 % fenil metílicos, acetatos de aditoles.
metilpolisiloxano
50 % trifluoropropil Intermedia 45 a 240 Aromáticos, compuestos

polisiloxano halogenados.
Polietilenglicol Polar 60 a 240 Ácidos, alcoholes, aldehídos,

modificado con TPA acrilatos, cetonas, nitrilos.
Polietilenglicol Polar 60 a 220 Ácidos, alcoholes, éteres,

aceites esenciales, glicoles,
solventes
En la tabla 11.4 Aparece una comparación de las principales características de las

columnas capilares y empacadas para cromatografía gaseosa.
Tabla 11.4.
Propiedades y características de las columnas analíticas para cromatografía de gases
FSOT WCOT SCOT Empacada

Longitud, m. 10-100 10-100 10-100 1-6
Diámetro interno, mm. 0.1-0.53 0.25-0.75 0.5 2-6
Eficiencia, platos/m. 2000-4000 1000-4000 600-1200 500-1000
40d78409-8f5a-44ad-af96-811f110af4ad
FSOT WCOT SCOT Empacada

Cantidad de muestra, ng. 10-75 10-1000 10-1000 10-106
Presión relativa. Baja Baja Baja Alta
Velocidad relativa. Rápida Rápida Rápida Lenta
Inactividad química. Excelente Muy buena Buena Mala
Flexible. Si No No No
FSOT: Columna capilar de sílice fundida, WCOT: Columna capilar de pared recubierta,
SCOT: Columna capilar con soporte recubierto
11.3.6. El horno
La columna cromatográfica se encuentra situada en un horno aislado
térmicamente. En la mayoría de los equipos la temperatura del horno puede
fijarse en cualquier valor entre 50ºC y 350ºC. Equipos especiales poseen
“hornos” operables por debajo de 0ºC y hasta 500ºC. Un accesorio, llamado
programador, permite variar la temperatura del horno en función del tiempo
dentro de los límites permisibles del equipo. La forma y velocidad con que la
temperatura del horno varía en función del tiempo son prefijadas de antemano
por el operador de acuerdo al problema analítico a resolver.
Cuando el análisis cromatográfico se realiza con el horno situado a una
temperatura fija, se dice que la operación es isotérmica. Si por el contrario la
temperatura varia siguiendo una cierta ley (mediante el programador) se dice
entonces que el análisis se realiza con programación de temperatura.
La temperatura que más afecta la separación cromatográfica es la del horno.
Consideremos que tanto la temperatura de la cámara de inyección como la del
detector son adecuadas para resolver un problema y analicemos solamente la del
horno. Cada compuesto tiene una temperatura con la cual se optimiza su paso a
través de la columna. Como es lógico, en una muestra con varios constituyentes
diferentes, habrá que elegir una temperatura con la cual se cromatografien bien
todos ellos. Esa temperatura se encuentra experimentalmente. Si se está
trabajando isotérmicamente a una temperatura dada y la resolución de algunos
picos es insuficiente, da muy buenos resultados disminuir esta. Con ello se logra
que se haga más marcadas las pequeñas diferencias de solubilidad hacia la fase
líquida que pudieran tener los constituyentes que eluyen muy próximos,
diferenciándose sus valores de K. Esto es suficiente para mejorar la resolución.
La figura 11.7 muestra el efecto de la temperatura sobre la separación
cromatográfica.

Figura 11.7. Efecto de la temperatura sobre la separación cromatográfica. Nótese que al

aumentar la temperatura disminuyen los tiempos de retención (tr) de los compuestos separados,
así como también el ensanchamiento de banda. En el ejemplo considerado es beneficioso
incrementar la temperatura por cuanto se pretende disminuir los tr, sin embargo, en el caso que se
obtengan cromatogramas con picos solapados a bajos tiempos de retención, convendría disminuir
la temperatura para mejorar la resolución.
Sin embargo, la cromatografía isoterma no permite de forma general una

adecuada separación, cuando los componentes tienen puntos de ebullición (p.e.)
muy distintos. A bajas temperaturas se separan bien las sustancias de p.e. bajo,
pero no las de p.e. alto, que permanecen en la fase estacionaria. Por el contrario,
a temperaturas elevadas los especímenes de mayor p.e. emergen separados,
pero las fracciones más volátiles pasan con demasiada rapidez, sin ser
diferenciados. Por otra parte, la ebullición hace que los componentes estén la
mayor parte del tiempo en fase de vapor y a temperaturas muy bajas las
muestras se difunden, disminuyendo el número de platos teóricos (N).
11.3.6.1. Cromatografía a temperatura programada
Este es el método más difundido a causa de las ventajas que ofrece, además de
ser fácilmente practicable por lo sencillo del equipamiento. A diferencia del
método isotérmico, en este caso ocurre un aumento gradual de la temperatura
de todo el horno. El aumento de la temperatura del horno en función del tiempo
está prefijado por el operador del equipo de acuerdo a experiencias previas sobre
el comportamiento de la mezcla compleja a resolver. Por esto a este método se
le llama cromatografía a temperatura programada.
Si por ejemplo al cromatografiar una mezcla con un rango amplio de puntos de
ebullición se usa el método isotérmico, se obtendría un cromatograma como el
que muestra la figura 11.8 En este por simplicidad sólo se ha representado dos
componentes de bajos, y dos de altos puntos de ebullición.
40d78409-8f5a-44ad-af96-811f110af4ad
Figura 11.8. Cromatograma isotérmico de una mezcla con diferencias grandes en los
puntos de ebullición de los componentes separados.
La misma mezcla puede cromatografiarse a la temperatura T hasta que haya

eluido el componente b y luego subir rápidamente la temperatura hasta un
nuevo valor de temperatura (Tf) manteniéndola en este hasta la terminación del
análisis. El efecto producido por la simple modificación de la temperatura original
se muestra en la figura 11.9 en donde, como en la figura 5 se ha incluido el
gráfico de T en función del tiempo.
Figura 11.9. Cambio en el valor de la temperatura de operación. S= señal del solvente
Un segundo modo de cromatografiar la mezcla es variando linealmente la

temperatura en función del tiempo como se representa en la figura 11.10.
Este tipo de programación tiene mucha importancia en análisis cualitativo debido
a que por ejemplo en una serie homóloga los tr de sus componentes son función
lineal del número de átomos de carbono de cada compuesto. Hay también una
relación cuantitativa entre los tiempos de retención y el número de átomos de
carbono de los componentes de una serie homóloga cuando esta se
cromatografía isotérmicamente, pero en este caso la dependencia es logarítmica.

Figura 11.10. Programación lineal de temperatura.
En los ejemplos ilustrados en las figuras 11.5 y 11.6 no se ha tenido en cuenta la

alteración de la línea de base que siempre tiene lugar cuando se modifica la
temperatura de operación. Así, debido al aumento de la temperatura hay una
volatilización sustancial de la fase estacionaria, siendo arrastradas sus moléculas
hasta el detector, la respuesta del cual provoca una desviación de la línea de
base conocida como deriva. La deriva es de consideración cuando se trabaja a
una temperatura superior al límite máximo recomendado para cada fase
estacionaria.
La programación escalonada de la temperatura se usa cuando los compuestos
están formando dos o más grupos, bastante separados entre sí. La programación
lineal se emplea cuando hay una distribución de los compuestos más o menos
regular en todo el cromatograma.
Debe señalarse que los programadores modernos permiten realizar programas
escalonados de rampas de temperatura con alta complejidad, siendo factible una
combinación de ambos tipos de programación. En la figura 11.11 se muestra un
programa complejo de rampas de temperatura.
La temperatura programada se emplea cuando los componentes tienen una
diferencia apreciable de los puntos de ebullición (> 100 grados) y presenta
ventajas apreciables debido a que reduce el tiempo de análisis, produce picos
más delgados y presenta mejor reproducibilidad cuantitativa, especialmente en
los últimos componentes que eluyen.
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Figura 11.11. Programa complejo de ciclo de programación o rampas de temperaturas. I1

representa una operación isotérmica inicial. L1 muestra un ascenso lineal de la temperatura, E
representa la etapa de enfriamiento. En la mayoría de los equipos puede prefijarse las
temperaturas y duraciones de I1, I2, I3, etc. Así como las velocidades de ascenso de la temperatura
en las etapas L1, L2, etc., dentro de rangos bastantes amplios.
11.3.7. El detector
Gracias al desarrollo de detectores cada vez más sensibles y selectivos ha sido
posible a la cromatografía gaseosa abarcar campos muy diversos del análisis
químico orgánico. Han sido numerosos los tipos distintos de detectores que se ha
ideado para “detectar” y medir las bandas de vapor que eluyen de la columna,
basados en algunas propiedades del gas portador que se altera por la presencia
en él de los vapores de la muestra.
Los detectores cromatográficos son los dispositivos encargados de señalar la
presencia y medir la concentración (o cantidad) de los solutos que eluyen de la
columna cromatográfica. Ellos pueden ser de dos tipos fundamentales: integrales
y diferenciales.
Los detectores integrales miden la cantidad de un componente eluido y la suman
a la totalidad de los valores previamente obtenidos de otros componentes de una
mezcla analizada.
Los detectores diferenciales miden la variación instantánea de alguna propiedad
física del gas portador que se altera por la presencia de un analito en él. Estos
detectores son los más usados en la actualidad.
Tanto los detectores diferenciales como los integrales pueden ser destructivos o
no destructivos. En los primeros la muestra se destruye (generalmente se
quema) en el momento de la medición, mientras que en los segundos ésta
abandona intacta el detector.
11.3.7.1. Características fundamentales de los detectores.
Un detector ideal debe responder igualmente ante cualquier analito bajo
cualquier condición de temperatura, flujo y presión. Algunos detectores poseen

una propiedad contraria a ésta, es decir, responden ante compuestos definidos

bajo condiciones controladas.
Los criterios de calidad generales que deben considerarse para todo detector
son: A. Estabilidad, B. Sensibilidad y límite de detección, C. Respuesta lineal, D.
Tiempo de respuesta y E. Volumen interno
A. Estabilidad
Teóricamente la respuesta del detector en ausencia de muestra, es decir, cuando
a través de él está pasando solamente el gas portador proveniente de la
columna, debe ser una línea recta horizontal. Debido a la presencia en dicho gas
portador de impurezas y trazas de fase estacionaria, así como a causa de
desequilibrio térmico, la línea de base puede presentar desviaciones instantáneas
(ruido), además de desviaciones de la horizontalidad (deriva), que ocurren a
mediano y largo plazo.
Tanto el ruido como la deriva son factores que dificultan la buena operación de
un detector. La deriva se corrige en la mayoría de los casos dándole un tiempo
suficiente de calentamiento al sistema de detección (incluido amplificador y
registro). Por manipulación del amplificador puede corregirse la deriva cuantas
veces sea necesario. Mayor importancia analítica tiene el ruido de fondo, ya que
este limita la cantidad mínima detectable de un analito.
Aunque producen deriva de la línea de base no se consideran como factores de
inestabilidad las variaciones de temperatura, presión y/o caudal no previstas.
Estos se consideran como defectos del equipo.
B. Sensibilidad y límite de detección
La sensibilidad es la característica que tiene un detector de responder ante
pequeñas cantidades de soluto. Si R es la respuesta ante una cantidad Q, se
define la sensibilidad S como:
R
S=
Q
En la cual R está expresada en mV y Q en ng (pueden usarse otras
unidades). La cantidad mínima detectable está relacionada con el ruido y la
sensibilidad. Consideremos el gráfico de la figura 11.12. La línea de trazos
horizontales es la línea de base teórica. El trazo continuo representa la línea de
base real (con deriva). Se considera ruido a la distancia máxima entre los
desplazamientos instantáneos del registro por encima y por debajo de la línea de
base.
Si se conoce la sensibilidad (S), entonces la cantidad mínima detectable es:
2R
Q min =
S
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o expresado de otra manera Qmin es la menor cantidad de un soluto que

produce una señal distinguible del ruido de fondo.
Figura 11.12. Ruido y deriva
C. Respuesta lineal
De todas las propiedades del detector esta es una de las más importantes ya que
está relacionada con la cuantificación de los solutos. Hay un rango de
concentraciones por encima y por debajo del cual la respuesta del detector no es
proporcional a la cantidad (o concentración) de la muestra inyectada.
Las causas de la no linealidad pueden ser de dos tipos: debidas a sobrecarga de
la columna y a la saturación del detector.
Cuando se sobrepasa la capacidad de carga de una columna, esto es, cuando la
cantidad de muestra es demasiado grande, se aprecia esto en el cromatograma,
ya que deja de ser lineal la relación tamaño de muestra-altura de pico, además,
el tiempo de retención se acorta respecto al valor del tr del mismo compuesto,
pero en el caso que no satura la columna; en este caso el pico tiene un frente
casi vertical, con una cola prolongada. Si por el contrario la columna admite
perfectamente la muestra inyectada pero esta cantidad es demasiado grande
para que el detector de una respuesta lineal, entonces, esto se refleja en el área
del pico, la cual deja de ser proporcional con el tamaño de la muestra
inyectada.
Aunque el dato del rango lineal es importantísimo en análisis cuantitativo, los
valores reportados en la literatura son solo indicativos ya que no dependen
solamente del detector. Pero más importante aún, dependen además del tipo de
detector, de sus características y estado de funcionamiento.
Por tales razones es imprescindible determinar el rango lineal de respuesta para
el detector en las condiciones en que se vaya a realizar el análisis. Para ello se
inyectan iguales volúmenes de soluciones del patrón analítico de la muestra que
se vaya a analizar, de concentraciones crecientes. Se grafica la concentración (o
cantidad) de muestra inyectada contra la altura y el área de pico,

determinándose a partir de qué valor de inyección deja de ser lineal la respuesta.
En la práctica se trabaja en la mitad del rango para tener un buen margen de
seguridad que incluye la eventual suciedad del detector.
D. El tiempo de respuesta
El tiempo de respuesta se define generalmente como el lapso de tiempo que
requiere un detector para reaccionar ante el 60 % del cambio brusco de la
concentración del analito en el gas portador.
En realidad el tiempo de respuesta no depende solo del detector sino del
conjunto llamado sistema de detección y registro (detector, amplificador y
registrador). El tiempo de respuesta es muy importante en trabajos complicados
de separación en donde es imprescindible que el sistema de detección sea capaz
de detectar y registrar los solutos eluidos muy próximos entre sí. En los buenos
detectores este tiempo de respuesta es de 1 segundo o menos. Cuando se
describa en particular los detectores, se hará referencia a esto de nuevo.
E. Volumen interno del detector
Es una característica del detector que depende de su diseño y construcción. El
volumen interno del detector ha de ser el menor posible, ya que éste afecta el
tiempo de respuesta, la sensibilidad, la resolución, la forma del pico y hasta el
tiempo de retención.
11.3.7.2. Descripción del principio y aplicaciones de algunos detectores
de gran uso
En lo que sigue se describirá los detectores más utilizados en la actualidad.
Algunos de estos tienen utilidad amplia y diversificada en analítica. Otros como el
termoiónico, debido a su alta selectividad, tienen contados campos de aplicación,
pero de extraordinaria importancia, como son los medicamentos y los
plaguicidas.
11.3.7.2.1. Detectores de conductividad térmica
Estos detectores, llamados también cátarometros o detectores de hilo caliente
(TCD, del inglés Thermical Conductivity Detector) han sido usados extensamente
hasta el surgimiento del detector de ionización por llama, el cual le ha restado
popularidad y aplicación. No obstante, aquel continúa en uso, especialmente
cuando no se requiere una sensibilidad grande y si una buena estabilidad. Estos
detectores son simples en su funcionamiento, estables y versátiles.
El principio en que se basa el detector de conductividad térmica es el siguiente:
el gas portador en estado puro tiene una conductividad térmica a una
temperatura determinada. Cuando con el gas portador llega vapor de un analito
al detector, la conductividad térmica de esta mezcla gaseosa es menor que la del
portador puro. Un filamento que se encuentre a una temperatura de equilibrio
cuando pasa gas portador solamente, se calentará al pasar la mezcla portador-
40d78409-8f5a-44ad-af96-811f110af4ad
muestra, ya que como se señaló, su conductividad es menor. Este aumento de la

temperatura del filamento se traduce en un incremento de su resistencia el cual
es proporcional a la concentración del vapor de la muestra.
Hay otros detectores de conductividad que no utilizan filamentos sino
termistores. Estos son semiconductores que operan a la inversa del filamento, ya
que al calentarse disminuyen su resistencia. También en este caso la disminución
de la resistencia es proporcional al tamaño de la muestra inyectada.
En la práctica es poco preciso y difícil medir la variación de la resistencia de un
solo filamento, razón por la cual en los detectores de este tipo se hace uso de
dos columnas cromatográficas iguales. Por una de estas pasa solamente gas
portador. Es la columna llamada de referencia. Por la otra circula el gas portador
con la muestra que eventualmente se inyecta. Ambas columnas se conectan al
mismo detector cuyos elementos sensibles están dispuestos en forma de puente
Wheatstone, como el representado en la figura 11.13, donde se incluye el
esquema de un detector de conductividad térmica. Mediante la resistencia
variable Rv se fija la temperatura de los filamentos (de medición y referencia) no
debiendo estar ésta por encima de 250 ºC. Operando el botón AZ que no es más
que otra resistencia variable, se equilibra el circuito. Con ello la aguja del
registrador cae en escala. Cuando junto con el gas portador entra un soluto en la
rama de medición, la conductividad de esta mezcla es menor como ya se indicó.
El filamento (o el termistor) se calienta y su resistencia sube (o baja)
produciéndose un desbalance en el puente, el cual se registra como un pico.
Figura 11.13. Detector de conductividad térmica (TCD)

La conductividad térmica de los gases portadores y los compuestos orgánicos en

general se muestran en la tabla 11.5.
Tabla 11.5. Conductividad térmica de los gases portadores y de los compuestos
orgánicos.
Gas portador Cal/cm.seg.grado x 105 a 100 ºC

Argón 5,2
CO2 5,3
N2 7,5
He 41,6
H2 53,4
Comp. Orgánicos < 7 (generalmente)
Los valores de conductividad térmica para la mayoría de los compuestos

orgánicos decrecen con el aumento del peso molecular de cada compuesto.
El tiempo de respuesta en estos detectores está relacionado con las
características constructivas, pudiendo variar desde 0,02 segundos hasta 10
segundos. En los detectores de filamento, el tiempo de respuesta depende
fundamentalmente de la colocación de estos dentro del detector. Algunos
filamentos están situados directamente en la corriente del gas portador y
entonces el tiempo de respuesta es mínimo, pero se presenta fenómenos de
ruido ya que están expuestos a las variaciones de presión y de flujo. En otros
casos los filamentos están situados en una ramificación de la columna, en este
caso el tiempo de respuesta es mayor pero la estabilidad del detector es muy
buena.
En el caso especial de los detectores que utilizan termistores, el tiempo de
respuesta es además inversamente proporcional al diámetro del elemento
sensible.
Por encima de 100 ºC se utilizan los detectores de hilo caliente, los cuales
aumentan la sensibilidad con la temperatura. Por debajo de 100 ºC son más
sensibles los detectores de termistores.
Los detectores de conductividad térmica tienen aplicación en la determinación
de cualquier tipo de compuestos cuando no se requiera una sensibilidad alta. No
ha podido ser sustituido por el detector de ionización por llama en la
determinación de gases permanentes.
El límite de detección es del orden del microgramo ( g) y el rango de respuesta
lineal es muy amplio (104-105).
11.3.7.2.2. Detector de ionización por llama
Este tipo de detector FID (del inglés Flame Ionization Detector) se desarrolló a
partir de 1958 alcanzando actualmente un amplio uso. Es mucho más sensible
que el de conductividad térmica, muy estable y versátil, aunque a diferencia del
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anterior mencionado, su influencia está influida por la estructura química de los

compuestos analizados.
El principio en que se basa este detector es muy simple. Una llama de Hidrógeno
produce una ionización de las moléculas gaseosas que la rodean. Si esta llama se
encuentra en un campo eléctrico fuerte, los iones migran de acuerdo a sus
cargas respectivas hacia los electrodos de carga opuesta, estableciéndose una
corriente, la cual es débil. Sin embargo, cuando un compuesto carbonado se
quema en esta llama, la formación de iones es grande, la corriente producida es
perfectamente medible y dentro de ciertos límites, proporcional a la cantidad de
compuesto que ha pasado por el detector.
Es interesante señalar que la respuesta de este detector es nula en ausencia de
oxígeno. Se ha podido establecer que la energía de ionización proviene de la
oxidación del carbono. Así por ejemplo, un compuesto en el cual el carbono se
encuentre parcial o totalmente oxidado, no será detectado por el detector de
ionización por llama. La detección se basa pues en un fenómeno físico-químico,
específicamente termoquímico. Por tal razón es lógico pensar que la respuesta de
este detector estará en parte condicionada por la estructura química de los
compuestos a analizar. De hecho así ocurre. Digamos por ejemplo que en dos
moléculas con igual número de átomos de carbono, la respuesta será mayor en
la más insaturada de ambas. En series homólogas distintas, en igualdad de
moles inyectados, la respuesta del detector será proporcional al número de
átomos de carbono de cada compuesto no unido directamente a oxígeno. La
respuesta también es menor en la medida en que hay sustituidos en la molécula
carbonos por heteroátomos.
El efecto de la estructura química sobre la sensibilidad del detector de ionización
por llama es relativamente pequeño. Mayor importancia tiene la temperatura de
la llama y el voltaje aplicado. La temperatura de la llama condiciona la formación
de iones, siempre que la cantidad de oxígeno presente no sea limitante. Pero en
realidad esto solo no produce un aumento de sensibilidad. Se requiere un voltaje
adecuado, de modo que la mayoría de los iones formados lleguen a los
electrodos colectores sin que ocurran fenómenos de recombinación iónica. En la
mayoría de los diseños de detectores de ionización por llama la colección de los
iones formados es máxima para un voltaje aplicado de 250–300 V. Este voltaje
aplicado es un parámetro constructivo del detector que no puede variarse, de
modo que si el analista necesita variar la sensibilidad de su detector, tendrá que
variar los flujos de los gases, especialmente el del Hidrógeno o recurrir al
amplificador electrométrico. La 11.14 muestra el esquema de un detector de
ionización por llama. El hidrógeno se mezcla con el gas portador poco antes de la
entrada al detector. El aire se hace llegar directamente al detector adquiriendo
un flujo laminar después de pasar a través de un difusor. De esta forma se evita
que la llama oscile, produciendo ruido de fondo.

Figura 11.14. Detector de ionización por llama (FID)
Este detector tiene un tiempo de respuesta muy pequeño, prácticamente

responde de inmediato ante los compuestos que se queman, razón por la cual es
aplicable aún en caso de separaciones difíciles. El ruido en condiciones normales
de operación es bajísimo. Su rango lineal es muy grande del orden de 105. Su
utilización no requiere de gases portadores muy puros. Además se puede usar
todos los gases portadores, incluso el Hidrógeno. Las muestras pueden
inyectarse en cualquier solvente que se queme, pero preferentemente en
alcoholes, cetonas y esteres de baja masa molecular. En algunos casos se ha
usado agua como solvente para inyectar la muestra, sin deterioro y/o merma de
la calidad de la respuesta.
Como se ha mencionado, su uso es general, aunque su respuesta es pobre para
compuestos carbonados con heteroátomos en su estructura, principalmente el
cloro. No responde ante compuestos tales como los gases nobles, CO 2, O2, CS2,
COS, SO2, NO, N2O, NO2, NH3, etc.
El límite de detección de este detector es de 10-8g pero en el trabajo cotidiano,
donde verdaderamente rinde frutos, es en la determinación de cantidades
mayores, del orden de los microgramos.
11.3.7.2.3. Detector de captura electrónica
El detector de captura electrónica (ECD, del inglés Electrón Capture Detector)) Es
un detector de ionización altamente sensible, aunque su selectividad es baja. Por
tal razón ha sido usado en campos muy diversos del análisis y de la química en
general. Es un arma muy útil en la determinación de trazas de compuestos con
afinidad electrónica, especialmente los organoclorados.
40d78409-8f5a-44ad-af96-811f110af4ad
El principio de operación de este detector es inverso al de los detectores de

ionización descritos. Una fuente “F” radiactiva (Ni63, Sr90 o Tritio, (figura 11.15)
emite electrones los cuales ionizan las moléculas del gas portador que atraviesa
la cámara. Las moléculas de gas portador se convierten en emisores secundarios,
produciéndose una corriente de electrones que es captada en el ánodo, el cual
está a un potencial positivo respecto a las paredes emisoras. Esta corriente
electrónica es llamada corriente de fondo y es del orden de 10-9 Amperes para la
mayoría de los detectores, aunque es un parámetro de diseño.
Figura 11.15. Detector de captura electrónica (ECD)
Debido a su poca masa, los electrones son rápidamente colectados por el ánodo,
mientras que se forma una zona de iones positivos de gas portador e impurezas
ionizadas, los cuales migran lentamente hacia las paredes radiactivas de la
fuente F. Bajo condiciones de equilibrio operacional, en el detector se forman dos
zonas como las representadas en la citada figura 11. Cuando un compuesto con
afinidad electrónica entra en la cámara de ionización, capta electrones y
entonces disminuye el valor de la corriente de fondo. Bajo ciertas condiciones el
valor de esta disminución es proporcional a la cantidad de soluto que pasa por la
cámara y a su afinidad electrónica.
Los iones negativos del compuesto también pueden colectarse en el ánodo pero
en realidad esto ocurre poco ya que los electrones se mueven mucho más
rápidamente. Además hay posibilidad de neutralización de las cargas en la zona
positiva. De hecho el detector de captura electrónica hace uso de esta
recombinación iónica de modo que el fenómeno de la detección sea lo más
posible de captura electrónica pura.

Una vez que ocurrió la recombinación iónica y que las moléculas de analito
abandonaron el detector, se restablece el equilibrio eléctrico, volviendo a tomar
la corriente de fondo su valor normal.
La tabla 11.6 muestra las afinidades electrónicas para un grupo de compuestos,
así como los valores esperados en caso que una molécula posea en su estructura
un número determinado de átomos de halógenos, grupos nitro, etc.
Tabla 11.6.
Compuestos o grupos con afinidad electrónica
Coeficiente de adsorción
Compuesto
electrónica
• Hidrocarburos alifáticos
• Hidrocarburos aromáticos
• Alcoholes < 0,1
• Aldehídos
• Cetonas
• Compuestos monoclorados
0,1 – 10
• Compuestos trifluorados
• Compuestos diclorados
10 – 100
• Compuestos monobromados
• Compuestos triclorados
• Compuestos dibromados
• Compuestos monoyodados
100 – 1000
• Compuestos mononitros
• Compuestos alquil-metales
• Compuestos tetraclorados
• Compuestos tribromados
• Compuestos diyodados 1000 - 10000
• Compuestos dinitros
Los valores de la tabla son un índice de la respuesta relativa de los compuestos

relacionados en ella. Sin embargo hay que tener muy en consideración, por
ejemplo, que un compuesto tetraclorado no necesariamente posee una
sensibilidad mayor que uno triclorado o diclorado. Esto es cierto solo en el caso
que lleguen al detector cantidades equivalentes de estos compuestos
(suponiendo que no se descompongan, adsorban o retengan de modo diferente
en su paso a través de la columna).
De inmediato se puede recomendar como solventes para captura electrónica
todos aquellos comprendidos en el primer grupo (con coeficiente de adsorción<
0,1). Es requisito que el solvente que se utilice esté lo más seco posible ya que el
agua produce una respuesta del detector que afecta la determinación que se
realiza.
40d78409-8f5a-44ad-af96-811f110af4ad
El rango lineal de este detector es muy pequeño del orden de 10 2-103. Depende
como es natural del compuesto específico.
La sensibilidad es grande. El límite de detección es del orden de los picogramos.
Sin embargo, en los trabajos ordinarios, el límite de detección está determinado
por el grado de purificación de los extractos a analizar, encontrándose entre las
décimas y las centésimas de nanogramo para los organoclorados.
11.3.7.2.4. Detector termoiónico
Este detector es una modificación del de ionización por llama. Fue introducido en
1964. Sufrió modificaciones y perfeccionamientos sucesivos hasta la fecha. Su
aplicación está limitada a un grupo de compuestos ya que este es altamente
selectivo. Debido a su elevada sensibilidad, ha sido utilizado en la determinación
de trazas de esteres fosfóricos y compuestos nitrogenados, de tanta importancia
en biomedicina, bioquímica y química de plaguicidas.
Las modificaciones y perfeccionamientos tecnológicos en el desarrollo del
detector termoiónico se adelantaron algo a los conocimientos teóricos que
explican su principio. No obstante se sabe que cuando se quema un compuesto
orgánico que tiene en su estructura átomos de P, N, S o halógeno, en presencia
de vapores de una sal de sodio, de potasio, rubidio o cesio se produce una
corriente iónica muy grande si se compara con la ionización que debía esperarse
en caso de un detector de llama normal.
La respuesta del detector termoiónico depende del heteroátomo presente y de su
cantidad. En igualdad del número de heteroátomos, la respuesta del DTI
(detector termoiónico) respecto a un compuesto orgánico carbonaceo puro
equimolar es 10 veces superior para compuestos con cloro o azufre; de 100 –
150 veces cuando el heteroátomo es nitrógeno y entre 1000 y 10000 veces
mayor cuando el compuesto tiene fósforo en su estructura. Expresando lo mismo
de otra forma. Supongamos que un éster fosfórico contiene solo P como
heteroátomo y el resto de su estructura son átomos de carbono. Cuando este
compuesto se analiza con un DTI produce, por ejemplo, una altura de pico de 5
cm para 1 ng de muestra. Un compuesto análogo, pero con N en lugar de P
requiere de 7 ng – 10 ng para dar una respuesta equivalente; si el heteroátomo
fuera Cl o S, entonces se requerirían unos 100 ng; unos 1000 ng de compuesto
puro serían necesarios como mínimo para dar un pico análogo al del compuesto
fosforado.
La figura 11.16 muestra un esquema del diseño de un detector termoiónico.
Respecto a la selectividad de la respuesta del DTI y el tipo de sal usado, los
resultados obtenidos han sido contradictorios. Se plantea por algunos autores
que la sensibilidad hacia compuestos nitrogenados aumenta cuando se usa sales
de rubidio, pero otros señalan las sales de Cesio como las mejores para los
organofosforados.

Figura 11.16. Detector termoiónico
Los detectores termoiónicos responden específicamente ante cada compuesto de

acuerdo a su composición química particular. Influye sobre todo el número de
átomos de P, N, S, Cl, etc., pero también la estructura del compuesto, aunque
está en menor grado. Por estas razones, al cuantificar una señal obtenida con un
DTI se requiere disponer del patrón analítico o del dato de respuesta relativa del
compuesto respecto a un patrón conocido.
Debido a la sensibilidad alta y selectividad de respuesta, los extractos para
analizar por DTI no requieren una purificación rigurosa. En la mayoría de los
casos se pueden analizar directamente sin previa purificación.
11.3.7.2.5. Detector fotométrico de llama
El detector fotométrico de llama (DFLL) puede ser usado en la determinación de
compuestos orgánicos de fósforo y la única vía práctica cuando se requiere
determinar compuestos organoazufrados. En efecto, el detector fotométrico, en
su modalidad de detección de fósforo (DFLL–P) es uno de los detectores de
cromatografía de gases más selectivos. Sin embargo, en su modalidad de azufre
(DFLL–S), es menos selectivo pues, cantidades grandes de compuestos
organofosforados pueden interferir en la determinación. También en esta
modalidad la respuesta es lineal solamente en escala semilogaritmica. No
obstante, este detector es muy útil en el análisis cualitativo por su selectividad
elevada, especialmente cuando se requiere confirmar la identidad de un analito
en base a la relación de las respuestas P/S.
La muestra llega al detector y se quema en una llama de Hidrógeno, en una
atmósfera rica en oxígeno. Cuando la muestra es un compuesto órgano fosforado
u organoazufrado genera una emisión óptica típica, al descomponerse en la llama
de Hidrógeno.
40d78409-8f5a-44ad-af96-811f110af4ad
Esa radiación se filtra a través de un filtro de interferencia de banda estrecha. Si

el filtro seleccionado tiene una transmitancia máxima a 526 nm, correspondiente
a la longitud de onda de emisión del producto HPO, permite la detección de
compuestos organofosforados, si el filtro permite el paso de radiación a 394 nm,
permite la detección de compuestos orgánicos de azufre. La luz filtrada a través
de cualquiera de los filtros de interferencia llega a un tubo fotomultiplicador, el
cual la convierte en una respuesta eléctrica.
La figura 11.17 muestra un esquema simplificado de un detector fotométrico de
llama.
Figura 11.17. Detector fotométrico de llama
En algunos equipos, el filtro de interferencia es intercambiable. El analista puede

sustituir el de fósforo por el de azufre con facilidad. Hay detectores que tienen
instalados los dos filtros. Cualquiera de ellos, acorde a la muestra que se analiza,
puede situarse, mediante una manipulación simple, en la posición para hacer la
medición.
La respuesta del detector fotométrico de llama en su modalidad de fósforo es de
104 a 105 veces mayor respecto a la respuesta al carbono. La selectividad de la
determinación de organofosforados en presencia de interferencias
organoazufradas es menor y depende considerablemente de la concentración del
contaminante, por lo que debe determinarse con patrones analíticos.
La selectividad, S/C varía considerablemente con la concentración del
organoazufrado. Para valores altos de estos compuestos, la relación de
respuestas S/C es grande (105 – 106), mientras que si la concentración de la
muestra es baja, esta relación es solo 104.

Algo análogo ocurre con la respuesta a compuestos de azufre en presencia de

organofosforados. En este caso la selectividad S/P está en el rango 10 1 – 104,
dependiendo de la concentración del organofosforado. En este caso también es
preciso determinar la concentración interferente y su influencia sobre la
respuesta requerida del detector.
La sensibilidad de este detector en los dos modos (P, S) es muy buena, aunque
el límite de detección para organofosforados es 3 o 4 veces más bajo que para
compuestos de azufre. Debido a la estabilidad alta y al ruido bajo de este
detector, se alcanza límites de detección muy bajos, del orden de 0,01 ng para
organofosforados y 0,04 ng – 0,05 ng para compuestos orgánicos de azufre.
El rango lineal de respuesta en la modalidad de fósforo es de 10 4. El rango
correspondiente para organoazufrados es menor. La respuesta en la modalidad S
no es lineal pero esto no es un inconveniente. Los equipos modernos linearizan
automáticamente la señal expresándola como la raíz cuadrada. Algunos analistas
prefieren trabajar con la señal no modificada y graficarla directamente en papel
semilog contra la masa de muestra inyectada, lo cual es más exacto.
11.3.7.2.6. Acoplamiento Cromatografía Gaseosa – Espectroscopia de
Masas (GC-MS).
El primer intento reportado de acople directo CG – MS fue llevado a cabo por
Gohlke en 1959 pero es preciso recordar que por entonces todavía no se habían
desarrollado las columnas capilares, por lo que los flujos de gas portador eran
grandes, y era preciso además usar splitters para introducir fracciones que
fueran compatibles con el MS. Ya en 1968, Scalan describió la utilidad del acople
CG Capilar – MS. La elevadísima resolución de la cromatografía gaseosa capilar
permitía la introducción de compuestos muy puros (muy resueltos), en
volúmenes gaseosos pequeños, compatibles con los sistemas de vacío de los MS
en uso por entonces. Este desarrollo fue asistido también desde épocas
tempranas, por el uso de las computadoras, que aunque no tenían las
posibilidades de las de hoy fueron decisivas para promover el desarrollo
alcanzado en el presente.
En la actualidad el desarrollo alcanzado en la electrónica, las computadoras y la
mecánica fina ha permitido la fabricación de cromatógrafos gaseosos acoplados a
espectrógrafos de masas muy compactos, pequeños y fáciles de operar.
En el epígrafe 9.3.6.7 del capítulo 9, se trató acerca de la importancia analítica
del acoplamiento HPLC–MS), y se dio una explicación del principio de
funcionamiento de un espectrómetro de masas.
En el acoplamiento GC-MS juega un papel importante la interfase que permite el
acople de la masa gaseosa a la salida de la columna capilar con la fuente iónica
del espectrómetro de masas.
Durante el paso a través de la interfase, el efluente de la columna cromatográfica
pierde presión (desde la atmosférica a la salida de la columna, hasta el valor de
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vacío requerido por la fuente de ionización del MS). En este proceso se eliminan
fundamentalmente las moléculas del gas portador (tienen una difusión mayor
debido a su masa molecular baja) y llegan a la fuente de ionización casi
exclusivamente las moléculas que corresponden a un tiempo de retención dado.
Por esto tiene mucha importancia la naturaleza del gas portador que se use.
Teóricamente con hidrógeno se obtiene los mejores resultados pues su difusión
es muy grande. Pero su uso siempre está asociado al riesgo de explosión en
ambientes cerrados. Por esta razón, el uso del Helio es la opción más razonable
ya que tiene una difusión mucho mayor que la del Nitrógeno.
Han sido desarrollados distintos tipos de interfase que cumplen más o menos con
los requisitos expuestos pero que no continúan en uso por el desarrollo de otras
más eficientes. Entre las primeras merecen mencionarse el separador de vidrio
poroso y el diafragma de goma de silicona.
Hasta el presente se ha utilizado el principio de la diferencia en difusión entre el
gas portador y la muestra. En este sentido, el efluente de la columna se hace
pasar por un orificio muy pequeño situado en una lámina metálica fina. Separado
de esta se encuentra una lámina igual con un orificio idéntico al primero y
alineado con este. En el trayecto entre ambos orificios, las moléculas del gas
portador difunden lateralmente. La difusión lateral es mínima en las moléculas de
la muestra y la mayoría de ellas continúan en línea recta y atraviesan el segundo
orificio. De esta forma se logra un enriquecimiento grande bajo condiciones
apropiadas de operación (indicadas por el fabricante). Este mismo principio se
aplica mucho actualmente en la interfase conocida como “jet separators”
construidos de vidrio.
Ingeniosa también es la interfase constituida por un tubo capilar de pared fina y
porosa, de Teflón el cual está rodeado por un “jacket” o cámara conectada a una
bomba de vacío. Las moléculas de gas portador son forzadas por el vacío a
atravesar las paredes del tubo capilar de Teflón mientras que las de la muestra
continúan su viaje hacia la fuente de ionización, pues sus diámetros moleculares,
son muy superiores a los poros del Teflón. Entre las ventajas del método se
señalan su alto rendimiento y robustez pero tiene la desventaja de distorsionar
las bandas cromatográficas y tener una temperatura de operación crítica. Con el
mismo principio se ha usado el acero y la plata microporosas.
De modo análogo al acoplamiento HPLC-MS, en un sistema GC-MS se registra un
cromatograma de corriente iónica total (TIC) contra el tiempo de retención.
Puede también registrarse la corriente de un ión característico de cada
componente de la muestra, contra el tiempo: este método se denomina SIM por
sus siglas anglosajonas (selective ion monitoring)
El rango lineal de respuesta del sistema CG – MS es grande, superior a 104,
mientras que el límite de detección depende del sistema que se use para captar
la información (TIC, SIM). Pero aun con la modalidad menos sensible, este

acoplamiento permite una detección en el orden de las decenas de pg para una

variedad grande de compuestos.
11.3.8. Amplificador
La señal producida por el detector de naturaleza eléctrica o transformable en
ella, es amplificada mediante un accesorio adecuado llamado electrómetro, que
permite variar dentro de amplios márgenes la señal que envía al registrador.
11.3.9. Registrador
Es un accesorio electromecánico que transforma el impulso eléctrico enviado por
el electrómetro y lo convierte en impulso mecánico. Éste impulso mecánico se
registra gráficamente originando el cromatograma. Como un complemento más
costoso puede usarse un integrador. Éste equipo, electrónico o electromecánico,
permite una cuantificación de la señal generada por el detector, ahorrando el
trabajo que el analista debe realizar y que más tarde se explicará. En la
actualidad, software especializados en computadoras de gran capacidad y
rapidez permiten la captación, almacenamiento y procesamiento de toda la
información que se origina en el detector. De esta forma el analista puede
realizar automáticamente todas las operaciones que se hacían manualmente (la
determinación de los tiempos de retención, el cálculo de las alturas y áreas de
todos los picos del cromatograma), pero además hacer superponer
cromatogramas correspondiente a análisis realizados en momentos y con
muestras diferentes, restar la contribución del blanco de reactivos y blanco de
muestras si fuera necesario entre otras operaciones.
La figura 11.18 muestra un cromatógrafo del año 2004 comercializado por la
firma alemana Agilent Technologies.
Figura 11.18. Cromatógrafo gaseoso de la firma Agilent Technologies, 2004
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11.4. TRATAMIENTO DE MUESTRAS EN CROMATOGRAFÍA DE GASES

Como ya se ha planteado la cromatografía de gases se aplica en la separación de
compuestos volátiles o volatilizables, es decir se pueden separar y analizar
sustancias gaseosas o en fase de vapor. Si las muestras se vaporizan dentro del
instrumento, es más apropiado hablar de cromatografía en fase de vapor.
De forma general, a mayor peso molecular mayor punto de ebullición. Solo el 20
% de los compuestos orgánicos poseen presiones de vapor elevadas y pesos
moleculares menores de 500 lo que los hace volátiles a las temperaturas de
operación del cromatógrafo de gases y permite su análisis. Por otra parte, debe
señalarse que muchas sustancias que en su forma monomérica tienen pesos
moleculares bajos, pueden a través de puentes de hidrógeno intermoleculares,
formar conglomerados de varias unidades, ya sea entre moléculas de la muestra,
o entre ellas y el solvente, convirtiéndose en especies no volátiles y difíciles de
analizar por cromatografía de gases.
Es por ello que en el análisis por cromatografía de gases es común someter la
muestra a reacciones químicas previas con vista a obtener derivados con
mejores propiedades cromatográficas. Las características generales del proceso
de derivatización serán abordadas a continuación.
11.4.1. Derivatización
El objetivo general de la derivatización es, como ya se mencionó, mejorar las
propiedades cromatográficas de los compuestos a separar por cromatografía de
gases. Las razones para acometer este proceso pueden resumirse en los
siguientes aspectos:
• En primer lugar la derivatización se realiza con vistas disminuir el punto de
ebullición de los compuestos a separar mediante la disociación de los puentes
de hidrógeno, es decir obtener derivados más volátiles que los compuestos
nativos u obtener derivados volátiles a partir de compuestos que en su estado
nativo no lo son.
• Disminuir la retención de los componentes de alta polaridad en la columna,
previniendo así el coleo. Esto puede lograrse disminuyendo la polaridad de los
analitos a separar o derivatizando los grupos silanol que se forman en la
superficie de la sílice de la columna, con hexametildisilazano y/o
clorotrimetilsilano.
• Mejorar la separación los componentes de la muestra, o propiciar la
resolución de mezclas de enantiómeros.
• En el proceso de derivatización los analitos adquieren nuevas propiedades
físicas y químicas, lo cual puede mejorar las propiedades de detección, ya sea
con la producción de la señal o con el incremento de la sensibilidad de un
detector determinado.

• Finalmente en la mayoría de las muestras los compuestos volátiles están

presentes en concentraciones muy bajas y formando parte de una mezcla
compleja. Todos aquellos compuestos que también están presentes en la
matriz, en una concentración similar o mayor, pueden de una u otra forma
interferir en la determinación. La conversión en sustancias derivadas con
diferente estructura química permite su diferenciación del resto de los
componentes de la matriz.
Las reacciones de derivatización más usadas en cromatografía de gases son las
de esterificación, alquilación, acilación, silanización y acetilación.
Al valorar la factibilidad de derivatizar muestras para cromatografía gaseosa
debe considerarse que:
• El tiempo para concluir una reacción depende de la presión, la reactividad de
los agentes empleados, la naturaleza de los disolventes, y la estructura de los
analitos que se quieren derivatizar.
• Es necesario conocer la pureza de los reactivos y disolventes, así como la
estabilidad y volatilidad de los derivados.
• Es muy importante extremar precauciones durante los tratamientos térmicos,
para disminuir o evitar pérdidas, especialmente si ya se obtuvo el derivado
volátil.
• Mientras mayor sea la manipulación de la muestra, menor exactitud y
precisión se tendrá en el análisis.
• Las sustancias de elevada polaridad, que tienen pares electrónicos no
compartidos, y poseen hidrógenos activos de O-H, N-H o S-H, forman puentes
de hidrógeno lo que dificulta no solo su vaporización sino también su
separación en la columna cromatográfica. En este caso, la opción para
suprimir estas asociaciones, es sustituir los hidrógenos activos por grupos
alquilo, acilo o silano. Con el fin de incrementar la rapidez y el rendimiento de
las reacciones es frecuente el uso de reactivos clorados, o mejor aún,
fluorados
• La derivatización de compuestos que poseen más de un tipo de hidrógeno
activo, como es el caso de los aminoácidos, puede implicar: la alquilación del
carboxilo y la acetilación del grupo amino.
• Debe tenerse presente que las posiciones bencílicas y alílicas pueden
experimentar rupturas térmicas. Si esto sucede, los picos del cromatograma
son artefactos que se deben a la pirólisis. Aunque es poco probable, si hay
presencia de oxígeno se puede producir combustión.
• Diversos compuestos como los fenoles, barbitúricos y esteroles, que en el
pasado se tenían que derivatizar para analizarlos usando columnas
empacadas, actualmente se determinan sin derivar empleando columnas
capilares
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• En el análisis de sustancias no volátiles, pero sí solubles, es mejor emplear

métodos de HPLC
Un resumen de los agentes derivatizadores más empleados en cromatografía
gaseosa se muestra en la tabla 11.7
Tabla 11.7.
Algunos reactivos derivatizadores y sus aplicaciones en cromatografía de gases.
Aminoácidos
Esteroides
Vitaminas
Alcoholes
Azúcares
Fenoles
Aminas
Ácidos
Reactivos derivatizadores
Anhídrido heptafluorobutírico X X X X X X
Anhídrido trifluoroacético X X X X
Bis(trimetilsilil)acetamida X X X X X X X X
Bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida X X X X X X X X
Trifluoruro de boro metanol X X
Clorotrimetilsilano X X X X X X X
Hexametildisilazano X X X X X X X
Triclorometilsilano X X
N-trimetilsililacetamida X X X X X X X X
11.4.2. Técnicas empleadas para la extracción de componentes volátiles.

Las sustancias volátiles responsables del aroma y sabor de los alimentos
generalmente están presentes en concentraciones trazas y en matrices
complejas como son los propios alimentos. Por tanto, la preparación de la
muestra y la preconcentración de los analitos se hacen necesarias para su
posterior análisis.
Muchas son las técnicas de aislamiento utilizadas para la extracción de
componentes volátiles en diferentes matrices, entre ellas pueden mencionarse:
la extracción directa con disolvente, destilación-extracción con disolvente
simultáneas, análisis del espacio de cabeza dinámico y la microextracción en fase
sólida (SPME, del inglés Solid Phase Micro Extraction).
La técnica de extracción directa con disolvente, como su nombre lo indica
consiste en extraer los analitos de interés con un disolvente adecuado y posterior
concentración de los mismos para su inyección en el cromatógrafo.
La técnica de destilación-extracción simultáneas (DES) se fundamenta en el
aislamiento de los compuestos mediante una destilación con vapor combinada
con una extracción simultánea en un aparato apropiado.

La técnica de análisis del espacio de cabeza dinámico no utiliza disolventes y

consiste en el arrastre con un gas inerte de purga y retención en una trampa con
adsorbente desde la cual se introduce en el cromatógrafo de gases.
Las técnicas que requieren el uso de disolventes, como la extracción líquido-
líquido y la destilación-extracción simultáneas son en ocasiones complicadas,
consumidoras de disolventes de alta pureza y de tiempo. El empleo de la técnica
del análisis del espacio de cabeza dinámico puede eliminar el uso de disolventes;
sin embargo, requiere para la desorción térmica de los volátiles retenidos en la
fase sólida que los inyectores de los cromatógrafos de gases sufran
modificaciones extensas o la adición de costosos módulos de desorción.
De ahí que en la actualidad esté tomando mucho auge la técnica de
microextracción en fase sólida, cuyas generalidades se describen a continuación.
11.4.2.1. Microextracción en fase sólida
La microextracción en fase sólida (SPME) para cromatografía de gases,
desarrollada por Pawlizyn en 1990, es una técnica de preparación de la muestra,
que presenta algunas diferencias respecto al procedimiento explicado en el
epígrafe 9.5.2 para el caso de HPLC.
En primer lugar SPME para el análisis de compuestos volátiles se realiza sin el
empleo de solventes, utilizando una fibra de cuarzo, colocada en la aguja de una
jeringa especial y en este caso cubierta con una fase estacionaria apropiada, (lo
que representa una segunda diferencia con respecto a HPLC, en el que la fase
estacionaria está contenida en el interior de un capilar). El analito (o analitos) en
la muestra es directamente extraído y concentrado en el recubrimiento de la
fibra para su posterior inyección en el cromatógrafo. La figura 11.19 muestra un
esquema de la jeringa con la fibra de vidrio recubierta de fase estacionaria.
Figura 11.19. Jeringa con la fibra de vidrio recubierta de fase estacionaria
En la SPME para compuestos volátiles, pueden emplearse dos técnicas para la

extracción de los analitos:
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1. Técnica de inmersión directa (DI-SPME), en la que la fibra es directamente

sumergida en la muestra líquida haciendo contacto con el disolvente.
2. Técnica de espacio de cabeza (HS-SPME), en la que la fibra es expuesta a la
fase vapor sobre la muestra sin hacer contacto con el disolvente. Esto se
logra colocando la fibra en el espacio de cabeza del recipiente que contiene la
muestra. La muestra se calienta y los compuestos volátiles se adsorben o
absorben a la fibra. Esta técnica prolonga la vida útil de la fibra porque la
misma no está en contacto directo con la muestra.
La eficiencia de la extracción con cada técnica depende de las propiedades de los
analitos y la matriz a analizar. En general, la DI-SPME es más sensitiva que la
HS-SPME para analitos predominantemente presentes en un líquido. Sin
embargo, la HS-SPME es adecuada para la extracción de analitos más volátiles
en la mayoría de las muestras gaseosas, líquidas y sólidas.
La figura 11.20 ilustra de forma simplificada el proceso de extracción de volátiles
mediante el análisis del espacio de cabeza por microextracción en fase sólida
(HS-SPME) y posterior desorción en un cromatógrafo de gases.
Figura 11.20. Proceso de extracción de volátiles mediante HS-SPME y posterior desorción

térmica
Este método trae consigo un ahorro de tiempo de preparación y costos por no

uso de disolventes, así como mejora los límites de detección. Esta técnica ha sido
utilizada en combinación con la cromatografía de gases (GC) y la cromatografía
de gases-espectrometría de masas (GC-MS) y exitosamente aplicada a una
amplia variedad de compuestos, particularmente para la extracción de
compuestos orgánicos volátiles y semivolátiles del medio ambiente, biológicos y
de los alimentos. La efectividad en la preconcentración del analito depende de
varios parámetros entre ellos tipo de fibra, modo de extracción (DI-HPME o HS-

HPME) y desorción de los analitos en la fibra, tiempo y temperatura de

extracción, presencia de sales, los cuales es necesario establecer previamente.
A. Tipo de fibra
De manera general se puede decir que distintos tipos de fases estacionarias son
empleadas para la extracción de los analitos. La afinidad de la fibra por un
analito depende del principio “lo símil disuelve a lo símil”. En general, los
compuestos volátiles requieren una capa de polímero gruesa y los semivolátiles
una capa más fina. Además las fibras recubiertas con capas gruesas requieren un
mayor tiempo parta lograr el equilibrio de extracción, pero aportan mayor
sensibilidad debido a la mayor masa del analito que puede ser extraído.
La fibra apolar de polidimetilsiloxano (PDMS) es preferida para la extracción de
sustancias no polares como lo son muchos compuestos volátiles del aroma; sin
embargo, puede también usarse para compuestos más polares, particularmente
después de optimizar las condiciones de operación.
La fibra más polar, poliacrilato (PA), es preferida para la extracción de analitos
muy polares, particularmente fenoles y alcoholes. Fibras con mezclas de fases
conteniendo copolímeros de divinilbenceno (DVB) o soporte de carbón activado
(CAR:Carboxen) incrementan la capacidad de retención debido al efecto potencial
de adsorción y distribución de la fase estacionaria. Las fibras de PDMS-DVB,
CAR-DVB y Carbowax (CW: polietilenglicol)-DVB pueden ser utilizadas para la
extracción de analitos polares y de bajo peso molecular. La tabla 11.8 relaciona
los distintos tipos de fibras, así como sus principales características.
Tabla 11.8. Características de las fibras de SPME disponibles (Supelco, 1999)
Grosor Temperatura
Fase estacionaria Polaridad
(µm) máxima (ºC)
100 280
Polidimetilsiloxano (PDMS) Apolar 30 280
70 340
Polidimetilsiloxano/divinilbenceno 65 270
Semipolar
(PDMS/DVB) 60 270
Poliacrilato (PA) Polar 85 320
75 320
Carboxen/polidimetilsiloxano (CAR/PDMS) Semipolar
85 320
65 265
Carbowax/divinilbenceno (CW/DVB) Polar
70 265
B. Temperatura y tiempo de extracción

El tiempo de extracción es principalmente determinado por la velocidad de
agitación y el coeficiente de partición del analito entre la fase de la fibra y la
muestra. La agitación magnética acelera la transferencia de los analitos de la
muestra al recubrimiento de la fibra. Aunque la SPME tiene una sensibilidad
máxima en el punto de equilibrio, no es necesario alcanzar el equilibrio para
mediciones exactas y precisas debido a la relación lineal existente entre la
40d78409-8f5a-44ad-af96-811f110af4ad
cantidad de analito adsorbida (o absorbida) por el recubrimiento de la fibra y la

concentración inicial en la muestra en condiciones de no-equilibrio. Es por ello
que por lo general se acostumbra a fijar un tiempo de pre-extracción (en
ocasiones mal llamado de equilibrio) para garantizar cierta estabilización de la
concentración de los analitos en la fase vapor, así como de la temperatura del
sistema.
Con el objetivo de incrementar la concentración de los analitos en la fase
gaseosa durante la HS-SPME, la muestra es generalmente calentada. Un
incremento de la temperatura de extracción causa un aumento de la velocidad de
extracción y simultáneamente una disminución de la constante de distribución.
Por tanto, debe ser utilizada una temperatura que conduzca a una sensibilidad y
velocidad de extracción satisfactorias.
El tiempo de exposición es muy significativo. Un mayor tiempo favorece la
ocupación de mayor cantidad de sitios en la fibra por las moléculas del analito,
pero un tiempo prolongado cuando todos los sitios están cubiertos no afecta la
eficiencia de la preconcentración y en ocasiones puede causar la desorción.
El tiempo y la temperatura de extracción son parámetros estrechamente
relacionados el uno con el otro y un incremento en la temperatura proporciona
un corto tiempo de exposición, lo cual contribuye a disminuir el tiempo de
determinación.
C. Efecto de la adición de sal
La eficiencia de la extracción es también mejorada mediante la adición de alguna
sal soluble en la muestra. El cloruro de sodio, bicarbonato de sodio, carbonato de
sodio y sulfato de amonio son las sales más usadas para este propósito. En
principio la sobresaturación de la muestra con sales es más efectiva para la
extracción de los analitos por la fibra debido al efecto salting-out. Se debe tener
en cuenta que este efecto depende de cada analito en particular y de la
concentración de la sal en la muestra.
D. Desorción de los analitos
La desorción térmica eficiente de los analitos en el inyector del cromatógrafo es
dependiente de la volatilidad del analito, grosor del recubrimiento de la fibra,
profundidad del inyector, temperatura del inyector y el tiempo de exposición.
Generalmente la temperatura de desorción óptima es aproximadamente igual al
punto de ebullición del analito menos volátil. El tiempo de desorción depende de
la temperatura del inyector y del flujo alrededor de la fibra. El control de este
tiempo es importante si se quieren lograr resultados con altos recobrados y
reproducibles.
11.5. Aplicaciones analíticas de la cromatografía de gases
Los procedimientos para realizar el análisis cualitativo y cuantitativo en
cromatografía de gases son análogos a los empleados en HPLC y que fueron

explicados con detalle en el capítulo correspondiente. La tabla 11.9 muestra un

resumen de los mismos.
Tabla 11.9.
Métodos de identificación y cuantificación empleados en HPLC y GC
Métodos de identificación Métodos de cuantificación

1. Comparación de los tiempos de retención 1. Patrón externo
2. Anchura en la altura media 2. Curva de calibración
3. Enriquecimiento de pico 3. Patrón interno
4. Acoplamiento con espectrometría de masas 4. Normalización interna
Sin embargo en el caso de la cromatografía gaseosa se emplean con cierta

frecuencia otros procedimientos de identificación los cuales se describen
brevemente a continuación.
11.5.1. Uso de columnas de diferente polaridad
Cuando un problema de identificación se hace difícil por los métodos indicados da
buenos resultados usar columnas de polaridades diferentes. Al variar la
naturaleza químico-física de la columna es lógico esperar una interacción patrón
FE diferente a la interacción muestra FE. Utilizando por lo menos dos columnas
de diferente polaridad, los resultados que se obtienen son seguros. Son muy
pocos los compuestos que se comportan igual bajo estas condiciones. El ensayo
se hace más riguroso aún si además se incluye el factor temperatura. Esto es, si
se trabaja con dos o más columnas a dos o más temperaturas diferentes.
11.5.2. Utilización de varios detectores
El uso de detectores selectivos facilita mucho la labor identificativa. Así por
ejemplo, si un compuesto se detecta satisfactoriamente usando un detector de
captura electrónica o uno termiónico, la identificación se facilita mucho ya que la
relación de las respuestas para la muestra en los dos detectores tiene que ser la
misma que la relación correspondiente del patrón. Si esto es así, se puede
afirmar con una buena probabilidad de certidumbre que la muestra y patrón son
el mismo compuesto.
Veamos un ejemplo: Un compuesto X se detecta por captura electrónica dando
un pico de 4 cm de altura. Se analiza a continuación con un detector
termoiónico, originando un pico de 10 cm de altura. El tr y el ancho del pico de
la muestra en la semialtura coinciden bastante bien con el del methyl parathion,
tanto en el detector de captura electrónica como en el termoiónico, obteniéndose
alturas de picos de 3 y 7.5 cm respectivamente. La relación de las alturas de la
muestra en los dos detectores es 10/4= 2.5 y la del patrón 7.5/3= 2.5. Con
estos resultados la identificación queda concluida. El método descrito aunque
sencillo y rápido tiene sus requisitos para poderlo aplicar. En efecto, se requiere
que tanto el patrón como la muestra estén en el rango lineal de respuesta de
ambos detectores, cosa que se puede determinar con facilidad haciendo algunas
diluciones e inyecciones de ambos en los dos detectores. El segundo requisito es
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también elemental, ha de inyectarse volúmenes iguales de muestra y patrón en

ambos detectores. También la muestra y el patrón han de disolverse en el mismo
solvente.
Otra posibilidad de usar dos detectores selectivos la tenemos cuando se presenta
un compuesto organofosforado con un grupo P=S, cuyas propiedades son muy
semejantes a las de un patrón organofosforado pero con grupo P=O. Si en este
caso se usa un detector fotométrico de llama con filtro de fósforo, se obtiene
respuestas para la muestra y el patrón, pero si el filtro usado es el de azufre, se
obtendrá una sola respuesta (la muestra) excluyendo de inmediato la supuesta
identidad.
11.5.3. Partición seguida de cromatografía gaseosa
Este método es muy útil y simple. Una cantidad de muestra y una cantidad
semejante de patrón analítico se particiona por separado en dos solventes A y B
poco miscibles entre sí. Se inyecta por separado volúmenes iguales del extracto
de A, de la muestra y del patrón. Se hace lo mismo con el extracto B. Finalmente
se calcula las constantes de reparto de la muestra y del patrón. La igualdad de
esta constante en el ensayo descrito confirma la identidad de la muestra. Es
requisito realizar el método expuesto de modo igual para la muestra y el patrón
respecto a volúmenes de A y B, tiempo de agitación (extracción) y temperatura.
11.5.4. Transesterificacion
Es un método muy usado cuando los compuestos se cromatografían en forma de
ésteres. Por lo general la esterificación en la mayoría de los métodos analíticos
utiliza como agente el diazometano (o un precursor de este) o el sulfato de
dimetilo. En ambos casos se origina el éster metílico del compuesto investigado,
En este caso la confirmación se realiza transesterificando el éster, por ejemplo
usando alcohol butílico. El procedimiento detallado es el siguiente. Teniendo en
cuenta la sensibilidad de detección del método, se transfiere una cantidad
suficiente de muestra a un tubo de ensayo de 25 ml. Se evapora el solvente y se
añade 0,5 ml de n-butanol, se agita y a continuación se añade 0,5 ml de ácido
sulfúrico concentrado, se tapa y calienta sobre baño de vapor durante 5 minutos
agitando ocasionalmente, se enfría y quita la tapa y se añade 15 ml de agua
agitando vigorosamente. Se añade 0,5 ml – 1,0 ml de isooctano (o n-Hexano).
Se agita y deja reposar varios minutos. Se inyecta 5 L del sobrenadante. El
método se realiza también con los patrones. El tr del nuevo éster debe ser mayor
e igual para muestra y patrón.
11.5.5. Desplazamiento de un pico por modificación química
Se ha desarrollado métodos específicos de confirmación de compuestos por
cromatografía gaseosa que implican una modificación química de estos, los que
ocasionan desaparición de un pico en algunos casos, mientras que en otros hay
modificación de los tr, debido a alteraciones químicas de los analitos.

Son pocos los compuestos para los cuales hay procedimientos de este tipo, sin
embargo debido a su elevada especificidad se le ha concedido cada vez mayor
importancia. Consideremos el ejemplo siguiente, el cual ayudará a apreciar la
importancia del método. Al analizar una muestra presentó dos picos cuyos tr y
anchura en la semialtura coincidieron con los de los isómeros  y  endosulfan.
Con vistas a confirmar la presencia del referido insecticida se transfiere a un
balón de 100 ml; 600 ng de  y 560 ng de  endosulfan. Se evapora el solvente
y se añade 10 ml de solución etanólica de KOH al 2 %. La mezcla se refluja 12
minutos. Al cabo de ese tiempo, se deja enfriar y se diluye con 100 ml de agua,
extrayéndose con 20 ml de n-Hexano. El n-Hexano se seca por sulfato de sodio
(cantidad mínima) y se concentra a sequedad diluyéndose a 1 ml con n-Hexano o
acetato de etilo. De esta solución se inyecta 5 L. En el nuevo cromatograma ha
desaparecido el  y el  endosulfan, pero se presenta un pico con un tr que es
aproximadamente la semisuma de los tr de los dos isómeros. El ensayo se
realiza con la muestra en idénticas condiciones. La desaparición de los picos
sospechosos de ser  y el  endosulfan y la aparición de un solo pico con tr
intermedio entre los anteriores, confirman la presencia en el extracto del
endosulfan.
1. Consulte los apéndices C-6, C-7, C-8 y C-10, en los que aparece un
resumen de la instrumentación empleada en cromatografía de gases,
así como de los procedimientos de identificación y cuantificación
utilizados en esta técnica, además de una comparación de las
principales características de cromatografía de gases y HPLC.
14.2. Problemas integradores.
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12 Cromatografía en capa delgada
La Cromatografía en Capa Delgada (CCD o TLC, del inglés Thin Layer

Chromatography), conjuntamente con la cromatografía en columna abierta, fue
una de las primeras técnicas cromatográficas empleadas en el laboratorio, no
solo por su simplicidad sino también por su bajo costo y posibilidades de
aplicación ilimitadas en la mayoría de los campos de la química analítica
moderna.
Sin embargo, hasta la década de los ‘90 el desarrollo de la instrumentación para
la aplicación de la cromatografía en capa delgada, se vio considerablemente
empobrecido, no correspondiendo su importancia con el diseño de nuevos y más
modernos instrumentos que fueran perfeccionando esta técnica y le permitiera
incrementar su especificidad y especialmente su exactitud desde el punto de
vista cuantitativo, siendo considerada por la mayoría de los analistas como un
método puramente cualitativo, sin grandes pretensiones en cuanto a la
cuantificación de los analitos a determinar.
Un factor que vino a contribuir grandemente a ello fue la aparición de los
métodos de cromatografía gas-líquido (GLC, del inglés Gas Liquid
Chromatography) y posteriormente la rápida evolución de la cromatografía
líquida de alta resolución (HPLC, del inglés High Performance Liquid
Chromatography) a partir de las experiencias y el desarrollo de la teoría de la
cromatografía en columna, a la que rápidamente la mayoría de los analistas se
aficionaron debido a la gran potencialidad que representaban, no solo desde el
punto de vista cualitativo y cuantitativo sino también por las posibilidades de
automatización y rapidez que poseían estas técnicas con respecto a la CCD.
Otra cuestión que también influenció fue el desarrollo de las técnicas acopladas
GLC-EM y GLC-IR para la cromatografía gaseosa y la aparición de los detectores
UV con arreglo de diodos para HPLC, lo que aumentó extraordinariamente la
capacidad de identificación de los eluatos, ya no solamente por sus
características de elución (Tr), sino también por sus características
espectroscópicas.
Mientras esto sucedía la CCD quedaba rezagada y aunque las técnicas
densitométricas ya se habían utilizado, las experiencias no eran muy
alentadoras, especialmente cuando para la visualización del analito era necesario
emplear reacciones coloreadas, debido a que el fondo de la placa interfería
considerablemente en este tipo de determinaciones, haciéndolas imprecisas,
razón por la cual esta técnica decayó considerablemente y solo se usaba en los
casos donde se usaba la determinación en la zona ultravioleta. Aun en este caso,
la calidad de las placas cromatográficas empleadas traía problemas, ya que al no
333
12. Cromatografía en capa delgada
ser completamente plana la superficie de sílicagel, la línea base del

Cromatograma era irregular y no se obtenían cuantificaciones adecuadas.
Es por eso que en comparación con los otros métodos ya mencionados, la CCD
se convirtió en una especie de “cenicienta” y se utilizaba en muchos casos solo
como un método auxiliar de comprobación de otros métodos analíticos.
Sin embargo, a partir de la década de los 80 y en especial a comienzos de los 90,
la CCD resurgió de nuevo con una gran fuerza, y actualmente está compitiendo
con las técnicas de cromatografía más avanzadas debido al gran desarrollo que
ha experimentado el diseño y comercialización de toda una gama de equipos
especializados que permiten realizar toda una serie de operaciones no
concebibles con anterioridad, incluidas las técnicas de cuantificación y de
acoplamiento como resultado del gran desarrollo alcanzado por la densitometría
de scanning, la cual al ser acoplada a las técnicas actuales de computación, ha
devenido en un poderoso instrumento para los propósitos anteriormente
mencionados. Hoy en día la CCD puede rivalizar con HPLC y GLC, en muchos
casos aun hasta en automatización.
Todo ello es también el resultado del desarrollo instrumental alcanzado en cada
una de las etapas involucradas en el proceso cromatográfico que caracterizan la
CCD. Así, la espectacular evolución de la CCD ha estado condicionada por el
desarrollo tecnológico introducido en las placas cromatográficas los sistemas de
aplicación de muestras, los tanques de desarrollo de las placas, los sistemas de
revelado de las muestras y hasta los sistemas de documentación los que en
algunos casos pueden competir con ventajas con HPLC y GLC.
12.1. GENERALIDADES
Como en el caso de cualquier tipo de cromatografía la separación de un
compuesto por cromatografía en capa delgada tiene lugar entre dos fases, una
de las cuales es móvil y la otra estacionaria. A diferencia de la cromatografía en
columna en CCD la fase estacionaria está dispuesta en forma de una película fina
sobre una superficie plana, mientras que la fase móvil asciende o desciende
según el caso a través de la capa material que constituye la fase estacionaria.
En CCD la fase móvil es siempre líquida y la fase estacionaria puede ser un sólido
con una alta superficie específica o un líquido retenido en la estructura de un
sólido más o menos inerte. Así, la CCD puede ser líquido-sólido o líquido-líquido.
De forma general el procedimiento de trabajo en CCD atraviesa las siguientes
etapas:
A. Preparación de la placa cromatográfica: El adsorbente se extiende sobre
una lámina plana (de vidrio o aluminio generalmente) en forma de película fina
formando antes una suspensión en agua u otro líquido apropiado. En general se
usa un aglutinante para favorecer la adhesión del adsorbente a la placa soporte
garantizando que la capa resultante tenga un espesor uniforme (figura 12.1).
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Una vez extendida la suspensión se deja evaporar el exceso de agua para lo cual
puede usarse un secado en estufa a temperaturas superiores a 100 ºC.
Figura 12.1. Disposición de la fase estacionaria en la placa
B. Aplicación de la muestra: La muestra o muestras a cromatografiar se

aplican a 1.5 cm de uno de los bordes de la placa, conjuntamente con soluciones
de patrones conocidos con vista su posterior identificación. La aplicación de las
soluciones de la muestra y los patrones se realiza utilizando micropipetas,
microjeringuillas o microcapilares, en la línea de origen, a la distancia del borde
ya señalado. Cada aplicación debe estar separada lateralmente a una distancia
suficiente de las aplicaciones contiguas para evitar que los componentes de la
muestra y los patrones se superpongan (figura 12.2).
Figura 12.2.Aplicación de la muestra y los patrones
Una vez aplicada la muestra y los patrones debe dejarse evaporar el solvente de
los puntos de aplicación lo cual puede realizarse con aire frío o con aire caliente
en dependencia de la labilidad de los componentes.
C. Desarrollo del cromatograma: Consiste en hacer pasar la fase móvil
(solvente de corrida) a través de la fase estacionaria. Para ello se coloca la placa
en una cámara cerrada que contiene el solvente (o sistema de solventes) que se
usará en el desarrollo del cromatograma. La profundidad del solvente no debe
ser superior a 1 cm de manera que nunca los puntos de aplicación se sumerjan

en la fase móvil para evitar su disolución en ella. Una vez colocada la placa
dentro de la cámara cromatográfica, el solvente asciende por capilaridad
arrastrando a los solutos que comenzarán a separarse en función de las
diferencias de afinidad por la fase móvil y la fase estacionaria. Aquellos más
afines a la fase móvil se moverán con mayor velocidad y recorrerán una mayor
distancia. La figura 12.3 muestra un esquema de una vista lateral de un
desarrollo ascendente como el que se ha explicado.
Figura 12.3. Desarrollo ascendente
La corrida cromatográfica se interrumpe cuando el frente del solvente haya

alcanzado una distancia de 10 a 15 cm desde la línea de aplicación. En este
instante se saca la placa de la cámara y se permite que el solvente se evapore,
pudiendo usarse una corriente de aire caliente para acelerar el secado.
D. Revelado: La detección de los compuestos separados se realiza mediante
métodos físicos o químicos que permitan visualizar la posición de los mismos en
la superficie de la capa. Los componentes separados aparecen inmovilizados en
la placa como manchas, tal y como se muestra en la figura 12.4.
La identificación se realiza de modo sencillo comparando las distancias de
recorrido de los componentes de la muestra con las distancias de recorrido de los
diferentes patrones aplicados. Es requisito de identidad entre un componente de
la muestra y un patrón dado que ambos tengan iguales distancias de recorrido
en la placa.
A continuación, se abordará con más detalle las características fundamentales de
cada una de las etapas del proceso de separación por CCD.
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Figura 12.4. Cromatograma revelado de una muestra de 5 componentes. Nótese que 4 de

ellos han podido ser identificados, correspondiéndose con los patrones P2, P3, P4 y P5. Véase
además que el componente de la muestra de mayor afinidad con la fase estacionaria (que mostró
el menor recorrido) no pudo ser identificado en esta corrida puesto que su distancia de recorrido no
coincide con la de ninguno de los patrones aplicados. Así mismo el patrón P1 no está presente en la
muestra.
12.2. NATURALEZA DEL PROCESO CROMATOGRÁFICO

En cromatografía en capa delgada se pueden poner de manifiesto los
mecanismos de separación por adsorción, reparto e intercambio iónico, en
función de la naturaleza de la fase estacionaria empleada. Los fundamentos de
estos mecanismos ya fueron explicados en el epígrafe 7.7 del capítulo 7, por lo
que no se abordarán nuevamente.
El proceso de separación en una placa cromatográfica, con independencia de la
fase estacionaria utilizada, ocurre de la siguiente manera:
Una vez que la placa se introduce en la cámara cromatográfica (tomemos como
ejemplo un desarrollo ascendente), el solvente o sistema de solventes transita
por la misma a causa de fuerzas capilares. Cuando esta fase móvil llega al lugar
de aplicación, los compuestos allí depositados son arrastrados con el solvente
hacia arriba; sin embargo, tan pronto como esto ocurre los analitos desplazados
se ponen en contacto con la fase estacionaria en otro punto de la placa situado
más arriba estableciéndose un equilibrio del soluto entre ambas fases este
proceso se repite de forma infinita en cada punto del recorrido de un compuesto
a través de la capa y aquí entran en acción las diferencias de las propiedades
físicas de los diferentes analitos, que a fin de cuentas dependen de su estructura.
Los que tienen mayor afinidad por la fase estacionaria serán retenidos por esta,
quedándose rezagados respecto a aquellos que tienen menor afinidad. Así, como
consecuencia de la interacción soluto-FE y soluto-FM cada soluto recorrerá una
distancia definida en la capa. Como en general las propiedades físico-químicas de
los distintos componentes de una mezcla no son las mismas, cada uno ocupará
una posición diferente en su recorrido a través de la capa. El resultado es la
resolución o separación de los componentes de la mezcla, cada uno de los cuales
aparece en la placa como una mancha más o menos redonda, simétrica, casi
siempre difusa hacia los bordes. Hay ocasiones en que estas manchas son
alargadas en forma de elipse, horizontal o verticalmente y en casos extremos
pueden presentarse prolongaciones, denominadas colas, las cuales son causadas
fundamentalmente por sobrecarga del compuesto aplicado.
12.3. PLACAS CROMATOGRÁFICAS

Los soportes más empleados en los que se encuentra extendida la capa delgada
con la fase estacionaria son el vidrio y el aluminio, aunque también se han
empleado láminas plásticas. Las dimensiones de estas placas son variables,
aunque las más comunes son de 20 x 20 cm, 20 x 10 cm y 20 x 5 cm. Se
emplean una u otras en dependencia del número de aplicaciones que se deseen
realizar.
Las fases estacionarias de mayor empleo son el gel de sílice o sílica gel
(activada), el óxido de aluminio, el polvo de celulosa y el Kieselguhr para
separaciones por adsorción, cuidando en todos los casos un bajo contenido de
humedad para que no ocurra el fenómeno de reparto. En el caso de la
cromatografía de partición, el gel de sílice no activado y la celulosa son las más
empleadas, en tanto para intercambio iónico se emplean resinas
intercambiadoras (aniónicas y catiónicas) similares a las utilizadas en
cromatografía en columna.
Aunque la placa de silicagel sigue siendo el caballo de batalla en la mayoría de
los laboratorios que aplican la CCD, ha habido una revolución en este sentido que
ha permitido no solo aumentar la resolución del cromatograma, sino que también
ha facilitado la aplicación de las muestras y ha aumentado la velocidad del
análisis, cuestión esta que era objeto de crítica por parte de muchos especialistas
en cromatografía.
Convencionalmente la disposición de la fase estacionaria sobre el soporte de
vidrio o aluminio se realizaba artesanalmente en el laboratorio empleando unos
dispositivos llamados tiradores y aunque esta técnica se empleó durante mucho
tiempo (y aun se emplea en algunos casos), el grosor y la distribución del
adsorbente no era todo lo uniforme que se hubiera deseado, por lo que en
muchos casos los cromatogramas obtenidos adolecían de poca reproducibilidad y
además de una pobre resolución.
El advenimiento de las placas precubiertas o las láminas de aluminio cubiertas
con el adsorbente, ha permitido no solo mejorar la resolución del cromatograma,
sino que también ha influido en la reproducibilidad de los resultados obtenidos.
Las placas precubiertas son placas de vidrio o aluminio producidas
industrialmente con un alto grado de uniformidad de la fase estacionaria, tanto
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en lo referente al grosor de la capa como al tamaño de partícula del material de

la misma y son desechables, es decir se utilizan solo una vez para una cierta
separación cromatográfica.
Con la aparición de la tecnología de la placa precubierta se hizo posible además
la comercialización de toda una serie de variedades que incluyen no solo los tipos
de cromatografía más convencionales como son las de reparto, adsorción e
intercambio iónico, sino también la modalidad de fase ligada. Hoy en día es
posible emplear placas de fase ligada (normal o reversa) empleando sistemas C-
8, C-18, ciano, diol, amino, etc, al igual que en HPLC.
Gracias al desarrollo alcanzado en la comercialización de placas cromatográficas,
muchas veces se prefiere elegir la CCD sobre la HPLC debido a la simplicidad en
la preparación de las muestras.
Cuando los compuestos de interés se presentan incluidos en matrices muy
complejas como sangre, orina, saliva y otros fluidos biológicos y se decide aplicar
HPLC o GLC es necesario realizar una previa purificación de la muestra a fin de
evitar que la columna cromatográfica se eche a perder rápidamente, lo que no es
nada atractivo teniendo en cuenta el costo de las mismas.
En CCD esta etapa de purificación no es tan importante y se puede proceder a la
aplicación de la muestra directamente si se quiere, debido a que siempre se
utilizará una capa nueva en cada corrida cromatográfica, por lo que se partirá de
un sistema cromatográfico completamente fresco, con lo que no es de temer la
pérdida de resolución como sucede con las columnas de GLC o HPLC.
Otro elemento de vital interés es la

aplicación de la muestra en la placa
cromatográfica (figura 12.5) la cual resulta
especialmente importante cuando se realiza
de forma manual, siendo el objetivo a
lograr, el obtener en la zona de aplicación
un punto o una banda lo más estrecha y
concentrada posible, a fin de obtener una
mayor resolución al final de la corrida, por
una menor difusión de la mancha. Para ello
es necesario ser extremadamente Figura 12.5.
cuidadoso y paciente y aun así no siempre Aplicación manual en forma de punto
se obtenían buenos resultados.
Para resolver esta dificultad fueron creadas las placas con zonas de
concentración en las cuales se ha definido una zona de aplicación y otra zona
analítica. Con este tipo de placa, la aplicación de la muestra deja de ser tan
exigente debido a que aunque no se logre un punto de aplicación lo
suficientemente pequeño y concentrado, el efecto que se logra en la zona de
aplicación es precisamente el de concentrar el punto o banda de aplicación de

muestra, la cual llega a la zona analítica en condiciones óptimas para desarrollar

el cromatograma. Este tipo de placa puede ser especialmente adecuada para
aquellos laboratorios donde los recursos no permiten la adquisición de
instrumentos más adecuados que resuelvan esta problemática y se necesite
realizar la separación de mezclas complejas.
El resurgimiento del interés en la cromatografía plana ha venido en gran medida
aparejado con el desarrollo de las placas cromatográficas, lo que ha dado lugar a
la cromatografía en capa delgada de alta resolución (HPTLC, del inglés High
Performance Thin Layer Chromatography), también conocida como
nanocromatografía. Este tipo de placa presenta diferencias considerables con la
placa cromatográfica normalmente empleada, en una serie de características
tales como el tamaño de partícula del adsorbente y la porosidad del mismo.
El adsorbente para HPTLC es producido de la manera más uniforme en cuanto al
tamaño de partícula, teniendo una granulometría en cotas mucho más cerradas
que el adsorbente normal, y un tamaño de poro mucho más pequeño. El grosor
de este tipo de placa es también considerablemente menor encontrándose en el
orden de los 100 m, mientras que en la placa convencional es de alrededor de
250 m para el tipo analítico.
Como resultado del menor tamaño de partícula, este tipo de placa es mucho más
eficiente y permite obtener separaciones adecuadas con distancias de corrida de
solo 3 a 5 cm, comparado con los 10-15 cm que normalmente se necesitan para
el tipo convencional. Como consecuencia de lo anterior, los tiempos de corrida se
reducen considerablemente lográndose reducciones de hasta 40% del tiempo
empleado con las placas convencionales.
Ahora bien, debido al menor grosor de la placa, la capacidad de carga de la placa
es menor lo que obliga a aplicar volúmenes de muestra considerablemente
menores a fin de concentrar la muestra lo más posible en el punto de aplicación.
Así, para obtener una óptima resolución, el tamaño de la mancha en el punto de
aplicación no debe ser mayor a 2-3 mm de diámetro lo que implica que los
volúmenes de aplicación han de estar en el rango de 0.1 a 0.2 L. Lograr estos
resultados con aplicaciones manuales resulta prácticamente imposible, por lo que
se han tenido que diseñar toda una serie de aplicadores de muestra, de los
cuales hablaremos más adelante.
El pequeño tamaño del punto de aplicación en HPTLC permite aplicar un gran
número de muestras por placa (de 20 a 30 muestras por placa). Si se considera
lo anterior y tomando como tiempo de corrida un total de 20 minutos puede
decirse que la velocidad de análisis es de 1 muestra por minuto, con lo que se
ejemplifica la capacidad que tiene esta técnica de competir con HPLC en términos
de velocidad de análisis.
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12.4. APLICACIÓN DE LA MUESTRA

Otro campo que ha experimentado un gran desarrollo es el de la aplicación de la
muestra, punto neurálgico en el desarrollo exitoso de la cromatografía en capa
delgada.
En sus inicios la aplicación se realizaba utilizando micropipetas, microjeringuillas
y microcapilares. Las primeras permiten cargar volúmenes de 10 a 1000 L, las
microjeringuillas tienen una capacidad menor (5-50 L) en tanto los
microcapilares se fabrican generalmente de 1, 2, 3, 5 y 10 L.
Los volúmenes de aplicación de la solución de muestra y patrones dependen de
varios factores. En primer lugar, el volumen depende de la finalidad que se
persigue, es decir si el trabajo es analítico o preparativo (en el segundo caso es
obvio que se requiere aplicar mayores volúmenes) y por otra parte es importante
considerar la concentración del analito. Así, por ejemplo, si se pretende analizar
un componente que se encuentra en muy baja concentración en la muestra,
cercana al límite de detección del método, es aconsejable aumentar el volumen
de aplicación con vistas a garantizar su posterior detección.
De forma general los volúmenes de aplicación con objetivos analíticos están
comprendidos entre 1 y 20 L, obteniéndose una mayor repetibilidad cuando se
aplican volúmenes pequeños por cuanto se evita la difusión radial de los solutos
en el punto de aplicación.
Con fines preparativos se puede aplicar (sobre una placa de 20 x 20 cm y 0.5
mm de espesor), hasta 500 L de solución. En estos casos la aplicación no se
realiza en forma de puntos sino de bandas, tal y como se muestra en la figura
12.6.
Figura 12.6. Aplicación en forma de punto y de banda
En el área de la aplicación de muestras se ha transitado desde los inyectores

manuales (figura 12.7) empleando jeringuillas convencionales tipo HPLC,
montadas en un sistema micrométrico, hasta los inyectores automáticos
acoplados a sistemas de computación, capaces de informar los estatus de

operación y permitir aplicar cantidades extremadamente pequeñas de la
muestra.
Figura 12.7. Diferentes tipos de aplicadores manuales
Una versión intermedia es el inyector semiautomático, el cual solo necesita que

sea cargada la jeringuilla con el patrón o con la muestra problema.
Este pequeño instrumento de costo moderado, es capaz de calcular, según el
tamaño de la placa, el número de pistas posibles de aplicación de la muestra,
cuestión que es a veces un verdadero rompecabezas para el analista a la hora de
optimizar el número de muestras por placa.
Programado adecuadamente, permite aplicar con una pequeñísima atención del
analista, la muestra problema y los patrones de manera prácticamente
insuperable, aun por manos expertas, ya que la aplicación se realiza mediante un
spray que evita el contacto directo del dispositivo con la placa. Además, brinda la
posibilidad de realizar el secado con aire o con nitrógeno, y siempre en frío,
cuestiones importantes a la hora de manejar muestras fácilmente oxidables,
siendo posible incluso adicionar un dispositivo que permite crear una cámara de
gas inerte alrededor de la placa durante el proceso de aplicación.
Como característica adicional se puede agregar que la aplicación de la muestra
puede realizarse en forma de puntos o en forma de bandas, lográndose una
mejor resolución con esta última modalidad, pero que en numerosas
oportunidades es despreciada debido a la dificultad que representa realizarla de
forma manual con una pipeta.
El tamaño de la banda, así como el tiempo de secado es seleccionado por el
analista de acuerdo a sus necesidades, teniendo en cuenta el carácter del
solvente empleado para la disolución del analito. Finalmente se debe puntualizar
que los aplicadores automáticos, liberan al analista del tedioso trabajo de realizar
esta operación y le permite por tanto realizar otras tareas con lo que se consigue
una mayor productividad.
Otros sistemas que han sido desarrollados son los relacionados con la
nanocromatografía (HPTLC), donde se han diseñado equipos de aplicación
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especiales para las pequeñas cantidades anteriormente discutidas y que realizan

esta operación de forma semimanual empleando pequeños capilares de
platino/iridio (figura 12.8).
Figura 12.8. Aplicador semiautomático Linomat 5 de la firma suiza CAMAG
Los sistemas de aplicación automáticos cubren las gamas de aplicaciones que

van desde la cromatografía convencional hasta la nanocromatografía con un
rango de volúmenes de aplicación entre los 10 nL y los 50 L, en placas de hasta
20x20 cm.
Debido a que estos aplicadores están acoplados a sistemas de computación,
permiten la operación de forma completamente automática y sin atención del
operario una vez realizada la programación. Esto permite además almacenar en
memoria la programación ejecutada y repetirla de forma completamente
reproducible tantas veces como sea necesario.
12.5. TÉCNICAS DE DESARROLLO DE LOS CROMATOGRAMAS

Como ya se explicó el desarrollo del cromatograma es la etapa en la que se hace
pasar la fase móvil a través de la fase estacionaria para lograr la separación de
los solutos que componen la muestra. En este sentido existen varias técnicas de
desarrollo; las más utilizadas se exponen a continuación:
A. Desarrollo ascendente.
Es el modo de operación más utilizado en el desarrollo del cromatograma, por la
sencillez del equipo que requiere. Se coloca la placa dentro de una cámara o
cubeta de cierre hermético, en cuyo fondo se ha colocado previamente la fase
móvil la cual debe tener una profundidad máxima de 1 cm. La fase móvil
asciende entonces por capilaridad a través de la placa y comienza el proceso de
separación de los solutos de interés.
Es importante que la cubeta esté previamente saturada con los vapores del
solvente, lo que se logra manteniendo el solvente dentro de la cámara alrededor
de 12 horas antes de introducir la placa cromatográfica. En este sentido debe
señalarse que mientras menor volumen de solvente haya en la cámara, más

rápido se alcanza el equilibrio líquido-vapor y más rápido es el proceso de
saturación, consecuentemente la corrida cromatográfica ocurre en menor tiempo
se evita que el solvente no se evapore en su ascenso al encontrarse con una
atmósfera insaturada.
La figura 12.3, incluida en el epígrafe 12.1, muestra un esquema de esta técnica
de desarrollo.
B. Desarrollo descendente
Esta modalidad requiere de una cubeta especial provista e un recipiente situado
en su parte superior (figura 12.9). La placa se recuesta o fija, según el caso, al
recipiente mencionado y mediante una banda de papel de filtro que abarque el
ancho de la placa se establece un puente líquido entre la fase móvil y la placa. El
solvente asciende por capilaridad a través del papel y llega al borde superior de
la placa, a partir del cual comienza a descender a lo largo de la misma movido
por dos fuerzas: la capilar y la gravitatoria.
Figura 12.9. Desarrollo descendente
El desarrollo descendente es usualmente más rápido que el ascendente y se

emplea usualmente cuando los compuestos a separar tienen muy poca distancia
de recorrido desde el punto de aplicación. La corrida puede detenerse a una
distancia mayor de 15 cm, cuando el frente del solvente está muy próximo al
borde inferior de la placa.
C. Desarrollo horizontal
En su forma más sencilla, en esta técnica de desarrollo se coloca la placa
horizontalmente dentro de una cámara y se hace llegar la fase móvil a uno de
sus bordes mediante un puente de papel de filtro similar al explicado para el
desarrollo descendente el cual asciende por capilaridad a través del papel y luego
transita horizontalmente a lo largo de la fase estacionaria (figura 12.10)
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Figura 12.10. Desarrollo horizontal convencional
El desarrollo horizontal convencional, tal como se ha explicado n logró mejorar

en sus inicios la separación frente a las técnicas ascendente y descendente. Sin
embargo, en la actualidad ha tomado un enorme auge, aspecto este del que se
comentará más adelante.
La clasificación de las técnicas de desarrollo arriba explicadas se fundamenta en
la disposición de la placa cromatográfica y en la dirección que toma la fase móvil
mientras fluye a través de la fase estacionaria.
Sin embargo, existen otros procedimientos adicionales que buscan mejorar la
resolución del cromatograma. Dos de los más empleados son el desarrollo
múltiple y el desarrollo bidimensional.
D. Desarrollo múltiple
La técnica de desarrollo múltiple consiste en realizar dos corridas
cromatográficas sobre una misma placa. Así, por ejemplo, se realiza un primer
desarrollo en un sistema de solventes hasta una altura determinada. La placa se
seca y se introduce en otra cámara con otro solvente o sistema de solventes de
polaridad diferente al primero, para realizar un segundo desarrollo, ahora hasta
15-20 cm del punto de aplicación. La elección del solvente para utilizar primero o
después depende de cada problema específico y se determina por lo general
empíricamente.
E. Desarrollo bidimensional
Esta técnica se aplica en los casos de separaciones difíciles, cuando no se logra
una resolución adecuada de la mezcla aplicada. En este caso la mezcla se aplica
en un solo punto en uno de los extremos de la placa; se realiza entonces un
primer desarrollo en una dirección con un sistema de solventes hasta la altura
convencional (10-15 cm). Posteriormente la placa se seca y se introduce en otro
sistema de solventes con la particularidad que se ha girado 90º. Ahora los
deficientemente separados con el primer sistema de solventes se moverán en
dirección perpendicular al primer desarrollo, lográndose en muchas ocasiones
buenas separaciones finales. La figura 12.11 esquematiza este procedimiento.

Figura 12.11. Desarrollo bidimensional
En lo referente a las técnicas de desarrollo, también se han producido avances

espectaculares y existen hoy en día desde las cámaras usualmente empleadas
que cubren desde los tanques cromatográficos convencionales hasta el tipo
sándwich, hasta las cámaras completamente automatizadas.
Una cámara cromatográfica que aunque se puede considerar dentro del tipo de
las convencionales se emplea hoy con cierta frecuencia es la conocida como Twin
Through Chamber (figura 12.12), ya que una división de vidrio intermedia da la
posibilidad de no solo emplear una menor cantidad de solvente sino que
también, permite situar en la otra mitad un solvente distinto a fin de
acondicionar la cámara con valores enriquecidos con un componente que puede
estar presente o no en la fase móvil, como por ejemplo amoníaco.
Otro tipo de cámara a considerar es aquella en la cual se puede en una sola
corrida analítica probar hasta 5 tipos distintos de solvente en una sola placa, con
lo que se aligera bastante toda la serie de experimentos que muchas veces es
necesario realizar antes de encontrar una composición adecuada de fase móvil.
Al mismo tiempo otros parámetros tales como la humedad relativa y la influencia
de reactivos volátiles pueden ser estudiados. Es evidente además el ahorro de
placas que se obtiene.
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Figura 12.12.Twin Through Chamber
Para el desarrollo de la HPTLC se emplean

hoy en día las llamadas cámaras horizontales
(Figura 12.13.) en las cuales el solvente
corre de forma horizontal como su nombre lo
indica. Para ello se aplica una tira de papel
que conecta la placa con el tanque de
solvente. Con ello es posible por tanto como
dijimos anteriormente aplicar muestras por
ambos sentidos.
Como ejemplo puede decirse que aplicando
las muestras con una separación de 5 mm
entre ellas y dejando 15 mm libres a cada
lado de la placa, es posible aplicar hasta 30
Figura 12.13. Cámaras de desarrollo
muestras en una placa de 10x10 cm. horizontal para HPTLC
Hoy en día ya es posible el desarrollo del cromatograma

de forma completamente automática. Existen en el
mercado, cámaras de desarrollo capaces de
preacondicionar la placa, realizar la corrida en forma de
tanque o sándwich, controlar la distancia de migración y
lo que es más, hasta secar la placa, con lo que el
constante monitoreo de la misma deja de ser una
preocupación del analista. Una vez que la corrida se ha
terminado según las condiciones de programación dadas
por el analista, la misma es secada con aire frío o
caliente y permanece allí hasta que es extraída para su
Figura 12.14. Automatic
Developing Chamber (ADC) observación o el análisis cuantitativo (Figura 12.14.).

Quizás la variante más poderosa de separación es el conocido sistema AMD

(Automatic Multiple Development) de esta misma firma, capaz de competir con la
HPLC en cuanto a separación por gradiente se refiere (figura 12.15).
Entre sus características pueden

nombrarse que debido a que tiene un
efecto focusing en la banda
cromatográfica permite obtener número
de separación superior a 50, ofrece un
método reproducible de elución de
gradiente, con lo que componentes
dentro de una amplia gama de
polaridades pueden ser separados y
permite que las distancias de migración
de los componentes individuales sean
independientes de las matrices donde se
encuentran contenidos. Como ejemplos
de aplicación pueden citarse la
separación de pesticidas en agua potable,
la separación de mezclas de fosfolípidos, Figura 12.15. Sistema AMD
sustancias anabólicas en humanos o
alimentos, etc. Es por tanto posible
realizar ahora técnicas de separación en
capa delgada que no eran posibles de
hacer hasta hace poco.
En la tabla 12.1 se presentan las principales ventajas del sistema HPTLC frente a
la CCD convencional.
Tabla 12.1. Comparación entre CCD y HPTLC
Parámetro CCD HPTLC

Tamaño medio de partícula 10 - 12 µm 5 - 6 µm
Distribución del tamaño de partícula 5 – 20 µm 4 – 8 µm
Espesor de la capa 250 µm 50, 100, 200 µm
Altura de la placa 30 µm 12 µm
Volumen de muestra a aplicar 1 – 5 µL 0.1 – 0.5 µL
Diámetro del punto de aplicación 3 - 6 mm 1 - 1,5 mm
Diámetro de la mancha después del desarrollo 6 - 15 mm 2 - 5 mm
Distancia entre muestras 15 mm 5 mm
Número de muestras por placa max. 12 max. 72
Distancia de migración 10 - 15 cm 3 - 5 cm
Tiempo de migración 20 - 200 min 3 - 20 min
Requerimientos de solvente 50 mL 4 - 8 mL
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Parámetro CCD HPTLC

Límite de detección
• Absorbancia 1 – 5 ng 100 – 500 pg
• Fluorescencia 50 – 100 pg 5 – 10 pg
Límite de determinación
• Absorbancia 100 - 1000 ng 10 - 100 ng
• Fluorescencia 1 - 100 ng 100 pg - 10 ng
12.6. TÉCNICAS DE REVELADO

En la mayoría de los casos los compuestos separados por CCD no non coloreados
por lo que, al culminar la corrida cromatográfica y el secado de la placa, es
necesario visualizar la posición de los mismos en la placa cromatográfica. Para
ello se emplean los llamados métodos de revelado que básicamente pueden ser
de dos tipos: revelado químico y revelado físico.
12.6.1. Revelado físico
El revelado físico aprovecha alguna propiedad de los compuestos mediante la
cual, a través de la interacción agente físico – analito, este último se hace
visible.
El revelador físico más empleado es la radiación ultravioleta (UV) y la propiedad
de los compuestos que se aprovecha es la fluorescencia. Una vez desarrollado el
cromatograma y secado la placa, esta se expone a la radiación ultravioleta
utilizando una lámpara UV adecuada y los compuestos separados fluourecen al
interactuar con la radiación UV haciéndose visibles en forma de manchas sobre la
placa. Obviamente este método posee la desventaja de ser aplicable, en un
principio, solo a aquellas sustancias que son capaces de fluorescer.
Esta dificultad se resolvió con la aparición y comercialización de las placas
fluorescentes, las cuales poseen un aditivo que fluoresce, generalmente a 254 y
336 nm. Al exponer la placa a la radiación UV, esta fluoresce con un color
amarillo verdoso y en los lugares donde se encuentran los analitos no
fluorescentes no se produce el fenómeno, visualizándose como manchas oscuras.
Sin lugar a dudas el advenimiento de este tipo de placas amplió
extraordinariamente las posibilidades de aplicación de este método físico de
revelado.
12.6.2. Revelado químico
Se considera un revelador químico a cualquier reactivo que al reaccionar con el
analito lo transforme en un derivado coloreado. Así, el revelado químico es
simplemente un proceso de derivatización que se realiza “in situ” sobre la placa
cromatográfica para visualizar los componentes separados que aparecen el
gorma de manchas.

Las soluciones de los reveladores o reactivos cromogénicos se distribuyen sobre

la capa mediante dos procedimientos:
• Por inmersión de la placa en el agente revelador, que constituye un método
de poco empleo.
• Por pulverización neumática o atomización de la solución reveladora sobre la
placa.
Es importante llamar la atención sobre la forma de aplicar la solución reveladora.
La pulverización tiene que ser uniforme utilizando un pulverizador que entregue
gotas muy finas. La distancia de colocación del pulverizador frente a la placa
debe ser tal que la fuerza con que lleguen la gotitas no distorsione el
cromatograma. En cada técnica particular se indica como dispersar el agente
cromogénico y por lo general debe estarse aplicando solución reveladora hasta
que la placa se torne traslúcida; se requiere además una etapa de tanteo en la
cual se varía la cantidad de agente revelador, la distancia y la fuerza de la
aspersión, antes de que se obtengan los mejores resultados. La figura 12.16
muestra un pulverizador típico, utilizado para la atomización de la solución
reveladora.
Figura 12.16. Cámara de pulverización y pulverizador para atomización
Debe señalarse que en algunas ocasiones se combina el revelado físico con el

químico, debido a que existen reveladores químicos que requieren para su acción
de agentes físicos como la radiación UV y el calor.
La tabla 12.2 muestra algunos reveladores químicos y sus condiciones de
empleo.
Tabla 12.2. Algunos sistemas de revelado
Analito Revelador Tratamiento

Plaguicidas Solución de AgNO3 + 2- Exposición de la placa a
organoclorados fenoxietanol + peróxido de radiación UV 254 nm después
hidrógeno. de haber evaporado el solvente.
Aminoácidos Ninhidrina Calentar la placa a 100ºC

después de haber atomizado el
revelador.
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Analito Revelador Tratamiento

Esteroles y ácidos 2,7-diclorofluoresceína Exposición de la placa a
grasos radiación UV 254 nm después
de haber evaporado el solvente
Ácido sórbico, Solución hidroalcohólica de Exposición de la placa a
benzoico, dicromato de potasio 0.15 % + radiación UV 360 nm después
p-clorobenzoico, Solución saturada de ácido de haber evaporado el solvente
salicílico, tiobarbitúrico 0,1% en Etanol
p-hidroxibenzoico 96%
12.7. ANÁLISIS CUALITATIVO

La identificación de las manchas en el cromatograma es el paso previo a su
estimación cuantitativa. Sin embargo, esta etapa tiene gran importancia debido a
que en muchos casos con la identificación del compuesto termina el análisis. En
efecto, la CCD es una técnica muy fuerte de confirmación analítica y con tal
finalidad se utiliza frecuentemente.
Cuando se poseen patrones de referencia de los compuestos que pueden
presentarse en la muestra, la identificación resulta relativamente fácil. Sobre
una misma placa se aplican muestras y los patrones de referencia de los analitos
que se sospecha están presentes en la muestra. Luego de desarrollado y
revelado el cromatograma se comparan las distancias de migración de los
compuestos separados de la muestra con las distancias de migración de los
patrones y en aquellos casos coincidentes hay razones para pensar que la
identidad del compuesto se corresponde con la del patrón (ver figura 12.4 en el
epígrafe 12.1).
Ahora bien, la comparación de estas distancias no se realiza solo visualmente,
sino que se calcula un parámetro conocido como factor de retardo (Rf), definido
como la relación entre la distancia recorrida por un compuesto entre la distancia
recorrida por el solvente de corrida (fase móvil).
Tomemos por ejemplo el caso de una separación cromatográfica de una muestra
constituida por 2 componentes A y B, la cual se ha cromatografiado con 2
patrones P1 y P2 (figura 12.17).
Es obvio que iguales valores de Rf para un patrón y cierto componente de la
muestra indican la identidad del analito. Está claro también que el Rf toma
valores entre 0 y 1.

Para el caso del componente B de la

muestra el Rf se calcula:
dis tan cia recorrida por B
RfB =
dis tan cia recorrida por el solvente
dB
RfB =
dS
Y para el patrón de referencia P1 sería:
dP1
RfP 1 =
dS
Figura 12.17. Cálculo del Rf
Pudiera pensarse que otra vía de identificación pudiera ser la comparación del Rf
obtenido para el compuesto de interés con valores reportados en la literatura, sin
embargo, este procedimiento es poco confiable debido a que los valores de Rf
dependen de un grupo de factores, entre los que pueden citarse:
• El estado de saturación de la cámara cromatográfica.
• La naturaleza la fase estacionaria, pues aun de un mismo fabricante hay
diferencias de un lote a otro a causa de las condiciones de fabricación.
• La temperatura a la cual se lleva a cabo el desarrollo.
• La actividad de la capa.
• La variación de la composición de la fase líquida, sobre todo cuando hay
mucha diferencia entre los puntos de ebullición para el caso de mezclas de
solventes.
• La técnica de aplicación (si esta se realizó manual o automáticamente, si se
aplicó solo una vez o el punteo se realizó secando entre aplicaciones
sucesivas).
Por las razones expuestas, resulta casi imposible reproducir exactamente las
condiciones cromatográficas empleadas para la obtención de los valores de Rf
reportados y por otra parte muchas veces todas las condiciones de separación no
se conocen. Es por ello que se prefiere siempre aplicar patrones conjuntamente
con la muestra, exactamente bajo las mismas condiciones con vista a eliminar
los factores de variabilidad relacionados. Solo en los casos en que no se posean
los patrones de referencia, se acude a la comparación con reportes de la
literatura con la incertidumbre de que los resultados no serían del todo
concluyentes.
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12.8. ANÁLISIS CUANTITATIVO

Una razón por la cual la cromatografía plana fue relegada durante mucho tiempo
por muchos analistas fue las dificultades inherentes a la cuantificación de los
eluatos de interés con exactitud.
Sin embargo, es posible afirmar que hoy en día esas imprecisiones son cosas del
pasado y la instrumentación desarrollada por la CCD en este momento es capaz
de vencer estas dificultades de manera convincente.
Existen dos métodos fundamentales para realizar la cuantificación: la elución de
los componentes de la placa y los métodos densitométricos.
12.8.1. Método de elución de los componentes
Uno de los métodos empleados para realizar este trabajo consistía en desarrollar
el cromatograma y posterior a la visualización de las zonas de interés, raspar la
zona de sílica correspondiente al componente que se deseaba cuantificar y
trasvasarla a un recipiente donde hacía la medición directamente por técnicas
espectroscópicas (o bien en la zona ultravioleta del espectro si el componente
era capaz de absorber o se realiza una reacción de derivatización para obtener
un compuesto coloreado que permitía realizar la determinación en la zona visible
del espectro).
Esto traía toda una serie de inconveniente que iban desde la pérdida de muestra
con el consiguiente bajo recobrado, hasta problemas de interferencias por el
mismo adsorbente o por los reactivos usados en la reacción de color, por lo que
era práctica obligatoria emplear un ensayo en blanco con la zona de la sílica a fin
de obviar esta dificultad.
Era también importante realizar un estudio del sistema de extracción del eluato
de la sílica a fin de garantizar un porcentaje de recuperación adecuado. No
obstante, se necesitaba de pericia y una buena manipulación a fin de obtener
resultados reproducibles y precisos, lo que no siempre se lograba.
Como una variante a esta modalidad es posible encontrar hoy en día
instrumentos que permiten realizar esta operación de forma semiautomática sin
tener que realizar la operación de raspado.
Estos dispositivos realizan la extracción del componente de interés mediante la
elución en las zonas de separación de la fracción que se quiere de forma
completamente automática sin tener que realizar el raspado de la placa,
permitiendo la extracción de varias muestras al mismo tiempo.
Para ello se usa una pequeña boquilla de elución que se coloca exactamente en
la zona donde se pretende realizar la operación después de la creación de una
pequeña zona circular donde la sílica ha sido raspada mediante otro pequeño
aditamento diseñado para este propósito. Ello permite que el solvente
seleccionado para realizar esta operación entre de manera similar a como lo hace
la fase móvil en la etapa de desarrollo del cromatograma y eluya así

cuantitativamente el componente, siendo recogido este solvente (conteniendo el

componente) a un tubo o contenedor de otro tipo con el cual se puede realizar
posteriormente las operaciones de medición o de derivatización necesarias.
Este instrumento puede ser conjugado para la separación cuantitativa o inclusive
preparativa de todo tipo de compuestos susceptibles de ser separados mediante
CCD y permite inclusive su obtención para su posterior introducción en un
sistema de GLC o HPLC, en caso de que la separación no haya podido ser
completada en la placa.
12.8.2. Métodos densitométricos
La solución más importante para el análisis cuantitativo por CCD, ha sido el
desarrollo impetuoso que ha tenido la construcción de densitómetros cada vez
más eficientes y poderosos.
Un densitómetro es un equipo capaz de medir una señal analítica de los
componentes separados y los patrones directamente “in situ” sobre la placa
cromatográfica. El resultado de esta medición es un cromatograma de señal vs.
distancia de migración de cada uno de los componente de la muestra, en el cual,
de forma análoga a la HPLC y a GLC, el área bajo la curva de cada pico es
proporcional a la concentración (figura 12.18).
Figura 12.18. Placa cromatográfica de una muestra de cinco componentes (A, B, C, D y E)

y cromatograma obtenido por barrido densitométrico.
La cuantificación de cualquiera de los componentes de la muestra se realiza con

ayuda de una curva de calibración. Para ello se aplican en una capa nueva
soluciones de un patrón de referencia correspondiente al componente que se
desea cuantificar a concentraciones o masas crecientes y exactamente conocidas
(por ejemplo 2, 4, 6 y 8 g). Se realiza entonces la corrida cromatográfica bajo
condiciones idénticas a las utilizadas para la muestra y la placa se coloca en el
densitómetro para la lectura de la señal analítica de los patrones.
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Se obtienen entonces un número de picos equivalentes al número de soluciones

patrones aplicadas en la placa (cuatro en el ejemplo considerado) cuyas áreas
bajo la curva aumentan en la medida en que aumenta la concentración de los
patrones. El equipo es capaz de integrar estas áreas y como resultado se obtiene
un juego de datos de concentración (o masa) de los patrones vs. área bajo la
curva. Esta data se procesa por regresión lineal y se obtiene una ecuación del
tipo
y = mx +a
donde “m” es la pendiente, “a” es el intercepto, “y” es el área bajo la curva del
pico del componente de interés en el cromatograma de la muestra y “x” es la
concentración o masa del componente de interés
La figura 12.19 muestra un esquema del proceso descrito.
Figura 12.19. Curva de calibración y

detección densitométrica.
Nótese que los valores de Rf de los diferentes
patrones (P1, P2, P3 y P4) en la placa
cromatográfica son iguales debido a que se trata
del mismo componente. Véase además como en
la medida en que aumenta la concentración de
los patrones aumenta también el área bajo la
curva de los picos obtenidos con el análisis
densitométrico.
Los densitómetros actuales son capaces de leer con una gran precisión y
exactitud no solo una placa de hasta 20x20 cm sino que también pueden leer
tiras electroforéticas. Poseen un rango espectral útil desde 190 hasta 800 nm
con lo cual superan en algunos casos los detectores UV/VIS de HPLC, y efectúan
el barrido de la placa en forma de absorbancia, fluorescencia y reflectancia, lo
cual puede ser seleccionado por el analista. Para ello usan 3 tipos de lámparas:
las de Deuterio, en el rango espectral de 190 a 400 nm, las de Tungsteno-
Halógeno en el rango de 400 a 800 nm y una lámpara de alta presión de
mercurio en el rango de 254 a 578 nm.
Los fenómenos de absorbancia y fluorescencia ya fueron explicados en capítulos
precedentes. En el caso de la reflectancia la señal obtenida es resultado de la

medición de la potencia de radiación reflejada por los analitos la cual es

proporcional a su concentración. La medición de la fluorescencia tiene el
inconveniente de estar restringida para aquellos componentes capaces de
fluorescer, ya sea en su estado nativo o con ayuda de reacciones de
derivatización, pero a su vez posee la ventaja del incremento considerable de la
sensibilidad en la detección.
Entre otras características que han sido mejoradas se encuentran la construcción
de monocromadores capaces de obtener hasta 1200 líneas/mm. Con este tipo de
sistema, la cuantificación puede realizarse de forma confiable y exacta ya que la
medición se realiza “in situ” y no es necesario realizar ninguna manipulación de
la muestra.
Debe señalarse además que al igual que otras técnicas cromatográficas que
cuentan hoy en día con sistemas que permiten obtener información estructural
de las sustancias separadas (como son los detectores de espectrometría de masa
para GLC y HPLC, así como arreglo de diodos para HPLC), los densitómetros
actuales, al ser acoplados a sistemas de computación con software altamente
sofisticados, hacen posible la ejecución de estas mismas operaciones, haciendo
altamente eficiente el procedimiento de identificación sobre la base no solo de los
valores de Rf sino también con la obtención de información espectral “in situ” de
los componentes cromatografiados. Así, los densitómetros actuales permiten
también monitorear el cromatograma a diferentes longitudes de onda con una
sola corrida de forma similar a como lo hacen los detectores con arreglo de
diodos en HPLC.
La figura 12.20 muestra un densitómetro acoplado a un sistema computarizado.
Figura 12.20. Densitómetro acoplado a un sistema de computación
Finalmente queremos discutir otro problema que estuvo directamente

relacionado con el uso de los densitómetros, especialmente en el caso de
detecciones donde se empleaba el revelado químico. Es conocido que el revelado
químico en forma de spray con reactivos formadores de complejos coloreados,
traía como consecuencia la distribución no uniforme del mismo, con su
consiguiente acumulación en diferentes puntos de la placa, de forma
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heterogénea. Esto conducía a que al aplicar las técnicas densitométricas se

produjeran considerables desviaciones de la línea de base del cromatograma
trayendo como resultado una apreciación errónea del área bajo la curva de los
picos cromatográficos. Para resolver este problema, se ha desarrollado un
sistema que permite esparcir de forma completamente homogénea y continua el
reactivo revelador, por sumersión de la placa en el sistema cromogénico, por lo
que la línea de base del cromatograma se presenta en condiciones óptimas.
Fotodocumentación
Una ventaja adicional con la que no cuenta el

resto de las técnicas cromatográficas estudiadas
(GLC y HPLC) es el sistema de
fotodocumentación del cromatograma obtenido.
Actualmente existen aditamentos que permiten
registrar fotográficamente la separación
efectuada en la placa (Figura 12.21.), en
excelentes fotografías a color, lo mismo a la luz
ultravioleta que para aquellas detecciones con
reveladores químicos, lo que permite crear un
archivo de no solo el cromatograma visto por un
densitómetro, sino también de la separación
efectuada en la placa cromatográfica.
Figura 12.21. Sistema de
fotodocumentación
Es innegable que la CCD, gracias al desarrollo innovativo de una poderosa

instrumentación, está resurgiendo nuevamente en el campo del análisis
cromatográfico como una técnica analítica sumamente poderosa que contribuye
y contribuirá en los años próximos a ganar cada vez más adeptos y a
reconquistar a los que en algún momento la abandonaron por métodos
instrumentales más modernos.
1. Consulte los apéndices C-4 y C-9, en los que aparece un resumen
de los principios de funcionamiento de los métodos cromatográficos
estudiados y de los procedimientos de identificación y cuantificación
empleados en cromatografía en capa delgada.
2. Resuelva los ejercicios 17, 18 y 19 que aparecen en el Capítulo 14
/ epígrafe 14.1. Ejercicios propuestos.
epígrafe 14.2. Problemas integradores.

BIBLIOGRAFÍA.
1. Analíticos en Alimentaria. Métodos Oficiales de Análisis. Aceites y grasas. Ed.
Panreac Química SA, 1999.
London.
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13 Métodos potenciométricos
La potenciometría es una de las tantas técnicas abarcadas por la electroanalítica.

Antes de referirnos a ella en detalle, es importante conocer en qué consiste
efectivamente un método electroanalítico, que por otra parte, no presenta
características unívocas sino que pueden subdividirse en diferentes sistemas o
procedimientos.
Los métodos de rasgos electroanalíticos son procesos instrumentales empleados
para distintos análisis. Asimismo, utilizan todas las propiedades electroquímicas
con las que cuenta una determinada disolución para precisar debidamente la
concentración que ésta posee de un analito. Las técnicas electroanalíticas más
importantes son la electrogravimetría, la polarografía, la conductimetría, la
amperometría, la voltametría, la cronoamperometría, la culombimetría, la
cronoculombimetría y, por supuesto, el sistema aplicado por la potenciometría.
Toda la amplia gama de magnitudes electroquímicas que pueden ser empleadas
o que pueden relacionarse con los métodos electroanalíticos también son
muchas; pueden destacarse el grado de intensidad de la corriente eléctrica, el
potencial de electricidad con el que se cuenta, la carga eléctrica, la resistencia
eléctrica, la masa que se puede acumular en un determinado electrodo y,
asimismo, el tiempo, que es un factor que hay que tener en cuenta para el caso
de la cronoculombimetría y de la cronoamperometría.
Para realizar un esbozo de las principales técnicas electroanalíticas (dentro de las
cuales se incluye la potenciometría, como ya hemos determinado), es preciso
tener en cuenta las propiedades que se están midiendo. Por ello, los métodos
básicos que deben listarse son: las técnicas voltamétricas, la conductimetría, la
electrogravimetría y la culombimetría. Estas dos últimas opciones, son además
conocidas como técnicas crono, justamente porque tienen la capacidad de medir
la magnitud electroquímica en función directa con el tiempo. Pero, en general, es
importante destacar que todas estas técnicas tienen en común su gran
selectividad, así como también una adecuada sensibilidad. Como si todo esto
fuera poco, el costo a la hora de ser aplicadas es infinitamente inferior al de
otros métodos disponibles.
13.1. PRINCIPIOS GENERALES DE LOS MÉTODOS POTENCIOMÉTRICOS

Los métodos potenciométricos de análisis se basan en las medidas del potencial
de celdas electroquímicas en ausencia de corrientes apreciables. Desde el
comienzo del siglo XX, las técnicas potenciométricas se han utilizado para la
detección de los puntos finales en los métodos volumétricos de análisis. De
origen más reciente son los métodos en los que las concentraciones de los iones
se obtienen directamente del potencial de un electrodo de membrana selectiva
359
13. Métodos potenciométricos
de iones. Tales electrodos están relativamente libres de interferencias y

proporcionan un medio rápido y conveniente para estimaciones cuantitativas de
numerosos aniones y cationes importantes.
Todos los métodos potenciométricos se basan en el comportamiento de una pila
electroquímica compuesta por dos electrodos sumergidos en la disolución
electrolítica objeto de análisis.
Recordemos que la electroquímica es la parte de la química que trata de la
relación entre las corrientes eléctricas y las reacciones químicas, y de la
conversión de la energía química en eléctrica y viceversa. En un sentido más
amplio, la electroquímica se ocupa del estudio de las reacciones químicas que
producen efectos eléctricos y de los fenómenos químicos causados por la acción
de las corrientes o tensiones.
La mayoría de los compuestos inorgánicos y algunos de los orgánicos se ionizan
cuando se disuelven en agua u otros líquidos; es decir, sus moléculas se disocian
en especies químicas cargadas positiva y negativamente que tienen la propiedad
de conducir la corriente eléctrica, de ahí que se denominen electrolitos.
Cuando una barra metálica de un metal Me, se sumerge en una disolución que
contiene sus propios iones o en agua pura, se produce una tendencia del metal a
liberar iones positivos de la red metálica hacia la disolución y durante ese
proceso, la barra metálica se va cargando negativamente debido al exceso de
electrones que se acumulan por la liberación de los iones positivos. Ahora bien,
llega un momento en que la barra cargada negativamente es capaz de atraer los
iones positivos de la disolución, depositándose entonces el metal sobre la barra.
Estos procesos ocurren reversiblemente hasta el establecimiento del equilibrio,
que implica una transferencia de electrones a la que le corresponde una
diferencia de potencial entre el metal y la disolución. Este potencial que se
engendra en la interfase metal-disolución es imposible de medir directamente; es
por eso que en la práctica se emplea un método indirecto basado en la
comparación de dos electrodos.
En dependencia del analito que se desea determinar se escoge un tipo de
electrodo, el cual responde al cambio de concentración del ion del analito en la
disolución; de ahí que a este electrodo se le llame electrodo indicador. El valor
del potencial del electrodo indicador se determina en comparación con otro
electrodo no polarizable, cuyo potencial no varía, al cual se le denomina
electrodo de referencia.
Resumiendo entonces, en todas las determinaciones potenciométricas hay un
sistema electródico constituido por dos electrodos: un electrodo indicador que es
el que mide la variación del potencial según varía la concentración del ion que se
determina (analito) y otro electrodo de referencia, no polarizable y de potencial
constante.
La figura 13.1 describe una celda típica para estudios potenciométricos.
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Figura 13.1. Celda para medidas potenciométricas.
El electrodo de referencia de la figura 13.1 es una semicelda cuyo potencial de

electrodo Eref se conoce con exactitud y es independiente de la concentración del
analito u otros iones en la disolución de estudio. Aunque puede tratarse de un
electrodo normal de hidrógeno, este se usa pocas veces ya que su empleo y
mantenimiento es algo problemático. El electrodo indicador que se sumerge en la
disolución del analito, adquiere un potencial Eind , que depende de la
concentración del analito. Muchos electrodos que se emplean en potenciometría
son selectivos en sus respuestas.
El tercer componente en una celda potenciométrica es el puente salino, el cual
impide que los componentes de la disolución del analito se mezclen con el
electrodo de referencia. En la superficie de cada extremo del puente salino se
desarrolla un potencial de unión líquida. Estos dos potenciales tienden a anularse
mutuamente si las movilidades del catión y el anión son casi iguales. El cloruro
de potasio es un electrolito para el puente salino casi ideal, puesto que las
movilidades del K+ y el Cl- son prácticamente idénticas. Por tanto el potencial a lo
largo del puente salino, se reduce a unos pocos milivolt. En muchos métodos
electroanalíticos el potencial de unión es suficientemente pequeño para no
tenerse en cuenta. Sin embargo en los, métodos potenciométricos, el potencial
de unión y su incertidumbre pueden ser factores que afecten la exactitud y
precisión de la medida.
El potencial de la celda que se acaba de describir, puede escribirse:

Ecelda = Eind - Eref + Ej
La concentración del analito, está implícita en Eind , así pues, para la

determinación potenciométrica debe medirse el potencial de celda, corregirlo
respecto a los potenciales de referencia y de unión líquida y calcular la
concentración del analito a partir del potencial del electrodo indicador. En un
sentido estricto, el potencial de una celda galvánica se relaciona con la actividad
del analito. La calibración adecuada del sistema de electrodos con disoluciones
de concentración conocida, es la única forma de calcular la concentración del
analito.
La figura 13.2 muestra un resumen de los tipos de electrodos de referencia e
indicadores empleados en los métodos potenciométricos, cuyas características
más importantes serán abordadas en los próximos epígrafes.
Figura 13.2. Tipos de electrodos usados en los métodos potenciométricos.
13.2. ELECTRODOS DE REFERENCIA

En la mayor parte de las aplicaciones electroanalíticas, es deseable que el
potencial de semicelda de uno de los electrodos sea conocido, constante, y
completamente insensible a la composición de la disolución en estudio. Un
electrodo que se ajusta a esta descripción se llama electrodo de referencia. Junto
con el electrodo de referencia se emplea un electrodo indicador o de trabajo,
cuya respuesta depende de la concentración del analito.
El electrodo de referencia ideal, debe cumplir cuatro condiciones: (1) es
reversible y obedece a la ecuación de Nernst, (2) presenta un potencial que es
constante en el tiempo, (3) retoma a su potencial original después de haber
estado sometido a corrientes pequeñas, y (4) presenta poca histéresis con ciclos
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de temperatura. Aunque ningún electrodo de referencia satisface completamente

estos ideales, varios están asombrosamente cerca.
13.2.1. Electrodos de Calomel
Los electrodos de referencia de Calomel se componen de mercurio en contacto
con una solución saturada de cloruro de mercurio (I) que contiene también una
concentración conocida de cloruro de potasio. A este electrodo se le denomina
electrodo de Calomel saturado (ECS).
El electrodo de Calomel saturado (ECS) es muy utilizado por los químicos
analíticos debido a la facilidad con que puede prepararse. Sin embargo,
comparado con los otros electrodos de Calomel, su coeficiente de temperatura es
significativamente mayor y otra desventaja es que cuando cambia la
temperatura, el potencial sólo alcanza el nuevo valor lentamente, debido al
tiempo requerido para restablecer el equilibrio de solubilidad del cloruro de
potasio y de Calomel. El potencial del ECS a 25ºC es 0,2444 V.
Dos ECS ampliamente difundidos en el comercio se ilustran en la Figura 13.3. El
cuerpo de cada electrodo consiste en un tubo externo de vidrio o de plástico que
tiene de 5 a 15 cm de longitud y de 0,5 a 1,0 cm de diámetro. El tubo interno
contiene una pasta de mercurio/cloruro de mercurio (I) en cloruro de potasio
saturado; este tubo está en contacto con la disolución de cloruro de potasio
saturada del tubo externo a través de una pequeña abertura.
Figura 13.3. Electrodos de referencia de Calomel típicos
Para el electrodo (a), el contacto con el sistema del electrodo indicador se hace
por medio de un tapón de porcelana fritada, una fibra porosa, o una pieza de
vidrio seco poroso sellada en el extremo del tubo externo. Este tipo de unión
tiene una resistencia relativamente elevada (2000 a 3000 ) y una capacidad
limitada de transportar la corriente; por otra parte, la contaminación de la
disolución del analito debido a la salida de cloruro de potasio es mínima. El
electrodo tipo camisa que se muestra en la figura 13.3b tiene una resistencia
mucho menor pero tiende a derramar pequeñas cantidades de cloruro de potasio
en la muestra. Antes de utilizarlo, se afloja y hace girar el collar de vidrio
esmerilado, de forma que una gota o dos de disolución de KCl fluyan a través del
agujero y mojen toda la superficie interior esmerilada. De esta manera se
establece un mejor contacto eléctrico con la disolución del analito. El electrodo
tipo camisa es particularmente útil para medidas en disoluciones no acuosas y en
muestras pastosas, en sedimentos, en disoluciones viscosas y en suspensiones
coloidales.
13.2.2. Electrodos de plata/cloruro de plata
El electrodo de referencia más ampliamente comercializado consiste en un
electrodo de plata sumergido en una disolución de cloruro de potasio saturada
con cloruro de plata.
Normalmente, este electrodo se prepara o bien con una disolución saturada de
cloruro de potasio o con una 3,5 M. Los modelos comerciales de este electrodo
son semejantes en apariencia externa y en forma a los dos electrodos de
Calomel representados en la figura 13.2, sin embargo, en los electrodos de
plata/cloruro de plata el tubo interno se reemplaza por un alambre de plata
recubierto con una capa de cloruro de plata; este alambre está sumergido en una
disolución de cloruro de potasio saturada con cloruro de plata. Para ambos tipos
de electrodos se utilizan uniones similares.
Los electrodos de plata/cloruro de plata tienen la ventaja de que pueden
utilizarse a temperaturas superiores a 60°C, mientras que los electrodos de
Calomel no. Por otra parte, los iones mercurio (I) reaccionan con menos
componentes de la muestra que los iones plata (que pueden, por ejemplo,
reaccionar con las proteínas); tales reacciones pueden conducir a la obturación
de la unión entre el electrodo y la disolución de analito.
13.3. ELECTRODOS INDICADORES

El electrodo indicador se define como el electrodo que adquiere un potencial cuya
naturaleza y magnitud queda determinada por la concentración de sus propios
iones en la disolución o por la relación de los iones de un elemento presente en
dos estados de oxidación en la misma solución.
Un electrodo indicador ideal responde de forma rápida y reproducible a los
cambios de actividad del ion analito. Aunque ningún electrodo indicador es
absolutamente específico en su respuesta, actualmente se dispone de unos pocos
que son marcadamente selectivos. Hay dos tipos de electrodos indicadores:
metálicos y de membrana, los cuales serán abordados a continuación.
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13.3.1. Electrodos indicadores metálicos

Se pueden distinguir cuatro tipos de electrodos indicadores metálicos: electrodos
de primera clase, electrodos de segunda clase, electrodos de tercera clase y
electrodos de oxidación reducción o redox.
A. Electrodos de primera clase
Están compuestos por un metal sumergido en una solución que contiene sus
propios iones. Por ejemplo, un alambre de plata introducido en una solución de
una sal soluble de plata. Es decir, que el sistema está formado por el metal, que
es la forma reducida, y sus iones, que son la forma oxidada.
Generalmente los electrodos de primera clase son reversibles respecto al catión,
o sea, su potencial es función de la concentración del catión. Estos electrodos se
utilizan para la determinación del catión proveniente del metal con que está
construido el electrodo. Así, los metales como Ag, Cu, Hg y Cd son adecuados
para construir los electrodos de primera clase ya que presentan semireacciones
reversibles con sus iones.
Sin embargo, los electrodos de primera clase no son muy utilizados en el análisis
potenciométrico por varias razones. En primer lugar, no son muy selectivos y
responden no sólo a sus propios cationes sino también a otros cationes más
fácilmente reducibles. Por ejemplo; un electrodo de cobre no puede utilizarse
para la determinación de iones Cu (ll) en presencia de iones plata (I), que
también se reducen en la superficie del cobre. Además, muchos electrodos
metálicos, tales como los de cinc y cadmio, sólo pueden utilizarse en disoluciones
neutras o básicas porque se disuelven en presencia de ácidos. En tercer lugar,
algunos metales se oxidan tan fácilmente que su uso queda restringido a
disoluciones previamente desaireadas. Finalmente, ciertos metales duros, tales
como hierro, cromo, cobalto y níquel, no proporcionan potenciales reproducibles.
B. Electrodos de segunda clase
Estos son los electrodos sensibles a los aniones. En este caso un alambre de
plata recubierto con una de sus sales insolubles (AgCl, AgBr, AgI), indicará la
concentración del anión, así como los iones de plata. Por ejemplo, el potencial de
un electrodo de plata reflejará exactamente la concentración del ion Cl –, Br– o I–
en una solución saturada con AgCl, AgBr o AgI, de ahí que sea el más utilizado
para la determinación de estos aniones.
Una manera adecuada de preparar un electrodo sensible a cloruros es poner un
alambre de plata pura como ánodo en una celda electrolítica que contenga
cloruro de potasio. El alambre quedará recubierto con un depósito adherido de
haluro de plata, que rápidamente se equilibrará con la capa superficial de la
disolución en la que este sumergido. Dado que la solubilidad del cloruro de plata
es baja, un electrodo obtenido de esta manera puede utilizarse para numerosas
medidas.

Un electrodo importante de segunda clase para medir la actividad del anión Y 4-

del EDTA se basa en la respuesta de un electrodo de mercurio en presencia de
una pequeña concentración del complejo estable del EDTA con Hg (II). Para
emplear este electrodo, es necesario introducir al principio una pequeña
concentración de HgY2- en la disolución del analito. El complejo es tan estable
(para el HgY2-, Ke = 6,3 x 1021) que su actividad permanece prácticamente
constante en un amplio intervalo de actividades de Y4-. Este electrodo es útil para
establecer los puntos finales en las valoraciones con EDTA.
C. Electrodos de tercera clase
Los electrodos de tercera clase están compuestos por un metal en contacto con
dos sales poco solubles. Por ejemplo: Ag en contacto con AgCl y PbCl 2, formando
el sistema Pb2+ / PbCl2, AgCl, Ag en el cual transcurre el siguiente proceso
electrolítico:
2AgCl + Pb2+ + 2e– 2Ag (s) + PbCl
Durante el proceso electrolítico se efectúa la transformación de la sal menos
soluble en otra de mayor solubilidad (Kps AgCl << Kps PbCl 2).
Una aplicación importante de los electrodos de tercera clase es la versión del
electrodo Hg, HgY2–; utilizado en las valoraciones complejométricas con EDTA, ya
que su sal disódica (H2Y2–) forma un complejo muy estable con el catión del
electrodo y con el metal que se valora (Me) componiendo el sistema siguiente:
Hg / HgY2– . MeY2– . Me2+
Este electrodo da la medida de la c(Y4–) del EDTA cuya respuesta se manifiesta
en presencia de muy pequeñas concentraciones del complejo HgY 2–, el cual se
añade al inicio de la valoración.
Como ejemplo puede citarse un electrodo de mercurio que se ha utilizado para la
determinación del pCa de disoluciones que contienen calcio. Como en el ejemplo
precedente, se introduce en la disolución una pequeña concentración del
complejo de EDTA con Hg (II). Si, además, se introduce un pequeño volumen de
una disolución que contiene el complejo del EDTA con el calcio, se establece un
nuevo equilibrio y así, el electrodo de mercurio se ha transformado en un
electrodo de tercera clase para el ion calcio.
D. Electrodos redox metálicos
Los electrodos de oxidación reducción están compuestos por un metal inerte o
inatacable, sumergido en una solución que contiene iones en dos estados de
oxidación. En este sistema, el metal inerte no participa en las semirreacciones y
actúa solo como transportador de electrones entre las sustancias oxidante y
reductora.
Generalmente estos electrodos están constituidos de platino o platino platinado u
oro y se emplean en las valoraciones de oxidación reducción. El potencial que
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desarrolla el electrodo depende únicamente del potencial del sistema redox de la

solución en la que está sumergido el metal inerte.
Entre los electrodos redox se destacan los electrodos gaseosos. En este caso el
electrodo gaseoso está compuesto por el metal inerte (Pt o Pt platinado) al cual
se le suministra un gas con actividad electroquímica. Las moléculas del gas son
adsorbidas en la superficie del metal, descomponiéndose en átomos y estos ya
adsorbidos participan directamente en el proceso electródico.
Se debe resaltar, sin embargo, que los procesos de transferencia de electrones
en los electrodos inertes no son con frecuencia reversibles. Como consecuencia,
los electrodos inertes no responden de manera predecible a muchas delas
semirreacciones encontradas en la tabla de potenciales de electrodo. Por
ejemplo, un electrodo de platino sumergido en una solución de iones tiosulfato y
tetrationato no presenta potenciales reproducibles, ya que el proceso de
transferencia de electrones es lento y, por tanto, no reversible en la superficie
del electrodo.
13.3.2. Electrodos indicadores de membrana
Se puede conseguir de fuentes comerciales una amplia variedad de electrodos de
membrana que permiten la determinación rápida y selectiva de numerosos
cationes y aniones por medidas potenciométricas directas. A menudo, los
electrodos de membrana se denominan electrodos selectivos de iones debido a la
gran selectividad de la mayor parte de estos dispositivos. También se refieren a
ellos como electrodos de pIon debido a que su respuesta se registra
generalmente como una función p, tal como pH, pCa, o pNO3.
Clasificación de las membranas
Los electrodos indicadores de membrana difieren entre sí, en la composición
física o química de la membrana. El mecanismo general por el que se desarrolla
en estos dispositivos un potencial selectivo a iones depende de la naturaleza de
la membrana y es completamente diferente del origen del potencial en los
electrodos indicadores metálicos. Mientras que el potencial de un electrodo
metálico tiene su origen en la tendencia de una reacción de oxidación/reducción
a producirse en la superficie del electrodo, en los electrodos de membrana, por
el contrario, el potencial observado es un tipo de potencial de unión que se
desarrolla en la membrana que separa la disolución del analito de la disolución
de referencia.
Propiedades de las membranas selectivas de iones
Todas las membranas selectivas electrodos presentan propiedades comunes, que
proporcionan la sensibilidad y la selectividad de los electrones de membrana
hacia ciertos cationes y aniones. Estas propiedades son:
1. Mínima solubilidad. Una propiedad necesaria de un medio selectivo de iones
es que su solubilidad en las disoluciones del analito (generalmente acuosas)
se aproxime a cero. Así, muchas membranas están formadas por moléculas
grandes o agregados moleculares tales como los vidrios de sílice o resinas

poliméricas. Los compuestos inorgánicos iónicos de baja solubilidad, tales
como los haluros de plata, también se pueden convertir en membranas.
2. Conductividad eléctrica. Una membrana debe presentar algo de conductividad
eléctrica aunque sea pequeña. Generalmente, esta conducción se debe a la
migración en el interior de la membrana de iones con una sola carga.
3. Reactividad selectiva con el analito. La membrana o alguna de las especies
contenida en la matriz de la membrana deben ser capaces de unirse
selectivamente con los iones del analito. Se encuentran tres tipos de uniones:
por intercambio jónico, por cristalización y por formación de complejos,
siendo los dos primeros los más comunes.
Por la naturaleza de la membrana, estos electrodos selectivos se pueden
clasificar en cuatro grupos:
• Electrodos de membrana de vidrio
• Electrodos de membrana líquida
• Electrodos de membrana en estado sólido
• Electrodos de membrana permeable a los gases
A. Electrodo membrana de vidrio
El electrodo de membrana de vidrio es el más importante electrodo indicador
para la medida de la concentración hidriogeniónica (c H 3O+), es decir el pH de
innumerables sistemas. Su empleo es muy ventajoso porque además de estar
sujeto a pocas de las interferencias que afectan a otros electrodos sensibles a la
c H3O+, es muy versátil ya que puede usarse en soluciones ácidas, alcalinas, en
presencia de reductores y oxidantes, sustancias volátiles, precipitados, proteínas,
gases disueltos, sustancias viscosas y aun semisólidas.
El electrodo de vidrio para el pH es anterior en varias décadas a todos los demás
electrodos de membrana. Desde principios de los años treinta, la manera más
adecuada de determinar el pH ha sido midiendo la diferencia de potencial a
través de una membrana de vidrio que separa la disolución del analito de una
disolución de referencia de acidez fija. El fenómeno en que se basa esta medida
fue identificado por primera vez por Cremer en 1906 e investigado
sistemáticamente por Haber pocos años después. La generalización del uso del
electrodo de vidrio para medidas de pH, sin embargo, se retrasó unas dos
décadas hasta la invención del tubo de vacío que permitiría la adecuada medida
de potenciales a través de membranas de vidrio que tienen resistencias iguales o
superiores a 100 M Los estudios sistemáticos de la sensibilidad de las
membranas de vidrio frente al pH llevaron finalmente a finales de la década de
los sesenta al desarrollo y comercialización de electrodos de membrana para dos
docenas o más de iones tales como K+, Na+, Ca2+ F– y NO3 –.
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La Figura 13.4 muestra una celda moderna característica para medir el pH. La
celda consiste en un electrodo indicador de vidrio y un electrodo de referencia de
plata/cloruro de plata o de Calomel saturado sumergidos en una disolución cuyo
pH se va a determinar. El electrodo indicador consiste en una delgada membrana
de vidrio sensible al pH sellada en el extremo de un tubo de vidrio de paredes
gruesas o de plástico. El tubo contiene un pequeño volumen de ácido clorhídrico
diluido saturado con cloruro de plata (la disolución interna en algunos electrodos
es un tampón que contiene ion cloruro). En esta disolución un alambre de plata
forma un electrodo de referencia de plata/cloruro de plata, que se conecta a una
de las terminales de un dispositivo para medir el potencial. El electrodo de
referencia se conecta a la otra terminal.
Figura 13.4. Sistema de electrodos típico para medir pH
Esta celda contiene dos electrodos de referencia: (1) el electrodo externo de

plata/cloruro de plata y (2) el electrodo interno de plata cloruro de plata. Aunque
el electrodo de referencia interno es una parte del electrodo de vidrio, no es el
elemento sensible al pH. En cambio, es la delgada membrana de vidrio, en la
base del electrodo, la que responde al pH.
B. Electrodos de membrana líquida
Este electrodo está compuesto por una delgada capa (membrana) de un líquido
orgánico no miscible que separa la solución interna del electrodo (de
concentración fija y conocida) de la solución del electrolito cuyo ion se quiere
determinar. El potencial se engendra en la interfase entre la solución que se
analiza y la membrana (líquido orgánico no miscible) que se une en forma
selectiva al ion que se desea determinar. En general se emplean para la
determinación potenciométrica directa de algunos cationes polivalentes y ciertos

aniones.
C. Electrodos de membrana en estado sólido
Estos electrones están formados por una membrana de un compuesto que tiene
un catión capaz de atraer selectivamente a un anión. El más conocido es la
membrana sólida de haluro de plata que es capaz de determinar selectivamente
los iones Cl–, Br– o I–.
D. Electrodos de membrana permeable a los gases
Este electrodo está compuesto por una membrana microporosa de un plástico
hidrofóbico permeable a ciertos gases y que separa la solución interna, del
electrolito objeto de análisis. La hidrofobicidad de la membrana conduce a que
los poros permanezcan llenos de aire y no permitan pasar el agua de la
disolución sino solo el gas que se desea determinar.
La figura 13.5 muestra algunos potenciómetros comerciales actuales.
(a) (b) (c)

Figura 13.5. Potenciómetros comerciales, (a) de mesa, (b) y (c) manuales
13.4. APLICACIONES DE LOS MÉTODOS POTENCIOMÉTRICOS

Atendiendo a la forma en que se realiza la medición potenciométrica, estos
métodos se pueden clasificar en dos grandes grupos: métodos potenciométricos
directos y métodos potenciométricos indirectos.
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13.4.1. Métodos potenciométricos directos

La determinación de un ion o de una molécula mediante medida potenciométrica
directa es rápida y sencilla, requiriendo sólo la comparación del potencial
desarrollado por el electrodo indicador en la disolución problema con el potencial
obtenido cuando se sumerge en una o más disoluciones patrón del analito.
Debido a que la mayoría de los electrodos indicadores son selectivos,
normalmente no se requieren etapas de separación previas. Además, las
medidas potenciométricas directas son rápidas y se adaptan fácilmente al control
automático y continuo de las actividades de los iones.
A pesar de estas importantes ventajas, el usuario de los métodos
potenciométricos directos debe estar pendiente de las limitaciones inherentes a
estas técnicas, dentro de las cuales pueden citarse las siguientes:
• La determinación requiere el uso de electrodos especiales selectivos.
• La determinación tiene que llevarse a cabo en soluciones donde se hayan
removido las sustancias interferentes.
• El cálculo de la concentración del metal se hace complejo y bastante inexacto
debido a la existencia de algunos factores como el potencial de la unión
líquida, que aunque en la mayoría de los casos se desprecia, no deja de ser
una limitación para la precisión que puede alcanzarse en la medición
potenciométrica directa.
Aun cuando estas dificultades hacen limitado el empleo de los métodos
potenciométricos directos, la mayor y más importante aplicación de esta técnica
está en la medición directa del pH.
Medidas potenciométricas de pH con el electrodo de vidrio
El conocimiento de la concentración hidrogeniónica en una reacción química o en
un proceso tecnológico es un parámetro indispensable para el control de dicha
reacción o el control a lo largo de todo un proceso tecnológico, desde la materia
prima hasta el producto final, redundando en beneficio de la calidad del producto
final obtenido, mediante la determinación del pH en la línea de proceso, ya sea
en forma puntual a través de análisis de laboratorio o en forma continua en la
línea de proceso.
El electrodo de vidrio es indiscutiblemente el electrodo indicador más importante
para el ion hidrógeno. Su uso es adecuado y está sujeto a pocas de las
interferencias que afectan a otros electrodos sensibles al pH. Los electrodos de
vidrio están disponibles a un costo relativamente bajo y se ofrecen en muchas
formas y tamaños.
El electrodo de vidrio es una herramienta notablemente versátil para la medida
de pH en muy diversas condiciones. El electrodo se puede utilizar sin
interferencias en disoluciones que contienen oxidantes fuertes, reductores, gases
y proteínas (en presencia de proteínas se utiliza, normalmente, un electrodo de

referencia de Calomel en vez de un electrodo de referencia de plata/cloruro de

plata porque los iones plata reaccionan con las proteínas); se puede determinar
el pH de fluidos viscosos o incluso semisólidos. Se puede disponer de electrodos
para aplicaciones especiales. Entre estos se encuentran pequeños electrodos
para medidas de pH en una gota (o menos) de disolución o en una cavidad de un
diente, microelectrodos que permiten la medida del pH dentro de una célula viva,
sistemas para su inserción en una corriente de un líquido que fluye para obtener
el control continuo del pH, un pequeño electrodo que puede tragarse para indicar
la acidez del contenido del estómago (el electrodo de referencia se mantiene en
la boca), y electrodos combinados que contienen tanto el electrodo indicador
como el de referencia en una sonda única.
La figura 13.6 muestra algunos peachímetros de mesa y manuales con
electrodos integrados.
(a) (b) (c)

Figura 13.6. Peachímetros comerciales, (a) de mesa, (b) y (c) manuales.
13.4.2. Métodos potenciométricos indirectos (valoraciones

potenciométricas)
El método potenciométrico indirecto comprende todos los tipos de valoraciones
potenciométricas, que en su esencia son las mismas que fueron estudiadas en el
análisis químico clásico1. La diferencia estriba en que en el análisis clásico se
emplean indicadores para detectar el punto final de la valoración mientras que
en las valoraciones potenciométricas, el potencial de un electrodo indicador
adecuado se emplea con comodidad para establecer el punto de equivalencia.
Una valoración potenciométrica proporciona una información diferente que la de
una medida potenciométrica directa. Por ejemplo, la medida directa de
disoluciones de ácido acético 0,100 M y ácido clorhídrico 0,100 M con un
electrodo sensible al pH da valores de pH bastantes diferentes debido a que el
1
Para obtener información sobre los métodos volumétricos clásicos véase: Zumbado, H. Análisis Químico de los
Alimentos. Métodos clásicos. Ed. Felix Varela. La Habana, Cuba, 2006.
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primero sólo está parcialmente disociado. Por otro lado, las valoraciones
potenciométricas de volúmenes iguales de los dos ácidos requieren la misma
cantidad de base patrón para su neutralización.
El punto final potenciométrico es ampliamente aplicable y proporciona datos
inherentemente más exactos que el método correspondiente que utiliza
indicadores. Es particularmente útil para la valoración de disoluciones coloreadas
o turbias y para detectar la presencia de especies insospechadas en una
disolución. Desafortunadamente, emplea más tiempo que una valoración que
utilice un indicador a no ser que se utilice un valorador automático.
La figura 13.7 muestra un aparato típico para realizar una valoración
potenciométrica. Por lo general la valoración consiste en el registro de un
potencial de celda (o una lectura de pH) después de cada agregado de solución
la valorante contenida en la bureta. Al comienzo de la valoración se agregan se
adicionan porciones grandes del valorante y a medida que se aproxima el punto
final (indicado por mayores cambios de potencial en cada agregado) los
volúmenes adicionados se hacen más pequeños.
Figura 13.7. Aparato para realizar una valoración potenciométrica
En dependencia del tipo de electrodo indicador que se emplee pueden realizarse

valoraciones por neutralización, precipitación, formación de complejos y
oxidación reducción. En todos los casos debe concederse suficiente tiempo para
la obtención del equilibrio después de cada adición de solución valorante, aunque
debe señalarse que las valoraciones por precipitación pueden requerir varios

minutos para alcanzar el equilibrio, particularmente en las cercanías del punto de

equivalencia. Una buena aproximación al equilibrio puede indicarse cuando el
potencial medido cesa de desviarse unos pocos milivolt. La constante agitación
con agitador magnético, es frecuentemente eficaz para acelerar el alcance del
equilibrio.
Determinación del punto final de valoración
Pueden utilizarse varios métodos para detectar
el volumen consumido de la disolución valorante
para alcanzar el punto final en una valoración
potenciométrica.
El método más directo es la construcción de una
gráfica de potencial en función del volumen
consumido de valorante (figura 13.8a), cuyo
comportamiento es idéntico a las curvas
obtenidas por valoraciones clásicas. El punto
medio del salto brusco de potencial en la gráfica
de valoración se estima de forma visual y se
toma como el punto final, extrapolando hacia el
eje x para la determinación del volumen
consumido, V(x), y con estos datos aplicar la ley
fundamental de la volumetría en cualquiera de
sus variantes.
Un segundo procedimiento, más exacto, consiste
en calcular el cambio del potencial por unidad de
cambio en el volumen consumido de valorante,
es decir E/V (primera derivada). Una
representación gráfica de este parámetro
permite obtener un punto final más definido
(figura 13.8b) con un punto de inflexión en el
que resulta más fácil determinar el volumen
consumido del valorante, V(x).
El tercer método consiste en representar la
segunda derivada (2E/V2) en función del
cambio en el volumen consumido del valorante
(figura 13.8c).
Con estos métodos se supone que la curva de
valoración es simétrica con relación al verdadero
punto de equivalencia y que el centro de la
inflexión (salto brusco) corresponde a dicho
punto. Este supuesto es perfectamente válido, Figura 13.8. Curvas de valoración
potenciométrica
siempre que los participantes en el proceso
químico reaccionen entre sí en una relación equimolar y también que el proceso
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del electrodo sea perfectamente reversible. Corrientemente el cambio del

potencial en la región del punto de equivalencia es bastante grande, por lo que,
aun en el caso que no se cumplan los requisitos antes mencionados, el error que
se comete puede considerarse despreciable aun tomando el punto de
equivalencia en el punto medio del salto brusco. No obstante, si se desea una
precisión extraordinaria o cuando se valoran soluciones muy diluidas debe
tomarse en cuanta esta fuente de error y si el error es por asimetría de la curva,
debe calcularse teóricamente el punto estequimétrico.
Finalmente debe señalarse que en las normas de calidad que emplean métodos
potenciométricos, usualmente no hay que realizar estos procedimientos para la
detección del punto final, por cuanto la técnica analítica indica al operador el
valor de potencial o pH al cual debe detenerse la valoración, valores que han sido
determinados previamente en el proceso de validación de la técnica analítica en
cuestión.
13.4.3. Preparación de muestras y límites de detección.
En el estudio potenciométricos de soluciones no se requieren grandes procesos
de preparaciones de muestras como en el caso de los métodos
espectrofotométricos, por ejemplo. Se pueden analizar una gran cantidad de
muestras líquidas y gaseosas. En el caso de las sólidas, estas se pueden preparar
en solución y luego ser estudiadas.
Los límites de detección son de aproximadamente 10 -5 a 10-6 M para electrodos
convencionales. Para sensores de gas, los límites de detección varían entre 0,01
y 5 ppm.
El tiempo requerido para el análisis varía según el electrodo usado, el analito
determinado y la concentración del mismo. Un electrodo de respuesta rápida, tal
como el electrodo de pH, se puede calibrar y usar para determinar el pH de una
muestra en 1 minuto o menos. Para electrodos de ion selectivos convencionales,
los tiempos típicos de análisis de muestras sin incluir el tiempo de calibración,
varían de 5 a 60 segundos, mientras que los sensores de gas y enzimáticos
requieren de 1 a 5 minutos o más para la determinación de una muestra simple.
13.4.4. Aplicaciones de los métodos potenciométricos en el análisis de
los alimentos
Sin dudas, la aplicación más trascendental de los métodos potenciométricos en el
análisis de los alimentos, está en la medición directa del pH, dada la enorme
importancia que tiene el control de este parámetro en la elaboración de los
productos alimentarios, tanto como indicador de las condiciones higiénicas como
para el control de los procesos de transformación; así mismo el pH de los
alimentos tiene un impacto significativo en las características organolépticas de
los mismos.
El pH, como la temperatura y la humedad, son importantes para la conservación
de los alimentos. De ahí que generalmente, disminuyendo el valor de pH de un

producto, aumente el período de conservación. Por ejemplo, el tratamiento de

alimentos en una atmósfera modificada con pH inferior a 4,6 puede inhibir la
multiplicación de agentes patógenos como el "Clostridium botulinum".
En la tabla 13.1 se relaciona la importancia del control de pH para varios grupos
de alimentos.
Tabla 13.1
Importancia del control del pH en algunos grupos de alimentos
Grupo de alimentos Importancia del control del pH
Productos cárnicos • El pH es un indicador importante de las condiciones de salud y

alimentaras del animal en el momento del sacrificio. Los valores típicos
deberían rotar entre pH 5.4 y 7.0, y son indicativos de una conservación
correcta de la carne. Con el pasar del tiempo, el valor del pH tiende a
disminuir. Además, es indicativo del grado de dureza de la carne cortada,
debido a que el proceso de acidificación es diverso en los distintos cortes
de carne. Valores elevados de pH caracterizan una carne más oscura,
menos sabrosa y de menor valor en el mercado.
Productos lácteos • El pH de la leche debe ser controlado desde el momento de la recolección
hasta la entrega del producto, ya que es un indicador válido de sus
condiciones higiénicas. El valor normal está en torno a 6.8. Valores
inferiores a pH 6.8 pueden indicar una infección en el animal, que puede
ser grave si el pH es inferior a 4.4.
• La leche usada para la producción de quesos debe ser de óptima calidad
y su pH puede variar de 6.1 y 6.5, según el tipo de queso que se debe
obtener. El pH también se controla durante la elaboración y maduración
de los quesos. Valores de pH comprendidos entre 4.1 y 5.3 garantizan
una ralentización del crecimiento de los agentes patógenos en los quesos
frescos.
• En la mantequilla, el control del pH es muy importante durante las
diferentes fases de su elaboración. Por ejemplo, la nata se enfría tras la
pasteurización o a un valor que debe ser muy preciso. El valor del
producto terminado debe ser de pH 5 aproximadamente, que en algunas
condiciones puede necesitar aditivos. Un valor entre 4.5 y 6.4 del
producto terminado garantiza una mayor conservación.
• En la preparación del yogur, la refrigeración que sigue a la incubación de
los fermentos, puede comenzar sólo cuando el valor del pH ha alcanzado
valores de alrededor 4.4-4.6. La fruta agregada al yogur debe tener el
mismo valor de pH para evitar reacciones no deseadas. Un producto final
óptimo debería tener un pH de alrededor de 4.0-4.4 para que pueda ser
conservado por más tiempo.
Bebidas • Para la calidad de las bebidas es importante controlar el pH tanto del
agua como de los jarabes y zumos.
• Pequeños cambios del pH en las aguas minerales pueden indicar una
contaminación de las fuentes o de los estratos naturales.
• En la producción de la cerveza el pH juega un papel crucial y debe ser
controlado regularmente en las diferentes fases de su elaboración, con el
fin garantizar un producto con buenos estándares cualitativos. Por
ejemplo, el valor pH de algunos ingredientes debe ser controlado para
crear condiciones favorables a la fermentación.
• En el vino, el pH varía normalmente de 2.8 a 3.8. Su control es muy
importante en las diversas fases del proceso productivo, como la
fermentación y la conservación. Con un pH superior a 3.5, algunas
bacterias pueden atacar el vino. Incluso el sabor depende en gran
medida del pH: por ejemplo, los vinos secos se convierten generalmente
en ácidos. En el embotellamiento de algunos tipos de bebidas alcohólicas
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Grupo de alimentos Importancia del control del pH

como el brandy, las botellas se enjuagan con el mismo producto. La
solución de lavado se recupera y su pH va controlado con el fin que se
pueda reutilizar en sucesivos ciclos.
Pan y pastas • El pan se conserva más tiempo si su valor pH está comprendido entre
alimenticias 4.0 y 5.8. Las pastas al huevo deben tener un pH ácido para evitar la
reproducción de microorganismos patógenos.
Mayonesa y salsas • Para garantizar la seguridad higiénica de salsas a base de mayonesa,

éstas de acidifican agregando el vinagre o el jugo de limón, prologando
en este modo el periodo de conservación de los productos.
Mermeladas, jarabes • El pH del producto terminado influye en el tiempo de conservación de
y caramelizados estos tipos de alimentos. Para las mermeladas y los jarabes debería ser
en torno a pH 3.5 y para los caramelizados entre pH 4.5 y 5.0.
Frutas y verduras • Un valor pH entre 2.5 y 5.5 prolonga la conservación de la fruta fresca e
inhibe la reproducción de microorganismos. Lo mismo ocurre con la
verdura en un intervalo entre 4.6 y 6.4 pH.
Si bien la medición directa del pH constituye la aplicación fundamental de la

potenciometría en el análisis de los alimentos, las valoraciones potenciométricas
también se utilizan con cierta frecuencia, particularmente en aquellos productos
alimenticios de intensa coloración en los que se dificulta la detección del punto
final de valoración a través de los métodos clásicos volumétricos con el empleo
de indicadores. En estos casos no es posible realizar grandes diluciones de la
porción de ensayo debido a que la disminución de la concentración del analito
traería una consecuente disminución de la magnitud del salto brusco en la curva
de valoración y por consiguiente un cambio paulatino en el cambio de color del
indicador, lo que igualmente dificultaría la detección del punto final. De ahí que
se recurra entonces a las valoraciones potenciométricas, en las cuales no es
necesario emplear un indicador.
Las valoraciones potenciométricas de más frecuente aplicación son las
determinaciones de acidez total y de cloruro de sodio. Las primeras se emplean
en vinos, rones, cervezas, maltas, jugos de frutas, mermeladas, mieles, salsas
de tomate, leches y yogur, fundamentalmente; mientras que la determinación de
cloruro de sodio se aplica a conservas de vegetales y quesos, entre otros
productos.
Consulte los apéndices D-1 y D-2, en los que aparece un resumen
del presente capítulo.

BIBLIOGRAFÍA.
Madrid.
2. Hernández, A. (1995). Análisis Químico Cuantitativo. Ed. Felix Varela. La
Habana.
London.
SA. Madrid.
5. Rubinson, K. (2001). Análisis Instrumental. Pearson Education S.A. Madrid,
España.
Dykinson. Madrid.
7. Skoog, D y West, D. (1988). Análisis Instrumental. 4ta Ed., Ediciones Label.
8. Skoog, D. (2008). Principios de Análisis Instrumental. Sexta edición.
Cengage Learning Editores.
10. Zumbado, H. (2006). Análisis Químico de los Alimentos. Métodos Clásicos.
Ed. Félix Varela. La Habana. Cuba.
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14 Ejercicios y problemas
14.1. EJERCICIOS PROPUESTOS

1. El DDT (dicloro-difenil-tricloro-etano) es un insecticida clorado que puede
acumularse en el organismo provocando varios efectos tóxicos por lo que su
aplicación ha sido prohibida en muchos países y en otros es extremadamente
controlada. Su fórmula estructural es la siguiente:
Una vez corroborada la presencia de residuos de DDT en muestras de tomate

fresco se procedió a cuantificarlo a través de la Espectrofotometría UV-VIS.
a) Justifique cuidadosa y detalladamente por qué se decidió aplicar dicho
método analítico para cuantificar el DDT en el tomate. Tenga en cuenta
para su respuesta el fundamento del método seleccionado, las
características estructurales del analito, las transiciones energéticas que
se producen en el mismo y la ley en la que se basa este análisis con
objetivos cuantitativos.
b) Explique cuidadosa y detalladamente como se debió proceder para la
realización del análisis. Incluya en su respuesta la zona del espectro
electromagnético en la que se debió realizar la determinación y qué
criterios tuvo en cuenta el analista para concluir que era en dicha zona.
c) Describa las partes fundamentales del equipo empleado en el análisis y
explique mediante un esquema que procesos suceden en el equipo
durante cada determinación.
2. Se posee una solución de una proteína A de Masa Molar = 69000 g/mol, con
una concentración de 1 mg/mL. La Absorbancia de esta solución a 280 nm
( máxima) fue 0.8, la cubeta utilizada para la medición fue de 1 cm.
a). Explique cuidadosa y detalladamente qué se denomina por  máxima de
una especie química en este método analítico.
b). Explique el procedimiento experimental por el cual el analista pudo
conocer el valor de  máxima de la proteína A.
379
14. Ejercicios y problemas
c). Justifique detalladamente por qué en la cuantificación de un analito las

lecturas de Absorbancia generalmente deben realizarse a su  máxima.
d). Para las mismas condiciones analíticas expuestas en el inicio, calcule el
Coeficiente de Absortividad Molar o de Extinción Molar (a M ó ) de una
solución de esta misma proteína pero con una concentración de 1 g/mL.
3. En la determinación del contenido de nitrito de sodio (NaNO 2) en una muestra
de carne prensada aplicando la Espectrofotometría UV-VIS, se procedió de
la siguiente forma:
Preparación de la muestra.
Se pesaron exactamente 9.5200 g de carne prensada previamente triturada
y homogenizada, a los que se adicionaron 40 mL de agua destilada; se
mezcló y trasvasó a un volumétrico de 500 mL adicionando agua destilada
hasta 300 mL aproximadamente. La suspensión se mantuvo en baño de vapor
durante 2 horas y se adicionaron 5 mL de HgCl2, se enrasó y se filtró.
Determinación.
Se tomó una alícuota de 10 mL de la muestra y se llevó a un volumétrico de
50 mL, se enrasó y se adicionaron 2 mL de reactivo de Griess,
manteniéndose en reposo durante 1 hora para garantizar el desarrollo de
color.
Paralelamente se realizó un ensayo en blanco para calibrar el equipo y
eliminar interferencias.
Preparación de la curva de Calibración.
Se pesaron exactamente 0.25 g de un patrón de NaNO 2, los cuales fueron
disueltos con agua destilada hasta completar 1 litro de disolución, de esta
solución se tomaron exactamente 20 mL y se diluyeron nuevamente hasta 1L
para de esta forma obtener la solución madre. Posteriormente se tomaron
alícuotas de 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 y 0.6 mL, las cuales se llevaron a 6
volumétricos de 50 mL y se enrasaron con agua destilada. Finalmente se
adicionaron 2 mL de reactivo de Griess y se mantuvieron las soluciones en
reposo durante 1 hora con el objetivo de garantizar el desarrollo del color.
A todas las soluciones tanto patrones como muestras se les leyó la
Absorbancia en un Espectrofotómetro a 520 nm, obteniéndose los siguientes
resultados:
No de Tubos B 1 2 3 4 5 6 Muestra
g de NaNO2 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 ¿?
Absorbancia - 0.12 0.23 0.35 0.42 0.50 0.61 0.45
Ecuación de Regresión: y = 0.1903 X + 0.0387

Coeficiente de Determinación: R2 = 0.9932
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a) ¿Cómo pudo ser determinada experimentalmente la  a la cual se

realizaron las lecturas?. Represéntelo gráficamente. Cuál o cuales de
todas las soluciones que preparó el analista pueden ser utilizadas en
este caso.
b) ¿Cómo cree Ud. que se preparó la solución del blanco?
c) Conociendo que la Norma de Especificaciones de Calidad de la carne
prensada establece un máximo de 125 ppm (mg/Kg) para el NaNO 2.
Diga si el lote de producto analizado está apto para su consumo?
d) ¿Qué puede Ud. opinar sobre la calidad del trabajo realizado y sobre la
confiabilidad de los resultados? Fundamente su respuesta partiendo del
procesamiento de los resultados experimentales y la interpretación de
los parámetros obtenidos.
e) Calcule la concentración (en g/mL) de cada una de las disoluciones de
nitrito de sodio patrón y realice el procesamiento de los resultados
experimentales partiendo de una curva de calibración de Absorbancia
vs. g/mL de nitrito de sodio patrón. Utilice para ello el programa
estadístico SPSS. Con los resultados obtenidos responda nuevamente
los incisos c) y d).
f) Si la Absorbancia de la muestra hubiera sido 0.7, qué decisión debería
haber tomado el analista al obtener este resultado. Justifique su
respuesta. ¿Cómo procedería desde un punto de vista práctico ante
esta situación?
4. Se desea determinar el contenido de Hierro en una muestra de Carne

Prensada en Conserva, almacenada durante 3 años en recipientes de
hojalata.
A. Qué técnica sugiere Ud emplear para cuantificar este metal? Explique
cuidadosamente la propiedad en que se basa el método seleccionado,
incluyendo en su análisis las transiciones energéticas involucradas
B. Explique detalladamente los pasos a seguir, tanto desde el punto de
vista experimental como del procesamiento de los datos, para realizar la
cuantificación de Hierro empleando una Curva de Adición de Estándar.
Incluya en su análisis la etapa de preparación de la muestra y el
procesamiento estadístico de los resultados.
C. Describa el equipo empleado para realizar la cuantificación, especificando
las funciones que cumplen cada uno de sus elementos fundamentales.
D. Conociendo que este metal es capaz de formar un complejo coloreado con
una solución de ortofenantrolina, qué otro método instrumental Ud
propone para su cuantificación? Fundamente cuidadosamente su respuesta

y explique el procedimiento a seguir si se decide aplicar una curva de

calibración.
E. La composición cualitativa de los elementos metálicos presentes en la
conserva cárnica se determinó por Fotometría de Llama. Con relación a
este método, explique cuidadosamente:
▪ Fundamento.
▪ Transiciones energéticas involucradas.
▪ Procedimiento de identificación.
▪ Describa el equipo correspondiente.
5. En el análisis del contenido de Cobre en una muestra de cerveza se decidió

emplear un método de espectroscopia de absorción atómica acometiendo la
siguiente técnica:
Introducir la cerveza, que estará a una temperatura próxima a 20°C, en un
Erlenmeyer grande y agitar, primero suavemente y después con energía
hasta que la cerveza esté desgasificada. Si es necesario, eliminar la espuma o
las partículas en suspensión filtrando a través de un papel de filtro seco.
Tapar el embudo con un vidrio de reloj para evitar la evaporación. Después de
desgasificar y filtrar, la cerveza estará a 20°C, aproximadamente. Si se filtra,
asegurarse que el papel de filtro no contenga cobre.
Calibración
Introducir 0,0; 0,1; 0,2; 0,4 y 0,6 mL de una solución patrón de cobre (1000
mg/L) en cinco matraces de 100 mL, llevar hasta 1mL con agua destilada y
enrasar con la cerveza que se va a analizar. Diluir 10 veces pipeteando 10 mL
de cada una de las soluciones precedentes en otros cinco matraces de 100 mL
y enrasar de nuevo. Se tendrá así una serie de cervezas con adiciones
medidas de cobre.
Determinación
Aspirar las soluciones directamente al espectrofotómetro de acuerdo con el
manual de instrucciones del aparato, usar como cero el Agua PA y medir la
absorbancia de la cerveza y de los cuatro patrones correspondientes a 324.7
nm.
Cálculo. Expresar la concentración de cobre en mg/L con dos cifras
decimales.
Al concluir el análisis se obtuvieron los siguientes resultados experimentales:
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mL de la solución
Solución Absorbancia
patrón de Cu
1 0 0.051
2 0.1 0.105
3 0.2 0.165
4 0.4 0.284
5 0.6 0.371
A. ¿Qué concentración de Cobre en mg/L posee cada una de las soluciones de
la curva de calibración?
B. Calcule la concentración de Cobre en la cerveza analizada. Exprese sus
resultados en mg/L. Emplee para ello el método de regresión lineal.
C. Atendiendo a la Ecuación de Regresión y al Coeficientes de Determinación.
Qué puede Ud. opinar sobre la calidad del trabajo realizado y sobre la
procesamiento de los resultados experimentales y la interpretación de los
parámetros obtenidos.
6. La determinación de Vitamina B1 (Tiamina) en productos cárnicos puede

realizarse empleando un método Fluorimétrico. La tiamina se extrae en medio
ácido y con calor y posteriormente se oxida con Ferricianuro de Potasio en
medio alcalino (pH= 10), El Tiocromo resultante de la oxidación, de intensa
fluorescencia azul, el cual se extrae finalmente con alcohol isobutílico para
medirlo fotoeléctricamente.
En la determinación del contenido de Tiamina en muestras de carne de cerdo,

se procedió de la siguiente forma:

Se tomaron alrededor de 200 gramos de carne, se picó en trozos y se trituró
y homogenizó convenientemente. Se pesaron entonces en un erlenmeyer de
250 mL, 20.32 g de producto al cual se adicionaron 100 mL de solución de
HAc 2% m-V. La mezcla se reflujó durante 15 minutos y luego se centrífugó y
filtró sobre papel. Al filtrado se añadió solución de ácido tricloroacético (TCA)
con el objetivo de precipitar las proteínas y posteriormente se centrifugó y
filtró nuevamente. Al filtrado se añadió 0.5 mL de ferricianuro de potasio, 3
mL de NaOH 15% m-V y 20 mL de isobutanol. La mezcla se agitó, se
centrífugo y se decantó la fase orgánica en un embudo separador con el cual
se eliminaron totalmente los restos de fase acuosa. La fase orgánica se
trasvasó cuantitativamente a un volumétrico de 100 mL y se enrasó con
isobutanol.
Calibración
Se preparó una solución patrón de Tiamina a una concentración de 100
g/mL, a partir de la cual se tomaron alícuotas de 1, 1.5, 2, 2.5 y 3 mL y se
vertieron respectivamente en 5 volumétricos de 100 mL. Se añadió entonces
a cada solución 0.5 mL de ferrocianuro de potasio, 3 mL de NaOH 15% m-V y
se enrasó hasta 100 mL con isobutanol.
Determinación
Se operó según las especificaciones del equipo ajustando el monocromador
primario a 365 nm y el monocromador secundario a 435 nm. Se leyeron los
%Fluorescencia de las soluciones patrones y de la muestra obteniéndose los
siguientes resultados:
mL de la solución
Solución %Fluorescencia
patrón de Tiamina
1 1 15.8
2 1.5 22.1
3 2 46.3
4 2.5 60.5
5 3 73.9
M − 21.5
A. Explique el fundamento general de los métodos fluorimétricos señalando

las transiciones energéticas involucradas.
B. Discuta cuidadosa y detalladamente la función de los reactivos, soluciones
y operaciones subrayadas.
C. Calcule la concentración de Tiamina en el producto analizado. Exprese sus
resultados en mg Tiamina/ 100 g de producto. Emplee para ello el método
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de regresión lineal expresando la concentración de los patrones en g de

Tiamina/mL y en g de Tiamina.
D. Atendiendo a la Ecuación de Regresión y al Coeficiente de Determinación.
Qué puede Ud. opinar sobre la calidad del trabajo realizado y sobre la
procesamiento de los resultados experimentales y la interpretación de los
parámetros obtenidos.
En el caso de que sus resultados no sean confiables, exponga las posibles
causas que condujeron a estos resultados. Proponga una solución práctica
para resolver el problema y, en el caso que sea posible, recalcule la
concentración de Tiamina (mg/100 g) en el producto analizado.
7. Una muestra de Aceite de Oliva resulta sospechosa de encontrarse

adulterada con Aceite de Coco. Para corroborar o rechazar esta sospecha se
decide aplicar un método Refractométrico de análisis.
a. ¿Cómo podría Ud conocer si el Aceite de Oliva se encuentra realmente
adulterado?
b. En el caso de que la sospecha fuera corroborada; describa detalladamente
el procedimiento que Ud emplearía para conocer las proporciones en que
se encuentra cada aceite en la muestra objeto de análisis.
8. Para conocer si el azúcar presente en una solución era sacarosa se decidió

aplicar un método instrumental, él que permitió llegar al siguiente resultado
[α]D20 = + 66.5, concluyéndose que efectivamente era una solución de
sacarosa.
A. Identifique el método aplicado y explique detalladamente su fundamento.
B. Justifique cuidadosamente por qué se pudo aplicar el método en cuestión
para cumplimentar el objetivo del análisis.
C. Para calcular [α]D20, qué datos se necesitan y cómo se obtienen los
mismos?
D. Cómo debió procederse para realizar el análisis anterior en el laboratorio y
llegar a la conclusión expuesta?

9. Estudie cuidadosamente cada una de las técnicas de análisis que a

continuación se relacionan y realice para cada una de ellas un análisis crítico
sobre la base de los siguientes aspectos:
• Explique la función de los reactivos, soluciones, operaciones y parámetros
operacionales utilizados.
• Explique el procesamiento de los resultados para realizar los cálculos
propuestos en los casos que sea pertinente.
• Identifique los elementos que están ausentes en los procedimientos y que
le imposibilitan fundamentar con profundidad algunos aspectos de la
técnica en cuestión.
Técnica 1. Determinación de anhidrido sulfuroso en cerveza
1.1. Principio.
El SO2 se destila en medio ácido y se lleva a una solución tamponada de DTNB
por medio de una corriente de nitrógeno. El producto formado en la reacción se
mide por espectrofotometría.
1.2. Material y aparatos.
1.2.1. Aparato (figura 1.1.), provisto de:
• Matraz de fondo redondo de 250 mL, con tres bocas,
una central y dos laterales en ángulo.
• Embudo de decantación de 100 mL en forma de pera.
• Tubo acodado con macho esmerilado, para entrada de
gases, longitud aproximada de vástago de 150 mL.
• Refrigerante doble superficie, longitud total 300 mL y
longitud útil de 200 mL.
• Bola retención proyecciones, salida inclinada.
• Colector acodado largo.
• Tubo filtrante
Figura 1.1
1.2.2. Espectrofotómetro que permite lecturas a una longitud de onda de 415

nanómetros.
1.3. Reactivos.
1.3.1. Solución Tampón de Fosfato, pH 8,0. Disolver 2,27 g de di-Sodio
Hidrógeno Fosfato anhidro PA-ACS y 0,245 g de Potasio di-Hidrógeno Fosfato PA-
ACS-ISO, ambos pesados en estado anhidro, en 1 l de Agua PA-ACS. Comprobar
el pH y ajustar, si es necesario, con Sodio Hidróxido o un ácido.
1.3.2. DTNB. Disolver 1 g de 5,5’ - Ditiobis (Acido Nitrobenzoico), en una mezcla
de 900 mL de solución tampón y 100 mL de Etanol 96% v/v PA.
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1.3.3. Solución de Acido Clorhídrico, aproximadamente 4 N. Diluir

convenientemente Acido Clorhídrico 35% PA-ISO en Agua PA-ACS.
1.4. Procedimiento.
1.4.1. Una vez montado el equipo de destilación, introducir 50 mL de Acido
Clorhídrico en el matraz de destilación. Calentar durante cinco minutos,
aproximadamente, mientras se hace llegar al interior del matraz una corriente de
nitrógeno. Introducir en el matraz 25 mL de cerveza medidos exactamente.
Recoger el SO2 desprendido en un matraz que contiene 50 mL de reactivo. El
tubo filtrante permanecerá sumergido en la solución durante todo el proceso de
destilación, que se detendrá después de ocho minutos.
Desmontar el tubo filtrante y enjuagar con unos mililitros de solución tampón.
Trasvasar cuantitativamente el contenido del matraz (destilado, reactivo y
solución tampón), a un matraz aforado de 100 mL y enrasar con Agua PA-ACS.
Medir la densidad óptica en una celda de 1 cm de recorrido a una longitud de
onda de 415 nanómetros con relación a un ensayo en blanco recientemente
preparado. El ensayo en blanco se prepara diluyendo 50 mL de reactivo con 50 g
de Solución Tampón.
1.4.2. Determinación de la curva patrón. Preparar soluciones acuosas patrón de
Potasio Bisulfito PA, cuyo contenido de SO2 se habrá determinado previamente
por yodometría, que contengan 2; 5; 10; 15 y 20 mg de SO2 por litro.
Las soluciones patrón se tratan de la misma forma que la cerveza, esto es,
destilándolas previamente.
1.5. Cálculo.
El contenido de SO2 en mg/l vendrá dado por la siguiente fórmula:
SO2 en mg/l = A x f
Siendo:
A = absorbancia medida.
f = factor determinado mediante la curva patrón.
Técnica 2. Determinación de almidón en productos cárnicos

2.1. Principio.
Extracción de azúcares simples con etanol caliente 80%, permaneciendo el
almidón. El residuo de almidón se solubiliza con ácido perclórico diluido, y
medida a 630 nm de color desarrollado al calentarlo con el reactivo antrona-
ácido sulfúrico.
2.2.1. Balanza analítica.

2.2.2. Matraces aforados de 100 mL y 200 mL.

2.2.3. Tubos de centrífuga, cónicos, de 100 mL.
2.2.4. Pipetas graduadas de 10 mL, 25 mL, 5 mL y 2 mL.
2.2.5. Centrífugas de 2.500 r.p.m.
2.2.6. Baño de agua.
2.2.7. Baño de agua termostatable hasta 25°C.
2.2.8. Probeta graduada de 25 mL.
2.2.9. Papel de filtro Albet número 238 o equivalente.
2.2.10. Espectrofotómetro capaz de lecturas de 630 nm.
2.3. Reactivos.
2.3.1. Disolución de Acido Sulfúrico-Antrona. Disolver 0,2 g de Antrona PA-ACS
en 100 mL de Acido Sulfúrico 96% PA-ISO. El reactivo sirve para 3-4 días
conservándolo a 0°C.
2.3.2. Glucosa patrón. Disolver 0,1 g de D(+)- Glucosa PA en 100 g de Agua PA-
ACS
2.3.3. Acido Perclórico al 52%. Diluir Acido Perclórico 60% PA-ACS-ISO en Agua
PA-ACS y ajustar a la concentración indicada.
2.3.4. Etanol al 80%. Diluir Etanol 96% v/v PA en Agua PA-ACS y ajustar a la
concentración indicada.
2.4. Procedimiento.
2.4.1. Extracción de azúcar y de grasa. Pesar 2,0 g de carne triturada, preparada
como en el método 1, en un tubo centrífugo cónico de 100 mL. Añadir 25,0 mL
de disolución Etanol-Eter de Petróleo 50-70°C PA (1-3), tapar con un tapón,
agitar vigorosamente y centrifugar a 2.500 r.p.m. durante cinco minutos.
Decantar y dejar a un lado la disolución Etanol-Eter de Petróleo 50-70°C PA.
Añadir 10 mL de etanol caliente al 80%, agitar y centrifugar a 2.500 r.p.m.
durante cinco minutos. Dejar a un lado la disolución alcohólica y repetir la
extracción alcohólica con Etanol caliente.
2.4.2. Extracción de Almidón. Añadir 5,0 mL de Agua PA-ACS al residuo y
remover. Añadir 6,5 mL de disolución de Acido Perclórico diluido (52%); remover
o agitar durante cinco minutos. Dejar reposar durante quince minutos. Añadir
20,0 mL de Agua PA-ACS y centrifugar durante cinco minutos.
Verter la disolución de Almidón en un frasco volumétrico de 100 mL. Añadir 6,5
mL de disolución de Acido Perclórico (52%) y remover. Dejar reposar durante
treinta minutos. Remover y lavar el contenido entero del tubo en el frasco
volumétrico que contiene el primer extracto. Llevar a volumen y filtrar por papel
filtro.
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2.4.3. Determinación de Almidón. Diluir 5 mL de disolución de almidón filtrada en

200 mL con Agua PA-ACS. Pipetar 5 mL de dicha disolución en un tubo, enfriar
en baño de agua y añadir 10 mL de Antrona reactivo (2.3.1.). Mezclar
completamente y calentar durante cinco minutos a 100°C. Quitar el tubo del
baño, enfriar con rapidez a 25°C y determinar la absorbancia a 630 nm. El color
permanece fijo durante treinta minutos.
2.5. Cálculo.
2.5.1. Curva patrón de glucosa. Diluir 1,2, 5 y 10 mL de glucosa patrón (2.3.2.)
hasta 100 mL con agua destilada. A partir de las lecturas obtenidas dibujar la
curva patrón.
2.5.2. Contenido en almidón de la muestra:
Glucosa (porcentaje) = 0,04 P
Almidón (porcentaje) = 1,06 M
Siendo:
P = µg de glucosa leídos en la curva patrón.
M = porcentaje total de glucosa obtenido.
2.6. Observaciones.
2.6.1. Teniendo en cuenta que el carragenato se determina como almidón, se
deberá deducir del valor obtenido de almidón el correspondiente de carragenato.
2.6.2. En los productos que declaren contener carragenato y hasta que no exista
técnica oficial para su determinación cuantitativa se permitirá una tolerancia del
1,4% en el valor obtenido de almidón.
2.6.3. Cuando la naturaleza de la muestra lo requiera se podrán repetir las
extracciones hasta que el producto quede completamente libre de grasas y
azúcares.
Técnica 3. Determinación de cobre en pastas alimenticias

3.1 Principio.
Determinación del cobre por A.A. previa mineralización de la muestra.
3.2.1. Espectrofotómetro de A.A.
3.2.2. Lámpara de cobre.
3.2.3. Cápsula de platino, cuarzo o similar.
3.2.4. Baño de arena o placa calefactora.
3.2.5. Horno eléctrico (mufla) con dispositivo de control de temperatura.

3.3. Reactivos
3.3.1. Acido Nítrico 70% PA-ACS-ISSO (d=1,413).
3.3.2. Acido Nítrico al 1% en Agua PA-ACS (v/v). Diluir Acido Nítrico 70% PA-
ACS-ISO con Agua PA-ACS, hasta la concentración indicada.
3.3.3. Cobre solución patrón Cu = 1,000 ±0,002 g/l AA.
3.4. Procedimiento.
3.4.1. Preparación de la muestra. Preparación de la muestra. Poner 10 g de la
muestra en la cápsula, llevar sobre la placa calefactora teniendo cuidado que la
combustión no sea demasiado rápida de manera que no haya pérdidas de
materia sólida por proyección.
Añadir a continuación 2 mL de Acido Nítrico 70% PA-ACS-ISO y carbonizar el
residuo en el baño de arena o placa calefactora.
Seguidamente introducir la cápsula en la mufla y mantenerla a 450°C hasta
mineralización total. Dejar enfriar. Disolver a continuación las cenizas con Acido
Nítrico 70% PA-ACS-ISO y Agua PA-ACS. Llevar la solución a un matraz de 10
mL, lavar la cápsula con Agua PA-ACS y añadir las aguas de lavado hasta el
enrase, filtrando posteriormente.
3.4.2. Construcción de la curva patrón. Diluir parte alícuota de la solución patrón
(3.3.3.) con Acido Nítrico del 1% para obtener soluciones que contengan de 1 a
5 mg de Cu/l.
3.4.3. Determinación. Igual que para el plomo. Operar según las especificaciones
del aparato; usando llama de aire-acetileno. Medir las absorbancias de la
muestra y patrones a 324,7 nm. Si la solución está muy concentrada diluirla con
Acido Nítrico al 1%.
3.5 Cálculos.
Partiendo de los valores de absorbancia obtenidos para la muestra, hallar
mediante la curva patrón las concentraciones de cobre de la muestra.
Técnica 4. Determinación de potasio en zumo de uvas

4.1. Principio.
El potasio se determina por fotometría de llama previa adición de litio cloruro,
para evitar la ionización parcial de los metales en la llama.
4.2.1. Espectrofotómetro de absorción atómica.
4.2.2. Material de uso normal en laboratorio.
4.3. Reactivos.
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4.3.1. Potasio solución patrón K = 1,000 ± 0,002 g/l AA o preparar disolviendo

1,907 g de Potasio Cloruro PA-ACS-ISO en un litro de Agua PA-ACS.
4.3.2. Solución de Litio Cloruro: Disolver 37,3 g de Litio Cloruro PRS en 100 mL
de Agua PA-ACS.
4.3.3. Soluciones de Potasio de 0; 1; 2; 3; 5 y 7 mg/l preparadas a partir de la
solución de Potasio, previa adición de la cantidad necesaria de Litio Cloruro PRS,
para que el Litio se encuentre en una proporción de aproximadamente 2.000
mg/l.
4.4. Procedimiento.
Tomar 1 mL de la muestra y llevar a 200 mL con Agua PA-ACS (previa adición de
la cantidad necesaria de Litio Cloruro PRS para que el Litio se encuentre en una
proporción de aproximadamente 2.000 mg/l), leyéndose en fotometría de llama
frente a las soluciones de referencia a 766-770 nm.
4.5. Cálculos.
El contenido de potasio se calcula a partir del valor obtenido en el
espectrofotómetro por comparación con la curva patrón, teniendo en cuenta la
dilución efectuada. Los resultados se expresan en mg de Potasio/ 100 mL de la
muestra.
4.6. Observaciones.
Puede utilizarse una solución de 40 g/l de cloruro de cesio en lugar de cloruro de
litio, siendo en este caso la concentración adecuada de cloruro de cesio en las
disoluciones de la muestra y patrones entre 0,1-0,4%.
10. Los Tiouracilos son compuestos con actividad antitiroidea que pueden llegar
al ganado a través de los pastos. La determinación de estas sustancias en
Carnes y Productos Cárnicos reviste gran importancia y se realiza
empleando una técnica de Cromatografía en Columna.
El fundamento general de la metodología seguida para el análisis es el
siguiente:
Extracción del antitiroideo con alcohol metílico, evaporación del disolvente,
dilución con agua y purificación con eter etílico. Evaporación del extracto
acuoso hasta sequedad, posterior disolución en una mezcla Cloroformo -
Alcohol Metílico (1:1) y Cromatografía en Columna de Oxido de Aluminio
(Al2O3) eluyendo con mezcla Triclorometano - Alcohol Metílico (1:1).
Se aplicaron a la columna 30 mL del extracto de tioracilos obtenido y luego
se hizo pasar por la columna 30 mL de la mezcla Triclorometano - Alcohol
Metílico (1:1). Se desecharon los primeros 8 mL y el resto se recogió en un
balón de boca esmerilada. Se evaporó a sequedad el contenido del matraz en
rotoevaporador a 60°C, con ayuda de vacío, y se recogió el residuo de la

evaporación en 20 mL de una .solución tampón pH 7,6, se añadieron 2 mL

de solución de Dicloroquinona- Clorimida, se agitó 20 segundos y se dejó
reposar 20 minutos. Finalmente se leyó la absorbancia a 435 nm.
Nota: La actividad del Al2O3 fue controlada a través de un ensayo de
recuperación con una solución patrón de Tiouracilo, cromatografiando 10
mL de la misma, con el empleo de idéntica Fase Móvil y Estacionaria. El
eluato obtenido se hizo reaccionar con Dicloroquinona-Clorimida y al
complejo coloreado resultante se le midió la absorbancia a 435 nm.
Paralelamente se desarrolló el color bajo las mismas condiciones a 10 mL de
solución patrón de Tiouracilo no cromatografiada y se midió su absorbancia a
la misma longitud de onda. En ambos casos las absorbancias obtenidas
fueron idénticas.
A. Explique el principio químico físico en el cual se fundamenta esta
separación.
B. Explique cuidadosamente la función de las soluciones y operaciones
subrayadas.
C. Describa detalladamente el procedimiento a seguir para cuantificar estos
antitiroideos.
11.La determinación del contenido de cafeína en té se realiza aplicando un

método de cromatografía en columna, con previa extracción del analito a
partir de la matriz molida y en presencia de MgO. Posteriormente se filtra y se
realiza una dilución para obtener la solución de muestra a cromatografiar, que
en muchos casos puede presentar también mínimas cantidades de otros
alcaloides. Se introducen 10 mL de muestra en una columna cromatográfica
empacada con fase reversa. Posteriormente se hace pasar a través de la
columna una mezcla metanol:agua en proporción inicial 1:1 y se va
incrementando la cantidad de metanol hasta alcanzar una proporción 3:1, lo
cual se logra a los 30 minutos de corrida.
A. Explique el principio químico físico en el cual se fundamenta esta

separación.
B. ¿Qué tipo de elución se llevó a cabo?
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C. ¿Cómo se realiza la recogida de los eluatos y cómo podría Ud detectar

las fracciones correspondientes a los alcaloides luego de la separación
cromatográfica? Fundamente cuidadosamente su respuesta.
D. Dibuje el cromatograma obtenido conociendo que lograron separarse 3
alcaloides y que su polaridad disminuye en el siguiente orden: cafeína >
alcaloide 2 > alcaloide 1. Se sabe además que la concentración de los
mismos en el extracto cromatografiado aumenta en orden inverso.
E. Describa detalladamente el procedimiento a seguir para cuantificar la
cafeína. Asuma que los resultados deben expresarse en g/mL.
12.La determinación de Ácido Láctico en una muestra de vino de uvas se

fundamenta en el siguiente principio:
Aislamiento del Acido Láctico en una columna empacada con resinas
intercambiadoras de aniones, oxidación a acetaldehído y medición
espectrofotométrica del complejo coloreado formado por la reacción con la
Piridina.
Para realizar el análisis se toman 10 mL del vino y se hacen pasar a través de
una columna cromatográfica empacada con una resina Lewatit MP 600
fuertemente aniónica, la cual ha sido previamente lavada 4 veces con
solución de Acido Acético 0.5% m-V.
Una vez aplicada la muestra, la columna es nuevamente lavada 7 veces con
10 mL de agua destilada cada vez, desechándose los eluatos obtenidos, y
posteriormente se hace pasar a través de la misma una solución de Sulfito de
Sodio (Na2SO3) 0.5 N, recogiéndose ahora el eluato en un volumétrico hasta
un volumen de 50 mL.
Terminada esta operación, se toma del matraz una alícuota de 10 mL y se
vierte en un tubo de ensayo al que se añaden 10 mL de Sulfato de Cerio IV;
se coloca el tubo en baño termostatado a 65 ºC durante 10 minutos y el
acetaldehído producido se hace reaccionar con solución de Piridina al 10%. Al
complejo violeta formado se le mide la absorbancia a una = 570 nm.
A. Mencione y explique cuidadosamente el mecanismo de separación en el
cual se fundamenta el aislamiento del Acido Láctico, previo a la
determinación espectrofotométrica. Tenga en cuenta para su explicación la
función de los reactivos, soluciones y operaciones subrayadas:
B. ¿Por qué cree Ud que la medición espectrofotométrica se realizó a una =
570 nm? Justifique cuidadosamente su respuesta considerando el
fundamento del método empleado y las transiciones energéticas
involucradas. ¿Cómo pudo ser determinado experimentalmente este valor
de ? Represéntelo gráficamente.

C. A través de qué procedimiento podría Ud cuantificar el Ácido Láctico

aislado del vino. Explique cuidadosamente los pasos a seguir para
cumplimentar dicho objetivo incluyendo el procesamiento estadístico de
los resultados.
D. A través de qué método o métodos espectroscópicos pudiera detectarse la
presencia de Sodio y Potasio en el vino objeto de análisis. Fundamente su
respuesta considerando:
▪ Fundamento del método. Ventajas e inconvenientes de su aplicación.
▪ Preparación de la muestra.
▪ Procedimiento de identificación empleado.
13.Las aminas biógenas, entre ellas la histamina y la tiramina, pueden ser

encontradas en pescados y quesos, entre otros alimentos. Estas aminas son
productos de la descarboxilación de aminoácidos libres y su determinación es
importante debido a su alta toxicidad y a que evidencian la existencia de
actividad bacteriana que en la mayoría de los casos no es deseada.
Para determinar la presencia y concentración de aminas en un lote de queso
se aplicó la técnica de HPLC a un extracto obtenido de la matriz, utilizando las
siguientes condiciones cromatográficas:
• Volumen de inyección: 10 L.
• Columna Spherisorb ODS 2 - C-18. (5 m), 250 mm x 4 mm
• Elución con Acetonitrilo-Metanol (1:1).
• Velocidad de flujo: 1.5 mL/min.
• Detector: UV-VIS con arreglo de diodos.
En el análisis fue necesario, según el analista, obtener cromatogramas de
soluciones patrones de diferentes aminas a concentraciones de 1mg/mL. Los
tiempos de retención (Tr) obtenidos para cada uno de los patrones
inyectados fueron: Histamina (15 min), Triptamina (8.5 min), Tiramina (18
min) y  feniletilamina (10 min); realizándose la detección a 254 nm.
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A. Justifique cuidadosa y profundamente la necesidad de obtener los

cromatogramas de estos patrones atendiendo a los objetivos del análisis.
B. Explique detalladamente el mecanismo físico-químico en el cual se
fundamenta la separación de las aminas presentes en el queso.
C. Justifique lo más profundamente posible por qué pudo emplearse un
detector UV para realizar la detección de las aminas. Apóyese en el
principio en que se fundamenta la detección, en las estructuras de las
sustancias y en sus características espectroscópicas fundamentando las
transiciones energéticas involucradas.
HO
(CH2)2 NH2 (CH2)2 NH2
N TRIPTAMINA  FENILETILAMINA
H
N (CH2)2 NH2
HO (CH2)2 NH2
N HISTAMINA
H TIRAMINA
El análisis se llevó a cabo ensayando 2 longitudes de onda en el detector (254

nm y 280 nm), obteniéndose los siguientes resultados:
Para  = 254 nm Para  = 280 nm

Pico Tr (min) Area Pico Tr (min) Area
1 8.50 125 1 8.50 214
2 10.0 254 2 15.0 91
3 15.0 100 3 18.0 164
4 18.0 412
D. Fundamente detalladamente las diferencias obtenidas en las condiciones
ensayadas, sobre la base del número de picos obtenidos, los tiempos de
retención y las áreas resultantes para cada componente. Sobre la base
del análisis realizado: A qué valor de  realizaría usted la detección si
desea obtener buenos resultados?
E. Identifique las aminas presentes en el queso analizado y arribe a
conclusiones sobre el orden de polaridad de las mismas. Fundamente
cuidadosamente su respuesta.
F. Proponga un procedimiento para cuantificar la tiramina explicando
cuidadosa y detalladamente los pasos para cumplimentar dicho objetivo.
Incluya en su análisis el procesamiento matemático de los resultados y la

utilidad que de este procesamiento se deriva. Considere que los

resultados deben expresarse en mg de tiramina/ 100 g de queso.
G. Analice las posibles afectaciones (aumenta, disminuye o no se afecta) que
provocarían cada una de las siguientes modificaciones sobre los tiempos
de retención, la resolución del cromatograma y el área bajo la curva de
los picos obtenidos.
• Utilizar un sistema de solventes Tetrahidrofurano:Metanol (3:1)
• Disminuir la velocidad de flujo a 1 mL/min
• Utilizar una columna cromatográfica Spherisorb ODS 2 - C-18. (10
m), 200 mm x 4 mm.
• Inyectar 5 L
• Utilizar un detector de índice de refracción
Fundamente cuidadosamente su respuesta teniendo en cuenta los factores
que afectan la eficiencia de una columna cromatográfica. Tenga en cuenta
que la polaridad de los solventes más empleados en HPLC es la siguiente:
Tetrahidrofurano < Acetonitrilo < Metanol < Agua
H. En la literatura se reporta que para el análisis de aminas biógenas puede
también emplearse la cromatografía gas-líquido. Señale las condiciones
de trabajo que se necesitan definir para su aplicación y explique su
función en el análisis.
14.Las Aflatoxinas (G1, G2, B1 y B2) son productos metabólicos del hongo
Aspergillus flavus, el cual puede contaminar alimentos como el maní y los
cereales fundamentalmente. Estos compuestos son potentes carcinógenos
(producen cáncer) del hígado, de ahí la importancia de su detección en los
alimentos, la cual puede realizarse por Cromatografía Líquida de Alta
Resolución (HPLC), empleando las siguientes condiciones:
• Columna: Bondapak RP-8
• Sistema de solventes: Acetonitrilo : Agua (10:90)
• Volumen de inyección: 10 L
• Velocidad de flujo: 1 mL/min
• Detector fluorométrico 365 nm.
Para aplicar la técnica de HPLC se requiere realizar un tratamiento previo a la
muestra con Ácido Trifluoracético para que puedan ser detectadas G 1 y B1. El
cromatograma obtenido fue el siguiente:
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y las áreas bajo la curva obtenidas para cada pico fueron: G 1 (312), B1 (411),
G2 (335) y B2 (526).
A. Analice la afinidad de cada Aflatoxina por la fase estacionaria y arribe a
conclusiones acerca de la polaridad de estos componentes.
B. La derivatización de la muestra fue necesaria para detectar 2 de las
Aflatoxinas. Explique el fenómeno físico químico en que se fundamenta
dicha detección.
C. En la cuantificación de Aflatoxina B 1 se empleó un procedimiento que
arrojó los siguientes resultados:
Concentración de Aflatoxina B1 Area

10 g/L 193
20 g/L 315
40 g/L 555
60 g/L 789
80 g/L 1091
Explique cuidadosamente la vía de cuantificación empleada indicando las

condiciones cromatográficas que deben emplearse para acometer el
análisis. Calcule la concentración de Aflatoxina B 1 en la mezcla inyectada y
arribe a conclusiones sobre la confiabilidad de sus resultados.
D. Si al aplicar HPLC no se obtiene una buena resolución de la mezcla.
¿Cuáles de las siguientes operaciones pudieran, a su entender, solucionar
el problema? Justifique cuidadosamente su selección.
▪ Disminuir el tamaño de partículas del empaque de la columna.
▪ Disminuir la longitud de la columna
▪ Variar la composición de la fase móvil.
▪ Disminuir el volumen de inyección
▪ Aumentar la velocidad de flujo.
▪ Utilizar un detector UV con arreglo de diodos.
▪ Variar el régimen de elución durante el análisis.
▪ Aumentar la sensibilidad del detector
15.En el análisis de la composición en Acidos Grasos del Aceite de Salvado de

Arroz, se decidió aplicar un método de Cromatografía Gaseosa para lo cual
fue necesario primeramente hidrolizar los Acilglicéridos y luego derivatizar
los Acidos Grasos Libres para analizarlos en forma de Esteres Metílicos. Las
condiciones cromatográficas empleadas así como el cromatograma obtenido
se muestran a continuación:
Columna = 2 m x 4 mm empacada sobre soporte DC-200 / Temperatura de la

columna = 190oC / Velocidad de Flujo = 25 mL/min / Volumen de inyección =
10 L / Detector = Conductividad Térmica.
A. Que parámetros cromatográficos usted variaría para mejorar la resolución
del cromatograma obtenido. Fundamente cuidadosamente su respuesta.
B. Una vez mejorada la resolución del cromatograma ¿Cómo procedería Ud
para identificar el Acido Graso correspondiente al pico 5?
C. Suponiendo que el pico No 5 se corresponde con el Ácido Linoleico.
Explique detalladamente cómo procedería para cuantificar el mismo si
decide aplicar el método del patrón interno. Mencione además la ventaja
de este procedimiento de cuantificación en comparación con una curva de
calibración.
D. Teniendo en cuenta que el resto de los ácidos grasos identificados en el
cromatograma fueron: palmítico, oleico, linolénico, esteárico, araquídico,
araquidónico y palmitoleico. Explique detalladamente a través de qué
procedimiento podría Ud determinar en qué proporción se encuentra el
ácido palmítico en la mezcla cromatografiada.
16.En un estudio para identificar y cuantificar los diferentes monómeros que

forman parte de los polisacáridos que componen la fibra alimentaria en varios
productos vegetales, se decidió aplicar un método de cromatografía de gases.
El proceso en cuestión consta de tres etapas, las cuales se describen a
continuación:
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• Aislamiento de la fibra alimentaria: Partiendo de una cantidad de

muestra, exactamente pesada, entre 200 y 300 mg, el aislamiento de la
fibra se realiza aplicando un tratamiento previo con dimetilsulfóxido
(DMSO) para gelatinizar el almidón. A continuación se procede a una
hidrólisis enzimática con -amilasa y pululanasa, en tampón fosfato a pH
5,2 por 16 horas. Finalizada la incubación se filtra, eliminando el filtrado y
lavando el residuo de forma secuencial y sucesiva con etanol absoluto,
etanol 85% V-V y acetona. Finalmente el residuo se deseca en estufa.
• Hidrólisis de los polisacáridos que componen la fibra alimentaria:
La hidrólisis se realiza en dos etapas con ácido sulfúrico. La primera,
denominada hidrólisis primaria, se lleva a cabo añadiendo al residuo 2 mL
de ácido sulfúrico 12 M y calentando a 35ºC durante 1 hora con agitación.
A continuación, la hidrólisis secundaria se lleva a cabo añadiendo 22 mL de
agua y calentando a 100ºC durante 2 horas agitando igualmente.
• Separación y cuantificación de los monosacáridos: A una alícuota del
hidrolizado ácido se añade mio-inositol como patrón interno y los
monosacáridos son transformados en acetatos de aditol para su análisis
por cromatografía de gases con las siguientes condiciones
cromatográficas:
− Gas portador: Helio
− Volumen de inyección 25 L
− Temperatura del inyector: 250ºC
− Columna de sílice fundida 30 m x
0.32 mm.
− Temperatura de la columna: 250ºC
− Flujo: 1mL/min
− Detector: Ionización de llama (FID)
− Temperatura del detector: 275ºC
El orden de elución de los
monosacáridos y el patrón interno,
según se indica en la figura, fue:
ramnosa, arabinosa, xilosa, m-inositol,
manosa, glucosa y galactosa.
A. Discuta cuidadosamente la función de los reactivos, soluciones y
operaciones subrayadas.
B. Explique el fenómeno químico físico en el cual se fundamenta la
separación cromatográfica y la detección de los azúcares separados.
C. Explique mediante que procedimiento pudieron ser identificados los
compuestos cromatografiados.

D. Explique cuidadosamente el procedimiento seguido en este estudio para la

cuantificación de los azúcares separados. Tenga en cuenta que solo se
realizó otra corrida cromatográfica.
E. Explique qué modificaciones usted introduciría en los parámetros
cromatográficos con vistas a disminuir los tiempos de retención de los
últimos 4 picos sin afectar la resolución del cromatograma. Fundamente
F. Analice las posibles afectaciones que provocarían cada una de las
siguientes modificaciones sobre los tiempos de retención, la resolución del
cromatograma y el área bajo la curva de los picos obtenidos.
− Utilizar una columna empacada (2 m x 4.2 mm)
− Inyectar 10 L de muestra
− Emplear una velocidad de flujo de 0,5 mL/min
− Cambiar la temperatura de la columna a 270ºC
− Utilizar un detector de conductividad térmica
− Utilizar un detector de captura de electrones.
G. La determinación del ácido galacturónico, componente principal de las
sustancias pécticas, se realiza por un método espectrofotométrico. Para
ello se toma una alícuota del hidrolizado ácido y se completa la hidrólisis
de las sustancias pécticas por adición de ácido sulfúrico concentrado
durante 4 horas a 70ºC. Posteriormente se adiciona 2,5 dimetilfenol y se
mide la absorbancia a 450 nm.
− Explique el fundamento del método espectrofotométrico seleccionado
incluyendo en su análisis la necesidad de añadir 2,5 dimetilfenol.
− Describa cuidadosamente un procedimiento para realizar la
cuantificación del ácido galacturónico.
17.El siguiente cromatograma es el resultado del desarrollo de una

cromatografía en capa precubierta activada de Sílica gel HF 254 (Fluorescente)
en la que se aplicaron 10 L de 3 soluciones (una de muestra y dos de
patrones) con el objetivo de conocer la posible degradación del
Ergocalciferol (vitamina D2), el cual brinda como producto de degradación
el Ergosterol (compuesto más polar que la vitamina D2). Para el análisis se
utilizó el sistema de solventes: ciclohexano-eter etílico (50:50) y una
lámpara UV (254 nm).
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A B C
A. Identifique la FM y la FE.
B. ¿Que tipo de revelado se utilizó?
C. Mencione el fenómeno físico químico en el cual se basa esta separación
y diga como clasifica Ud la cromatografía desarrollada, atendiendo a los
objetivos perseguidos.
D. Identifique cada una de las manchas obtenidas en el Cromatograma,
justificando cuidadosamente su selección.
18.Para la identificación de aminoácidos en plasma sanguíneo se utiliza la

Cromatografía en Capa Delgada de Alta Resolución. Las muestras de sangre
se centrifugan y se cromatografía el líquido sobrenadante. Después de un
segundo desarrollo con butanol: acetona: ácido acético: agua (35:35:7:23),
la placa se sumerge en una solución de Ninhidrina y se calienta
posteriormente a 80 C. Para el análisis se utilizaron placas precubiertas de
o
HPTLC de celulosa y patrones de aminoácidos, aplicándose en todos los

casos volúmenes de 2 L.
A. Explique cuidadosamente el principio cromatográfico que se aplica en
este análisis, señalando la Fase Móvil y la Fase Estacionaria.
B. ¿Qué forma de desarrollo se empleó?
C. ¿Qué tipo de revelado se utilizó?
D. ¿Cómo se realiza la identificación requerida en este análisis?
E. Si Ud quisiera cuantificar el aminoácido Fenilalanina, presente en el
plasma sanguíneo, empleando una técnica densitométrica sobre placas
de HPTLC, describa cuidadosamente el procedimiento análitico a utilizar
para realizar la cuantificación y dibuje aproximadamente los
densitogramas resultantes.
19.En un estudio sobre la incidencia de la variedad botánica de la naranja en la

calidad nutricional y sensorial de su jugo se trazaron dos objetivos generales:
• Determinación de la composición y concentración de los azúcares solubles
totales presentes en el jugo.
• Determinación de la composición en aceites esenciales y del contenido de

cada uno de ellos.
A. Para conocer la composición de los azúcares solubles totales del jugo así
como la concentración de cada uno de ellos se realizó una dilución 1:10
de la matriz y se aplicaron los métodos cromatográficos de CCD y HPLC
con las siguientes condiciones.
CCD
• Capa de sílicagel (10x20 cm), espesor 0,3 mm
• Fase móvil: nbutanol:ácido acético: agua destilada (8:3:3)
• Volumen de aplicación: 5 L
• Técnica de desarrollo: Ascendente, hasta 13 cm
• Detección: Rociar uniformemente con solución de ácido
tricloroacético-ácido ftálico-ácido p-aminohipúrico en etanol, calentar
a 135C durante 15 minutos.
• Cuantificación: Mediante un densitómetro.
HPLC
• Fase estacionaria: Bondapack (5m) para análisis de hidratos de
carbono en fase normal
• Dimensiones de columna: 20x0.46 cm
• Velocidad de flujo: 1,5 mL/min.
• Detector: Refractométrico.
Para ambos métodos cromatográficos se preparan soluciones de diferentes
concentraciones de patrones de los azúcares.
A-1. Teniendo en cuenta las condiciones de la CCD, explique los pasos
dados por el analista para el desarrollo del análisis.
A-2. Si después de desarrollada la CCD se observa que 2 solutos presentes
en la muestra no se separaron correctamente, explique 2 variantes
que puedan mejorar la resolución del análisis, justificando las
condiciones cromatográficas.
A-3. Explique detalladamente cómo se realiza la cuantificación de los
azúcares separados por CCD mediante la utilización del densitómetro.
A-4. Explique detalladamente cómo debió realizar el analista la
identificación de los azúcares presentes en el jugo cuando aplicó
ambos métodos cromatográficos.
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A-5. Ambos métodos cromatográficos arrojaron que los azúcares presentes

en todos los jugos fueron: sacarosa, fructosa y glucosa y en el análisis
por HPLC, los tiempos de retención de los mismos fueron 9.40, 6.73 y
7.48 minutos respectivamente. Con esta información y teniendo en
cuenta las condiciones en que se desarrollaron la CCD y la HPLC,
ordene de forma creciente cómo serían los valores de los Rf de dichos
azúcares en la CCD. Justifique cuidadosamente su respuesta.
B. La composición del aceite esencial y el % de cada componente en el mismo se
conocieron con la aplicación de la Cromatografía Gas Líquido. Los análisis
arrojaron que, en todos los casos, el limoneno es el componente mayoritario
del aceite esencial. Para conocer su concentración en mg/mL se aplicó la vía
de cuantificación de patrón interno para lo cual se realizaron 6 corridas
cromatográficas adicionales.
B.1. Explique cuidadosamente el procedimiento de cuantificación empleado.
Incluya en su análisis el procesamiento estadístico de los resultados y la
utilidad que de este procesamiento se deriva.
B.2. ¿Cree Ud acertada la decisión del analista de realizar la cuantificación
empleando este procedimiento? Fundamente cuidadosamente su
respuesta.
B.3. Mencione 5 condiciones cromatográficas que deben fijarse para la
realización del análisis y explique como inciden 3 de ellas en la eficiencia
de separación de los componentes de la mezcla en Cromatografía Gas
Líquido. Fundamente cuidadosamente su respuesta.
14.2. PROBLEMAS INTEGRADORES

1. En un estudio del valor nutricional del salvado de arroz con vistas a su empleo
en la elaboración de productos horneados se desea determinar la composición
y concentración de cada uno de los aminoácidos presentes en el producto,
para lo cual se decide aplicar el método de cromatografía líquida de alta
resolución (HPLC), procediéndose según la siguiente técnica operatoria:
Pese con exactitud alrededor de 10 g de muestra y determine el % de
humedad. A partir de la muestra seca, pese con exactitud una masa que
contenga alrededor de 5 mg de proteínas, transfiera cuantitativamente a un
tubo de vidrio de 13x100 mm y adicione 4 mL de HCl 6N, colocando el tubo
en un sistema adecuado que permita el reflujo durante 24 horas.
Posteriormente, evapore a sequedad a 80 C a presión reducida en un
o
rotoevaporador y luego redisuelva con 4 mL de ácido acético al 10%,

garantizando que el pH de la solución deberá encontrase entre 2 y 2.5.
Transfiera cuantitativamente la muestra redisuelta en ácido acético a una
columna empacada con resina Dowex 50 X-8 de intercambio catiónico,
previamente tratada (equilibrada) con HCl 1N). Lave la columna, con tres
porciones de 10 mL de cada uno los siguientes solventes: hexano, acetona,

metanol y agua desionizada. En cada uno de los eluatos hasta aquí obtenidos
efectúe la prueba de la ninhidrina. En ninguno de los casos este ensayo debe
dar coloración alguna. Finalmente, eluya los aminoácidos con 10 mL de
NH4OH 7N.
Evapore a sequedad en el rotoevaporador el producto eluido con NH 4OH y

redisuelva con 4.5 mL de K2HBO3 al 1% a pH= 9. Añada 5 mL de una solución
de Cloruro de Dansilo recién preparada, y caliente 90 minutos a 50 oC en
ausencia de luz, seque en el rotoevaporador y disuelva en 10 mL del
diluyente para el producto dansilado (9.8 mL de Metanol grado UV + 0.2 mL
de HCl 1N).
La reacción que tiene lugar es la siguiente:
Inyecte 20 L del producto dansilado en el HPLC, previa filtración por una

membrana Milipore con un diámetro de poro de 0.45 micras.
Las condiciones cromatográficas serán las siguientes:
• Columna empacada con Lichrosorb C-18, 5m (4.6 mm x 250 mm).
• Velocidad de flujo: 1.2 mL/min
• Elución con Acetonitrilo:Agua (3:1)
• Detector ultravioleta a 254 nm.
A. Discuta cuidadosa y detalladamente la función de los reactivos, soluciones,
operaciones y condiciones subrayadas.
B. ¿Por qué pudo emplearse un detector UV a una = 254 nm para realizar la
detección en HPLC? Fundamente cuidadosa y detalladamente su respuesta
incluyendo el principio en que se fundamenta la detección, las
características espectroscópicas de las especies cromatografiadas y las
transiciones energéticas involucradas.
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C. Explique cuidadosamente mediante que procedimiento cree Ud que

pudieron identificarse los aminoácidos presentes en la mezcla
cromatografiada.
D. Explique cuidadosa y detalladamente los pasos que usted daría para
realizar la cuantificación de uno de los aminoácidos separados empleando
el procedimiento de curva de calibración. Incluya en su análisis el
procesamiento matemático de los resultados y la utilidad que de este
procesamiento se deriva.
E. Analice las posibles afectaciones (aumenta, disminuye o no se afecta) que
provocarían cada una de las siguientes modificaciones sobre los tiempos
de retención, la resolución del cromatograma y el área bajo la curva de los
picos obtenidos.
• Elución con Tetrahidrofurano:Agua (3:1)
• Elución con Metanol:Agua (2:1)
• Aumentar la velocidad de flujo a 2 mL/min
• Inyectar 30 L de muestra
• Utilizar una columna empacada con Lichrosorb C-18, 10m (4.9 mm
x 200 mm)
• Utilizar un detector UV a 265 nm.
• Utilizar un detector de índice de refracción
Fundamente cuidadosa y detalladamente sus respuestas. Tenga en cuenta
que la polaridad de los solventes más empleados en HPLC es la siguiente:
Agua > Metanol > Acetonitrilo > Tetrahidrofurano
F. Proponga un método espectroscópico para determinar la cantidad de
Hierro presente en el salvado objeto de estudio. Fundamente su respuesta
considerando.
• Fundamento del método y su relación con el componente a
cuantificar.
• Preparación de la muestra y objetivo que persigue.
• Procedimiento de cuantificación a través del método del patrón
externo explicando por qué es posible aplicar el mismo.
2. El BIOFORTE, alimento para regímenes especiales, es un polvo elaborado a

partir de sangre entera de cerdo, azúcar, ácido ascórbico y sabor a cola, y se
consume como bebida instantánea. Entre las investigaciones realizadas antes
de su aprobación para el consumo humano se encuentran:
• Detección y cuantificación de vitaminas del complejo B
• Composición en ácidos grasos
La detección y cuantificación de las vitaminas del complejo B, se realizó a

partir de un extracto acuoso de las mismas, aplicando HPLC con las siguientes
condiciones cromatográficas:
− Columna Nova Pa/2 ODS, 5m (4.6 mm x 200 mm)

− Fase móvil: Agua: Acetonitrilo: (60: 40)
− Volumen de inyección: 50 L
− Flujo: 1 mL/min
− Detectores: [1] UV 254 nm
[2] Fluorométrico ( excitación= 295 nm,  emisión= 400 nm)
NOTA: ODS son las siglas de Octadecilsilano (Si-(CH2)17-CH3)
Al realizar la cromatografía de una mezcla de patrones de B 1, B2, B6 y ácido
m-hidroxibenzoico como patrón interno (PI); con el detector [1] se obtuvieron
3 picos identificados como B1, B2 y PI, y con el detector [2] se obtuvieron
solamente 2 picos: B6 y PI.
A. Justifique cuidadosa y profundamente los resultados obtenidos sobre la
base del principio físico químico en que se basa cada detector y las
características estructurales de los componentes objeto de análisis,
señalando las transiciones energéticas involucradas y teniendo en cuenta
además las  de trabajo en cada caso. Incluya en su análisis la explicación
de por qué no se obtuvieron 4 picos en ninguno de los casos.
Los tiempos de retención obtenidos en las corridas cromatográficas para cada

componente fueron: B1 (10 min), B2 (12 min), B6 (4 min) y PI (7 min).
B. Organice en orden de polaridad los componentes cromatografiados.
Justifique su respuesta sobre la base del principio físico químico que rige la
separación y las condiciones cromatográficas empleadas que determinaron
el orden de elución.
C. Explique cuidadosa y detalladamente los pasos que usted daría para
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realizar la cuantificación de la vitamina B 6 empleando el procedimiento de

Patrón Interno. Incluya en su análisis la explicación del procesamiento
matemático de los resultados y la utilidad que de este procesamiento se
deriva.
D. Si al aplicar HPLC no se obtiene una buena resolución de la mezcla.
¿Cuáles de las siguientes modificaciones pudieran, a su entender,
solucionar el problema? Justifique cuidadosamente el efecto de cada una
de las nuevas condiciones, aun cuando la misma no mejore la resolución.
• Utilizar una columna empacada con Nova Pa/2 ODS, 10 m (4.6 mm x

150 mm).
• Emplear una velocidad de flujo de 1.5 mL/min.
• Utilizar un detector de índice de refracción.
E. A partir de la grasa extraída al producto se obtuvieron los ésteres metílicos
de los ácidos grasos presentes en la misma, los cuales se determinaron
por cromatografía gas-líquido. Algunas de las condiciones de trabajo
empleadas fueron las siguientes:
− Columna: Dietilenglicol (DEGS) 10% sobre Cromosorb WHP 80-100
mesh, 2,7 m x 1,5 mm
− Gas portador: N2
− Temperatura del detector: 200 ºC
− Volumen de inyección: 10 L
E.1. Señale tres condiciones cromatográficas que no hayan sido
informadas anteriormente, argumentando por qué es necesario
conocer las mismas sobre la base de su función e incidencia en los
resultados.
E.2. Explique a través de qué procedimiento puede identificarse la
presencia de ácido butírico en la mezcla cromatografiada.
3. La Norma ISO 10727 de 1995 establece para conocer el contenido de cafeína

del té, su determinación por Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC),
con previa extracción del analito a partir de la matriz molida y en presencia
de MgO. Posteriormente se filtra y se realiza una dilución para obtener la
solución de muestra a cromatografiar, que en muchos casos puede presentar
también mínimas cantidades de otros alcaloides.
Las condiciones cromatográficas que establece esta norma son las siguientes:
• Columna: Nucleosic C-18
• Sistema de solventes: metanol:agua (1:4). Regimen isocrático

• Velocidad de flujo: 1 mL/min

• Detector UV 254 nm
También es conocido que la solución del analito puede ser analizada por
Cromatografía en Capa Delgada (CCD) empleando las siguientes condiciones:
• Capa de sílicagel F-254 (no activada)
• Sistema de solventes: butanol: acetona: cloroformo: amoníaco 12.5 M
(4:3:3:1)
• Volumen de aplicación: 10L

• Detección: UV 254
A. Explique el fenómeno físico químico en el cual se fundamenta la
separación de los alcaloides en una de las dos técnicas arriba descritas.
B. Justifique cuidadosamente por qué se pudo emplear un detector UV para
realizar la detección de la cafeína por HPLC. Apóyese en la estructura de
este alcaloide y en sus características espectroscópicas.
C. Explique el fenómeno físico químico en el cual se fundamenta la detección

de los alcaloides separados por la técnica de Cromatografía en Capa
Delgada (CCD).
D. Un analista aplica ambas técnicas (HPLC y CCD) y logra separar 3
componentes, obteniendo los siguientes resultados:
HPLC: Tiempos de retención: Alcaloide 1 > Alcaloide 2 > Cafeína
Areas: Cafeína >> Alcaloide 1 > Alcaloide 2
CCD: Rf: Alcaloide 1 > Alcaloide 2 > Cafeína
Absorbancias: Cafeína >> Alcaloide 1 > Alcaloide 2
En ambas técnicas se trabajó, cuando fue necesario, con patrones de los

tres alcaloides.
D.1. Justifique la necesidad de trabajar con patrones en ambas técnicas
cromatográficas.
D.2. Teniendo en cuenta las condiciones de trabajo empleadas en ambas
técnicas cromatográficas y el mecanismo de separación que se
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manifiesta en cada una de ellas, fundamente cuidadosamente el

hecho de que para la cafeína se obtengan los menores valores de
tiempos de retención y Rf.
D.3. Dibuje los cromatogramas obtenidos para cada caso identificando en
cada uno de ellos los alcaloides separados.
D.4. Explique cuidadosamente una vía de identificación y cuantificación de
la cafeína por ambos métodos. Incluya los pasos que deben seguirse
y el procesamiento de los resultados.
D.5. Si se desea cuantificar la cafeína por CCD empleando una técnica
densitométrica, ¿a qué valor de  debe realizarse el análisis?
Justifique su respuesta.
E. Si Ud está participando en una investigación sobre un nuevo producto
descafeinado y necesita establecer una técnica analítica para comprobar la
ausencia de cafeína en el alimento en estudio. Proponga un método
instrumental que permita dar respuesta a esta problemática. Justifique su
propuesta y explique cómo interpretaría los resultados obtenidos con su
aplicación que le permitieran concluir acerca de la presencia o no de
cafeína en el producto.
4. Un estudio de caracterización de mieles monoflorales procedentes de
diferentes regiones de Cuba, se realizó a través de la medición de los
siguientes parámetros:
• Contenido total de azúcares solubles
• Composición de los azúcares solubles totales y concentración de cada uno
de ellos.
• Determinación de los compuestos volátiles.
• Determinación de acidez total valorable.
• Contenido de micronutrientes (K, Ca, Na, Fe, Zn y Cu).
A. El contenido de azúcares solubles totales se determinó por el método de
antrona-H2SO4. Una alícuota del extracto acuoso de azúcares obtenidos a
partir del jugo se hace reaccionar con 5 mL de la solución de antrona-
H2SO4 manteniendo en ebullición durante 12 minutos las soluciones. La
absorbancia se lee en la zona del visible. Para la cuantificación se utiliza la
ecuación y= 1.142 X – 0.457 con un R2= 0.9999 obtenida de una curva
de calibración de glucosa patrón. El valor de la pendiente y del intercepto
resultó estadísticamente significativo.
A-1. Para determinar experimentalmente la  de trabajo, el analista posee
una solución de muestra preparada a partir del jugo y 3 soluciones
patrones de concentración 0.02, 0.05 y 0.07 mg glucosa/mL las
cuales se procesaron por la técnica de la antrona-H2SO4. ¿Cuál o

cuáles de las soluciones anteriores pueden utilizarse para dicha

determinación?. Justifique su respuesta.
A-2. ¿Explique cómo procedería el analista para determinar
experimentalmente la  de trabajo?
A-3. ¿Cree Ud acertada la decisión del analista de realizar la cuantificación
de los azúcares por la ecuación expresada? Fundamente
B. Para conocer la composición de los azúcares solubles totales las mieles así
como la concentración de cada uno de ellos se realizó una dilución 1:20
de la matriz y se aplicaron los métodos cromatográficos de CCD y HPLC
con las siguientes condiciones.
CCD
• Capa de sílicagel tipo amino (10x20 cm), espesor 0,3 mm
• Fase móvil: nbutanol:ácido acético: agua destilada (8:3:3)
• Volumen de aplicación: 5 L
• Técnica de desarrollo: Ascendente, hasta 13 cm
• Detección: Rociar uniformemente con solución de ácido tricloroacético-
ácido ftálico-ácido p-aminohipúrico en etanol, calentar a 135C durante
15 minutos.
• Cuantificación: Mediante un densitómetro.
HPLC
• Fase estacionaria: Bondapack (5m) para análisis de hidratos de

carbono en fase normal
• Dimensiones de columna: 20 x 0.46 cm
• Velocidad de flujo: 1,5 mL/min.
• Detector: Refractométrico.
Para ambos métodos cromatográficos se preparan soluciones de diferentes
concentraciones de patrones de los azúcares.
B.1. Explique detalladamente cómo debió realizar el analista la
identificación de los azúcares presentes en el jugo cuando aplicó
ambos métodos cromatográficos.
B.2. Ambos métodos cromatográficos arrojaron que los azúcares
presentes en todos las mieles fueron: sacarosa, fructosa, maltosa y
glucosa y en el análisis por HPLC, los tiempos de retención de los
mismos fueron 9.40, 6.73, 10.05 y 7.48 minutos respectivamente.
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Con esta información y teniendo en cuenta las condiciones en que se

desarrollaron la CCD y la HPLC, ordene de forma creciente cómo
serían los valores de los Rf de dichos azúcares en la CCD. Justifique
cuidadosamente su respuesta y organice en orden de polaridad los
azúcares identificados.
B.3. Explique detalladamente cómo se realiza la cuantificación de los
azúcares separados por CCD mediante la utilización de un
densitómetro.
B.4. ¿Pudiera utilizarse un detector UV-Visible de  variable para realizar
la detección de los azúcares por HPLC? Fundamente cuidadosamente
su respuesta teniendo en cuenta el principio en que se fundamenta
esta detección, las estructuras de las sustancias, sus características
espectroscópicas y las transiciones energéticas involucradas.
C. El análisis de los compuestos volátiles presentes en la miel se realizó por

un método de cromatografía de gases a través del siguiente
procedimiento.
Extracción de los volátiles: Los volátiles fueron extraídos de 1 g de miel
en 4 mL de agua, aplicando la técnica de Microextracción en Fase Sólida
(SPME) con espacio de cabeza, empleando fibras de
Polidimetilsiloxano/divinilbenceno (PDMS/DVB).
Condiciones cromatográficas:
• Columna de sílice fundida (HP-5MS) de difenil dimetilpolisiloxano (30 m
x 0.25 mm).
• Gas portador: Helio

• Flujo: 1 mL/min
• Inyección splitless
• Temperatura del inyector: 250ºC
• Temperatura del horno: El horno se programó a 50ºC por 4 min e
incrementó hasta 200ºC a 10ºC/min, se mantuvo a esta temperatura
durante 0.5 min y se incrementó nuevamente hasta 230ºC a razón de
20ºC/min manteniéndose en esta última durante 1 minuto.
• Detector: Espectrómetro de masas a 230ºC.
Mediante la aplicación de esta técnica se separaron 35 compuestos
volátiles, de los cuales se identificaron y cuantificaron 29.
C.1. Explique cuidadosamente en que consiste el procedimiento de
extracción de los compuestos volátiles empleado en este estudio.
C.2. Teniendo en cuenta las condiciones cromatográficas empleadas,
mediante qué procedimiento pudieron identificarse los 29 compuestos
señalados.
C.3. ¿Qué modo de operación se empleó para la separación
cromatográfica y por qué cree usted que fue necesario utilizarlo?
C.4. La cuantificación de los compuestos volátiles se realizó por el
procedimiento de patrón interno empleando alcohol bencílico para
estos fines y calculando el factor de respuesta para cada
componente. ¿Cree Ud acertada la decisión del analista de realizar la
cuantificación empleando este procedimiento? Fundamente
cuidadosamente su respuesta y explique el procedimiento empleado.
C.5. Mencione 3 condiciones cromatográficas que inciden en la eficiencia
de la separación de los componentes de la mezcla en Cromatografía
Gas Líquido. Fundamente cuidadosamente su respuesta.
D. La determinación de acidez total valorable se determinó por peahimetría,
realizando una valoración con NaOH 0.5 N utilizando un pHmetro con
electrodos de vidrio y calomel. Explique detalladamente el procedimiento
para llegar a obtener el % de acidez en las mieles analizadas.
E. Los contenidos de Fe, Cu y otros elementos se determinaron por
Espectrometría de Absorción Atómica.
E.1. Proponga y explique un procedimiento de preparación de la muestra
para realizar dichos análisis.
E.2. Explique detalladamente por qué es necesaria la presencia en el
equipo de una lámpara de cátodo hueco constituida por el mismo
elemento que se analiza.
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E.3. La cuantificación de cada uno de los elementos se realizó empleando

una curva de calibración y una curva de adición de patrón. Los
resultados obtenidos por ambas vías fueron los siguientes:
Curva de calibración: y= 0,0057x + 0,0433 R²= 0,9983
Curva de adición de patrón: y= 0,0057x + 0,6342 R²= 0,9978
¿A qué conclusiones pueden arribarse sobre la base de estos
resultados? ¿Qué procedimiento elegiría usted emplear en el futuro?
Fundamente cuidadosamente sus respuestas.
14.3. ANÁLISIS DE DOCUMENTACIÓN CIENTÍFICA

1. Estudie cuidadosamente el artículo “Determinación de polisacáridos totales en
gel líquido de Aloe Vera L, para su empleo como materia prima en
formulaciones de suplementos dietéticos”, que aparece en el Capítulo 15 /
epígrafe 15.1, y resuelva las siguientes tareas docentes:
1.1. Identifique los parámetros de calidad evaluados en el trabajo y realice un
resumen que incluya la definición y los objetivos que se persiguen con su
evaluación.
1.2. Explique en qué consiste el método de adición de patrón empleado en
este estudio para la evaluación de la exactitud del método.
1.3. Explique cómo se realizó el estudio de la especificidad y que información
brinda la metodología empleada en este estudio.
1.4. ¿Qué importancia reviste en este trabajo el estudio de la estabilidad del
complejo formado?
1.5. ¿Por qué cree usted que no se realizó una evaluación de los parámetros
límite de detección y límite de cuantificación para el método empleado en
la cuantificación?
1.6. Explique con qué objetivo se se adiciona 1 mL de solución de fenol al 5%
y 5 mL de ácido sulfúrico concentrado, a la disolución de aloe tomada
como porción de ensayo. Investigue las reacciones químicas que tienen
lugar.
1.7. Explique por qué se realizan las lecturas de absorbancia a una longitud
de onda de 490 nm y como pudo ser determinado en la práctica este
valor.
1.8. Para la realización de la curva de calibración se empleó un estándar de
D(+) manosa, suministrado por la firma Merck, por ser este el monómero
mayoritario en el polisacárido de la especie cubana. ¿Podría haberse
empleado un estándar de D(+) glucosa? Fundamente cuidadosamente su
respuesta.

1.9. Realice una valoración crítica del trabajo sobre la base de la

correspondencia entre los objetivos propuestos, la metodología empleada
para su cumplimiento, la discusión de los resultados obtenidos y las
conclusiones a las que se arriban.
2. Estudie cuidadosamente el artículo “Leche fluida y yogur natural enriquecidos
con hierro”, que aparece en el Capítulo 15 / epígrafe 15.2, y resuelva las
siguientes tareas docentes:
2.1. Investigue que diferencias que existen entre el hierro ferroso y el hierro
férrico, desde el punto de vista de la absorción y asimilación por el
organismo humano.
2.2. Explique por qué cree usted que se decidió cuantificar el hierro total por
un método de absorción atómica y el hierro ferroso por el método
espectrofotométrico con 1 y 10-fenantrolina. Investigue las reacciones
químicas que tienen lugar en este último procedimiento y por qué puede
utilizarse ese método para la cuantificación de hierro ferroso. ¿Cree usted
que pudiera haberse determinado el hierro ferroso por espectrometría de
absorción atómica?
2.3. ¿Qué importancia reviste en este estudio la determinación del índice del
ácido tiobarbitúrico (TBA)? Fundamente cuidadosamente su respuesta e
investigue el principio en que se basa esta determinación.
2.4. Explique el fundamento del método del molibdovanadato empleado para
la determinación de fósforo. Incluya en su análisis las reacciones
químicas involucradas y las transiciones energéticas que tienen lugar.
2.5. Por qué cree usted que fue necesario incluir en este estudio la evaluación
sensorial de los productos utilizando un panel de catadores adiestrados.
Investigue en que consiste esta evaluación.
3. Estudie cuidadosamente el artículo “Caracterización analítica de alginato de
sodio”, que aparece en el Capítulo 15 / epígrafe 15.4, y resuelva las
siguientes tareas docentes:
3.1. Investigue y explique el procedimiento seguido para la determinación del
peso molecular del alginato de sodio por cromatografía de filtración
sobre gel. Apóyese para su análisis en los siguientes aspectos:
− Fundamento físico químico general en el que se basa la cromatografía
de filtración sobre gel.
− ¿En qué consiste la calibración de la columna cromatográfica?
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− ¿Qué significa que el volumen de exclusión y el volumen total fueron

calculados a partir de los volúmenes de elución de la dextrana T2000k
y la glucosa respectivamente?
− ¿Qué relación existe entre el coeficiente de partición (Kav) y el peso
molecular de los patrones y las muestras de alginato
cromatografiados?
− ¿Por qué cree usted que se empleó un detector de índice de
refracción? ¿Podría haberse empleado un detector UV de  variable?
3.2. Investigue y explique el procedimiento seguido para la determinación de
la relación ácido manurónico / ácido gulurónico (Relación M/G). Apóyese
para su análisis en los siguientes aspectos.
− Fundamento físico químico general en que se basa la cromatografía de
intercambio iónico
− ¿Por qué se emplea en este análisis una resina de intercambio
aniónico?
− ¿Qué procedimiento de elución se empleó?
− ¿Cómo se recogieron los eluatos?
− ¿Cómo se realizó la detección de los ácidos urónicos separados?
− Explique el significado del siguiente fragmento: “Las fracciones
positivas frente al orcinol correspondientes a cada uno de los ácidos
urónicos se mezclaron y se cuantificaron con ayuda de una curva de
calibración empleando un patrón de ácido glucurónico”.
− Explique por qué cree usted que los resultados obtenidos para la
fracción correspondiente al ácido gulurónico se multiplicaron por un
factor de conversión igual a 0.66 teniendo en cuenta la destrucción
preferencial del ácido manurónico durante la hidrólisis.
4. Estudie cuidadosamente el artículo “Validación de un método para la
determinación de patulina en jugos y purés de frutas por HPLC”, que aparece
en el Capítulo 15 / epígrafe 15.5, y resuelva las siguientes tareas
docentes:
4.1. Identifique los parámetros de calidad evaluados en el trabajo y realice un
resumen que incluya la definición y los objetivos que se persiguen con su
evaluación.
4.2. Explique cuidadosamente cómo cree usted que se realizaron los estudios
de repetibilidad y exactitud del método propuesto.
4.3. ¿Por qué cree usted que fue necesario evaluar el límite de detección y el
límite de cuantificación del método propuesto?
4.4. Explique mecanismo físico químico en que se fundamenta la separación
de la patulina en la columna cromatográfica utilizada.
4.5. Por qué cree usted que pudo utilizarse un detector UV para realizar la
detección de la patulina. Incluya en su análisis la estructura de la
micotoxina y las transiciones energéticas involucradas.
5. Estudie cuidadosamente el artículo “Análisis de los compuestos volátiles del
tomate de árbol (Cyphomandra betacea Sendtn.) mediante microextracción
en fase sólida”, que aparece en el Capítulo 15 / epígrafe 15.8, y resuelva
las siguientes tareas docentes:
5.1. Explique cuidadosamente en que consiste el procedimiento de extracción
de los compuestos volátiles empleado en este estudio.
5.2. ¿Por qué cree usted que fue necesario realizar pruebas preliminares con
la fibra de PDMS estudiando la temperatura y tiempo de extracción?
Fundamente su respuesta sobre la base del efecto de estos factores en la
extracción.
5.3. Identifique el tipo de columna utilizada en el estudio y explique por qué
cree usted que se seleccionó la misma atendiendo a los objetivos del
estudio y a la eficiencia de este tipo de columna.
5.4. Explique por qué cree usted que se empleó el programa de temperatura
descrito en este estudio.
5.5. Explique en que consiste el método de cuantificación empleado en este
estudio y la razón que llevó a los investigadores a seleccionarlo. Sobre la
base de su respuesta, ¿qué ventajas y desventajas tendría el empleo del
método del patrón interno?
40d78409-8f5a-44ad-af96-811f110af4ad
Aplicaciones de los métodos instrumentales
15 en la investigación científica
En el presente capítulo se relacionan de forma íntegra 10 artículos científicos

publicados en revistas nacionales e internacionales entre los años 1995 y 2010 y
constituye, a nuestro juicio, una parte especial de este texto, por lo que
consideramos necesario realizar algunos comentarios con vistas a facilitar su
estudio y centrar la atención del lector en determinados aspectos que
consideramos de interés.
La aplicación los métodos de análisis químico e instrumental es vital para el
control de calidad y para la caracterización físico química de un producto. Los
trabajos “Caracterización analítica de alginato de sodio” (epígrafe 15.4), “Análisis
de los compuestos volátiles del tomate de árbol (Cyphomandra betacea Sendtn.)
mediante microextracción en fase sólida” (epígrafe 15.8) y “Método de
microextracción en fase sólida para el análisis de compuestos volátiles en
cervezas” (epígrafe 15.9), son ejemplos muy representativos. En el primero de
los trabajos mencionados se requiere del empleo de varios métodos
instrumentales para cumplimentar los objetivos (cromatografía en columna
convencional de intercambio iónico, cromatografía automatizada de filtración
sobre gel, espectroscopia infrarrroja, espectrometría de absorción molecular y
atómica, entre otros), mientras que en los dos últimos artículos la cromatografía
de gases es la herramienta analítica empleada.
Usualmente se tiende a circunscribir la aplicación los métodos de análisis químico
e instrumental casi únicamente hacia los objetivos de caracterización arriba
mencionados, sin embargo, existen otras muchas investigaciones donde la
química analítica tiene un papel protagónico.
Así por ejemplo, los trabajos “Determinación de polisacáridos totales en gel
líquido de Aloe vera L, para su empleo como materia prima en formulaciones de
suplementos dietéticos” (epígrafe 15.1), “Validación de un método para la
determinación de patulina en jugos y purés de frutas por HPLC” (epígrafe 15.5) y
“Validación de un método por Cromatografía de Gases para la determinación de
los ácidos grasos que componen el D-004 ingrediente activo” (epígrafe 15.10),
describen procedimientos de validación; el primero empleando la espectrometría
de absorción molecular UV-Vis, el segundo mediante cromatografía líquida de
alta resolución como herramienta para determinación de sustancias tóxicas y el
tercero usando la cromatografía de gases para el estudio de sustancias
anticancerígenas. En todos los casos, objetivo de estas investigaciones es
precisamente ayudar a establecer las características de funcionamiento de un
método analítico para su aplicación en la cuantificación de un determinado
analito.
417
15. Aplicaciones de los métodos instrumentales en la investigación científica
Por otra parte, el trabajo “Leche fluida y yogur natural enriquecidos con hierro”
(epígrafe 15.2), muestra el importante papel de la química analítica en la
evaluación de la efectividad de nuevas formulaciones de productos tradicionales
con vistas a elevar el valor nutricional de determinados alimentos. En este caso
dicha evaluación se realiza a través de la espectrometría de absorción atómica.
Otro importante campo de aplicación de la química analítica es la evaluación de
la efectividad de nuevos métodos de conservación y en este sentido, el trabajo
“Desinfestación del frijol de soja por irradiación” (epígrafe 15.3), constituye un
excelente ejemplo. Es por ello que a pesar de ser una investigación publicada
hace más de 15 años se ha seleccionado para formar parte de este capítulo. Otro
elemento interesante se esta investigación es el hecho de que la gran mayoría de
los métodos empleados son clásicos (volumetría y gravimetría), lo que
demuestra la pertinencia de estos métodos para cumplimentar los objetivos de
una investigación, siempre y cuando estén bien seleccionados y empleados.
El trabajo “Carotenoides séricos y su relación con la dieta en un grupo de adultos
cubanos” (epígrafe 15.6), persigue como objetivo relacionar el perfil de
carotenoides presentes en la sangre con la ingesta dietética de un grupo de
adultos cubanos aparentemente sanos. Cabe señalar que en esta investigación la
matriz no es un alimento sino un fluido biológico y la cromatografía líquida de
alta resolución es el método seleccionado para la determinación.
Objetivos bien diferentes se ponen de manifiesto en el trabajo “Ocurrencia de
Aflatoxina M1 en leches cruda, ultrapasteurizada y orgánica producidas y
comercializadas en el altiplano mexicano” (epígrafe 15.7). El método analítico
sirve ahora como una herramienta de evaluación nutricional para determinar la
presencia de sustancias nocivas al hombre (aflatoxinas en este caso) en un
alimento de alto consumo.
Nos parece importante también, que el lector centre su atención en el hecho de
que en la mayoría de estos trabajos, el análisis químico cuantitativo no es la
única herramienta utilizada para alcanzar los objetivos propuestos sino que se
requiere del conocimiento y aplicación de otras ciencias específicas como la
nutrición, la química de los alimentos, la tecnología de los alimentos y la
estadística, así como de otras herramientas de evaluación como el análisis
entomológico y el análisis sensorial, por solo citar algunos ejemplos. Quiere esto
decir que la investigación de hoy en día tiene un carácter multidisciplinario, lo
que requiere del concurso de varios especialistas que trabajen en equipo. Solo
así ha sido posible alcanzar el desarrollo científico tecnológico del presente y
cada día este trabajo en equipo se hace más necesario.
Finalmente queremos hacer alusión a algunos elementos formales en la
redacción de un artículo de investigación científica. Si bien existe un formato más
o menos común (título, resumen, introducción, materiales y métodos, resultados
y discusión, conclusiones y bibliografía), y cualquier trabajo de esta índole debe
caracterizarse por un elevado rigor científico y objetividad de las ideas y de los
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resultados que se exponen, se evidencia en la práctica científica, flexibilidad en

los estilos de redacción y en el reporte de los métodos utilizados y la bibliografía
consultada. Así, en algunos trabajos se describe con más detalle el
procedimiento analítico empleado y en otros solo se citan las referencias. Lo
mismo ocurre con la bibliografía consultada que, en algunos trabajos se relaciona
en orden alfabético y en otros en orden de aparición.
Con respecto a las referencias bibliográficas, con independencia de la norma que
se adopte para exponerlas, éstas deben contener los apellidos de los autores, el
título de la fuente consultada y el año de publicación, con vistas a que los
investigadores interesados puedan consultar estas fuentes. Debe señalarse que
en algunos de los artículos contenidos en este capítulo no se relaciona la
totalidad de la bibliografía consultada en cada uno de los trabajos puesto que en
muchos casos es muy extensa y el objetivo que se persigue no es el de constituir
una fuente de referencia.
El objetivo central de este capítulo es que el lector se ponga en contacto con
ejemplos concretos que reafirman la enorme importancia de los métodos de
análisis químico e instrumental, como una poderosa herramienta para la
resolución de problemáticas de investigación actuales en el campo de los
alimentos y valore las diferentes vertientes investigativas en las que los métodos
de análisis juegan un papel protagónico al tiempo que comience a familiarizarse
con los métodos de investigación científica en el campo de los alimentos.
Finalmente debe señalarse que todos los artículos recogidos en este apartado
cuentan con la autorización de sus autores.

15.1. DETERMINACIÓN DE POLISACÁRIDOS TOTALES EN GEL LÍQUIDO

DE ALOE VERA L, PARA SU EMPLEO COMO MATERIA PRIMA EN
FORMULACIONES DE SUPLEMENTOS DIETÉTICOS.
E. A. Rodríguez, J. E. Rodríguez, Z. Pardo y V. Pavón
Centro de Investigaciones y Desarrollo de Medicamentos (CIDEM). Ministerio de
Salud Pública. Cuba.
Fuente: Revista Alimentaria No 313. Junio 2000. Madrid. España.
RESUMEN
Aloe Vera L, es una planta utilizada en nuestro país para el tratamiento de diversas
enfermedades y en la elaboración de diferentes productos empleados en la industria
de los cosméticos y como suplementos dietéticos. Es conocido que los mismos
presentan derivados antraquinónicos, polisacáridos, ácidos orgánicos, proteínas y
minerales.
En la actualidad se ha desarrollado un proceso tecnológico para la obtención de gel
líquido de aloe, el cual es rico en polisacáridos, para su empleo como suplemento
dietético.
En este trabajo se elaboró un método de análisis para la cuantificación del contenido
de polisacáridos en el gel, el cual se validó según las exigencias actuales. Los
resultados mostraron que el método propuesto cumple con los parámetros de
especificidad, precisión, exactitud y linealidad.
INTRODUCCIÓN
Aloe vera L., comúnmente conocido en Cuba como “sábila”, es una planta
ampliamente utilizada por la población para el tratamiento de diversas
enfermedades. A ella se le atribuyen propiedades cicatrizantes, laxativas,
antiasmáticas, antihepatotóxicas, antiblenorrágicas y antiescorbúticas, entre
otras (1-6).
Su composición química puede variar de una especie a otra, dependiendo de
muchos factores. No obstante, de manera general se conoce que el Aloe
presenta en su composición derivados antraquinónicos (Aloína, Homonataloína y
Aloemodina, entre otros), polisacáridos (compuestos por Arabinosa, Galactosa,
Manosa, Ramnosa y Glucosa, entre otros), ácidos orgánicos, proteínas y
minerales. Por su alto y variado contenido de nutrientes naturales, se emplea
además, como complemento de dietas bajas en calorías, aportando la energía
necesaria contra desgastes físicos (2, 5, 7-13).
En nuestro centro se ha desarrollado un proceso tecnológico para la obtención de
gel líquido de Aloe, el cual será empleado como materia prima en el desarrollo
de diferentes formulaciones para utilizarse como suplementos nutricionales y
farmacéuticos. Con el objetivo de establecer el control de calidad de dicha
materia prima, se ha desarrollado un método de análisis por espectrofotometría
ultravioleta visible, basándose en la propiedad que presentan los polisacáridos de
formar furfural, por hidrólisis y posterior deshidratación de estos en presencia de
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ácido sulfúrico, que al reaccionar con fenol forma un complejo de color amarillo
naranja que presenta un máximo de absorción a 490 nm (14).
MATERIALES Y MÉTODOS
La metodología establecida fue la siguiente: Se pasa 1 mL de gel líquido de Aloe
a un matraz aforado de 100 mL, llevándose a volumen con solución de cloruro de
sodio 0.3 mol/L. Posteriormente se toman 2 mL de esta solución y se llevan a un
tubo para ensayo, se adiciona 1 mL de solución de fenol al 5% y 5 mL de ácido
sulfúrico concentrado, se agita y se deja en reposo por 30 minutos. La
absorbancia se determina a 490 nm.
Se utilizó muestra correspondiente al lote 98002 del gel, elaborado por el
Departamento de Productos Naturales de nuestro centro. Como estándar de
referencia se empleó la D(+) manosa, suministrado por la firma Merck, por ser
este el monómero mayoritario en el polisacárido de la especie cubana (15).
Se elaboró una curva de calibración cuyas concentraciones oscilaron entre 10 y
120 ppm de manosa, siguiendo para ello el mismo procedimiento descrito
anteriormente.
Previamente se realizó un estudio para establecer la estabilidad del complejo
formado. Para ello se determinó el valor de la absorbancia del complejo a
intervalos de 10 minutos, entre los 20 y 70 minutos después de formado el
mismo.
Con el objetivo de definir la especificidad del método propuesto se realizó la
precipitación de los polisacáridos presentes en la muestra según la metodología
descrita por Quevedo (15). Posteriormente se realizó la metodología de análisis a
las muestras de polisacárido precipitado, del gel líquido de Aloe y del líquido
sobrenadante, determinándose el espectro de absorción en la zona del visible.
Para determinar la precisión del método se realizaron 7 determinaciones por un
analista y 6 determinaciones por otro analista, en días diferentes a una misma
muestra de gel líquido de Aloe. Se calculó la media, la desviación estándar y el
coeficiente de variación para cada caso y los resultados se compararon entre si
mediante un test de Fisher y un test t de Student (16-18).
Para el estudio de la exactitud se aplicó el método de adición de estándar. Se
preparó una solución madre de 20 ppm de manosa y se prepararon muestras a
las cuales se adicionaron concentraciones conocidas de manosa de 2, 4 y 6 ppm.
Posteriormente se realizó la metodología de análisis establecida.
Para evaluar el parámetro de linealidad se realizó la curva de recobrado,
determinándose la ecuación de la recta por el método de los mínimos cuadrados.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Se obtuvo una curva de calibración del tipo y = 0.0068X - 0.038, con un
coeficiente de determinación de 0.998, la cual cumple con la ley de Lambert
Beer. Los factores de respuesta son similares entre sí y cercanos al valor de la

pendiente, y su coeficiente de variación es inferior al 5%. La pendiente de la

recta de regresión tiene un 95% de probabilidad de ser diferente de cero
(texp=37.99 > ttab=2.45), según el procesamiento estadístico realizado a la
misma, mientras que el intercepto es próximo a cero (t exp=2.04 < ttab=2.45) (16-
18).
El estudio para establecer la estabilidad del complejo formado demostró que no
existían diferencias significativas entre los resultados obtenidos a los 20 minutos
y cada una de las mediciones realizadas a cada uno de los intervalos, por lo que
las mediciones pueden ser realizadas durante el período de tiempo estudiado.
Los estudios de especificidad del método demostraron que se obtienen máximos
de absorción a 490 nm, característicos del complejo que se forma entre el
polisacárido y el fenol sulfúrico para los dos primeros casos, no observándose
ninguna absorción en esa zona en el caso de la muestra de líquido sobrenadante.
Estos resultados son importantes pues se confirma que la metodología
establecida es específica para la determinación de polisacáridos totales, no
formando complejos con el resto de los componentes presentes en el gel.
Los resultados del estudio de la precisión del método (tabla 1), demuestran que
en ambos casos el coeficiente de variación para cada analista es menor que el
3%, lo que se considera adecuado para este tipo de análisis según la literatura
consultada (16-17). Por otro lado no se encontraron diferencias significativas
entre las medias de los resultados y las varianzas de cada analista (F exp=2.678 <
Ftab=4.39, texp=0.38 < ttab=2.18 para p=0.05 y GL=12), por lo que se puede
considerar la muestra como homogénea.
Tabla 1.
Resultados del estudio de precisión.
Coeficiente de variación
n Valor medio (%) Desviación estándar
(%)
Analista 1 7 0.384 0.0074 1.94
Analista 2 6 0.386 0.0112 2.90
Media general= 0.368 (n=14)
Desviación estándar= 0.0084
Coeficiente de variación= 2.17%
Los resultados del estudio de la exactitud del método (tabla 2) demostraron que
en todos los casos los porcentajes de recobrado están entre el 97 y el 103%,
siendo el recobrado promedio de 101.03% y el coeficiente de variación de
1.59%, lo que consideramos adecuado para este tipo de análisis.
La determinación de la G de Cochran (G exp=0.5825 < Gtab=0.8709), demostró
que las varianzas de las concentraciones empleadas son equivalentes,
pudiéndose asumir que la concentración no influye en la variabilidad de los
resultados. Se comprobó además que no existían diferencias significativas entre
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el valor de la recuperación media y el 100% de recobrado (t exp=0.22 < ttab=2.31

para p=0.05 y GL=8) (16-18).
Tabla 2.
Resultados del estudio de exactitud.
n ppm teóricos ppm prácticos % de recobrado

3 2.00 1.98 99.20
3 4.00 4.09 102.2
3 6.00 6.1 101.7
% de recobrado medio= 101.03 (n=3)
Desviación estándar= 1.6072
Coeficiente de variación= 1.59%
Al evaluar la linealidad del método, se obtuvo una recta del tipo y= mX + b (y=
1.03X - 0.063 con R2=0.999), siendo significativa la pendiente y no significativo
el intercepto, según los test estadísticos realizados.
CONCLUSIONES.
Como conclusiones de este trabajo podemos afirmar que el método propuesto es
más sencillo y rápido que el método tradicional por gravimetría, quedando
demostrado que el mismo cumple con los parámetros de especificidad, precisión,
linealidad y exactitud.
BIBLIOGRAFÍA.
1. Roig, J. T. (1974). Plantas medicinales y venenosas de Cuba. De. Ciencia y Técnica. La
Habana. 698-699.
2. Fajardo, D.; Díaz, M.; Galup, O., y Rosado, A. (1988). Algunos aspectos sobre la
composición química y posibles aplicaciones del Aloe. Revista CENIC (ciencias
químicas). 19 (1-2-3). 97-102.
3. Japan Patent 78.59.019. 27 de mayo de 1978. Appl. 76/132. 215. 2 de noviembre de

1976.
4. Japan Patent 79.119.018. 14 de septiembre de 1979. US Appl. 883.749. 6 de marzo

de 1978.
5. Grindley y Reynolds (1986). The Aloe vera phenomenon: A review of the properties
and modern use of the leaf parenchyma gel. J. of Ethnopharmacology. 16. 117-151.
6. . . . (continúa hasta la cita Nº 19)

15.2. LECHE FLUIDA Y YOGUR NATURAL ENRIQUECIDOS CON HIERRO.

L. Batilde, S. Banguela, Ma. J. De Ortega, R. Torricella y J. Camejo
Instituto de Investigaciones para la Industria Alimentaria (IIIA). Cuba.
Fuente: Revista Alimentaria No 260. Marzo 1995. Madrid. España.
RESUMEN
En el presente trabajo se evaluaron dos niveles de adición de hierro para la leche y el
yogur natural correspondientes a 7 y 10 ppm de hierro en forma de sal ferrosa de
FeSO4.7H2O, realizándose la comparación con los correspondientes controles sin
enriquecer.
Los productos fueron evaluados con catadores adiestrados. Se determinó el contenido
de hierro total y ferroso, el grado de oxidación de la grasa y la composición nutricional
de ambos alimentos.
Se concluyó que es posible enriquecer la leche hasta 10 ppm y el yogur sólo hasta 7
ppm de hierro sin afectar su calidad sensorial manteniendo los tiempos de garantía
establecidos. La ingestión de un litro de estos productos suministra alrededor de 10
mg de hierro, cantidad que cubre más del 70% de las necesidades diarias de este
nutriente en los niños y otros grupos poblacionales que los consuman.
INTRODUCCIÓN
La deficiencia de hierro es el trastorno nutricional más frecuente y la causa más
común de anemia en América Latina y el Caribe, siendo la ferropénica la más
abundante de todas y como malnutrición sigue en orden de importancia la
proteico-energética (1, 2).
En Cuba se han realizado diversas encuestas y estudios nutricionales para
conocer el estado de nuestra población con relación a la deficiencia de hierro (3,
4, 5, 6, 7) estableciéndose en general, que, fundamentalmente, dentro de los
grupos más vulnerables como son los niños entre 6 y 24 meses, embarazadas,
madres lactantes y mujeres de edad fértil, existen evidencias suficientes para
considerar que hay problemas con la nutrición de este elemento esencial.
El enriquecimiento de los alimentos de amplio consumo con sales de hierro, ha
sido desde hace varios años, una medida internacionalmente reconocida para
disminuir esta prevalencia de anemia ferropénica, habiéndose empleado para
ello: pan, galletas, fórmulas infantiles, leche y otros (1).
En Cuba desde la pasada década se empezaron a enriquecer experimentalmente
los purés de frutas y vegetales. Sin embargo, los niveles de hierro que pueden
adicionarse en estos productos, no son capaces de cubrir los requerimientos
diarios, por lo que se hace necesario enriquecer otros productos como la leche y
el yogur que son alimentos de alto valor nutricional, que se distribuyen en
grandes cantidades no solo para niños, sino para las embarazadas, adolescentes
y otros grupos vulnerables.
Varias son las sales que se emplean para el enriquecimiento de alimentos, siendo
el FeSO4.7H2O el que goza de un alto índice de absorción y bajo costo, por lo que
40d78409-8f5a-44ad-af96-811f110af4ad
se emplea ampliamente en alimentos, en medicamentos, y como sal de

referencia en el estudio de absorción de otras formas de hierro. La alta
reactividad de esta sal específicamente en procesos de oxidación-reducción ha
limitado su uso en alimentos de larga duración o que presenten contenidos de
grasas sensibles al enranciamiento siendo, además, recomendable no emplearla
en concentraciones superiores a 20 y 30 mg / kg de producto (9).
Esta desventaja no resulta excluyente en el enriquecimiento de la leche y el
yogur, ya que ambos son productos perecederos y las cantidades de hierro a
adicionar en los mismos son inferiores a las que provocan efectos indeseables.
Aunque algunos autores (10, 11) han encontrado en leches enteras alteraciones
oxidativas cuando se adicionan más de 10 ppm de hierro.
Tomando en consideración todo lo anterior el objetivo de la presente
investigación consistió en definir los niveles de FeSO 4.7H2O que puedan añadirse
a la leche fluida y al yogur natural sin que se afecten sus características
sensoriales y su conservación.
El trabajo se desarrolló en 2 etapas: una de laboratorio, donde se hicieron
pruebas de tanteo y, otra posterior, a escala piloto.
Para definir los niveles de hierro a añadir se tomaron en cuenta los
requerimientos propuestos por la Junta de Alimentación de la FAO para lactantes,
que oscila entre 6 y 15 mg/día y para niños mayores entre 10 y 15 mg/día (12)
y los resultados de pruebas preliminares donde se detectó que de utilizar
concentraciones de hierro superiores a 11 ppm se producían afectaciones del
sabor. Por todo esto, se decidió evaluar la adición de 10 mg de sal ferrosa de
FeSO4.7H2O por cada litro de leche o yogur.
En dichos estudios no se evaluaron las posibles afectaciones durante el
almacenamiento (13), por lo que en el presente trabajo se decidió introducir un
nivel más bajo de adición de 7 ppm, semejante al empleado por Gay (14) para el
enriquecimiento de leche maternizada logrando buenos resultados.
A escala de laboratorio se realizaron dos producciones independientes de leche y
yogur de dos litros cada una, y se chequearon los tiempos de coagulación del
yogur para detectar posibles alteraciones de este paso tecnológico.
A las 24 horas de elaborados todos los productos se sometieron al criterio de un
panel de cuatro catadores adiestrados, aplicando las instrucciones normalizativas
establecidas para evaluar la calidad de la leche y el yogur (15, 16).
En la planta piloto se realizaron 8 producciones tanto de leche como de yogur
empleando niveles de 50 litros cada una, cuatro con 7 ppm de hierro y el resto
con 10 ppm. Paralelamente se produjeron iguales cantidades de leche y yogur
sin enriquecer, las que se tomaron como controles.

La sal ferrosa en las cantidades necesarias para garantizar las referidas adiciones
de 7 y 10 ppm respectivamente se adicionaron en el tanque a la leche
(previamente disuelta en una porción de leche) clarificada y estandarizada antes
del proceso de pasterización.
Las producciones se realizaron siguiendo las instrucciones tecnológicas
establecidas en las normas para la leche pasteurizada y yogur natural (15, 12).
Los productos terminados fueron almacenados en cámaras refrigeradas a 10°C
para su posterior análisis.
De cada réplica de producción se tomaron 4 muestras individuales para
determinar el contenido de hierro total y ferroso, incluyendo también los
controles. Para determinar el hierro total se aplicó un método de absorción
atómica empleando un equipo Pye Unicam SP-2900, según la norma vigente
(17). El ferroso se determinó por el método espectrofotométrico con 1 y 10-
fenantrolina (18). Todos los análisis se realizaron por duplicado.
Se determinó también el índice del ácido tiobarbitúrico (TBA) para evaluar la
oxidación de las grasas en la leche, mediante el método de Krilova y col. (19).
Este índice ha sido estandarizado solamente en leches y cremas, por lo que no se
aplicó en el caso del yogur. Los análisis se realizaron diariamente durante 72
horas, que es el tiempo de garantía establecido para este producto según la
norma vigente.
Para la caracterización nutricional de los productos, se tomaron 2 muestras de
cada producción, evaluándose los contenidos de humedad, proteínas, cenizas,
grasa, hidratos de carbono, lactosa y valor energético por los métodos
establecidos en las normas vigentes (20, 21, 23). Las concentraciones de Ca,
Mg, Na y K se determinaron por absorción atómica y por el método de
molibdovanadato las de P (20), realizándose las determinaciones por duplicado.
La evaluación sensorial de los productos se realizó aplicando las mismas
instrucciones señaladas en la etapa de laboratorio utilizando un panel de 9
catadores adiestrados.
La leche se evaluó diariamente hasta las 72 horas y el yogur en días alternos a
partir de las 24 horas de elaborado, hasta el término de 7 días, que es el tiempo
de durabilidad establecido en la norma cubana vigente para este producto (23,
24).
Se determinaron los estadígafros simples a los resultados obtenidos para el
contenido de hierro total y ferroso, determinándose los intervalos de confianza
para  = 0.05.
Los rangos del índice de TBA como expresión del nivel de oxidación se
establecieron mediante un método espectrofotométrico descrito por Krilova y col.
(19). Los resultados se relacionan con la densidad óptica determinada (DO).
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RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
En las pruebas a nivel de laboratorio no se encontraron defectos de tipo sensorial
en las leches para los dos niveles de enriquecimiento evaluados, al igual que en
el yogur con 7 ppm de hierro. Sin embargo, en el yogur con 10 ppm uno de los
cuatro jueces detectó un ligero sabor astringente en las dos producciones
evaluadas, lo que no afectó de forma sensible la puntuación final promedio
otorgada al producto, que fue de 17.4, la cual según la escala empleada
corresponde a la categoría de <<buena>> (15.4 – 17.4). Tampoco se
detectaron cambios en la consistencia del yogur por la adición de la sal ferrosa.
Los tiempos de coagulación del yogur enriquecido se mantuvieron inalterables
con relación al yogur control, estando entre 2:20 y 2:30 horas.
Valorando estos resultados se mantuvieron las condiciones de trabajo propuestas
para las pruebas piloto, sin excluir ninguno de los niveles de adición previamente
seleccionados.
De los resultados que aparecen en la tabla 1 se puede apreciar que la leche sin
enriquecer presentó 2.9 ± 0.80 ppm de hierro total y las enriquecidas
contuvieron prácticamente esta cantidad más la correspondiente al nivel de
adición establecido (7 y 10 ppm).
La variabilidad de los resultados para las 4 réplicas fue pequeña, lo que denota
buena uniformidad en las muestras evaluadas, así como un buen ajuste del
método de análisis.
Tabla 1.
(a)
Contenido de hierro total en leche y yogur enriquecidos y sin enriquecer (N=6)
Leche Yogur
Producto Hierro total Hierro ferroso Hierro total Hierro ferroso
(ppm) (ppm) (ppm) (ppm)
Control 2.9 ± 0.5 1.4 ± 0.2 2.06 ± 0.3 2.3 ± 0.2
Enriquecido 7 ppm 10.5 ± 0.6 3.4 ± 0.5 9.3 ± 0.7 8.9 ± 0.5
Enriquecido 10 ppm 13.1 ± 0.8 6.6 ± 0.2 12.2 ± 0.5 10.8 ± 0.3
(a) Valores promedios  desviación estándar
Las leches enriquecidas presentaron contenidos de hierro ferroso inferiores a los
añadidos, habiéndose oxidado en el proceso entre el 35% y el 50% del mismo,
hecho muy favorecido por el pH casi neutro de la leche (pH = 6.7), que no
resulta propicio para mantener el hierro en su forma reducida (8) (tabla 1 ).
En la leche sin enriquecer el hierro en forma ferrosa fue aproximadamente el
50% del total presente en el producto, por lo que una parte importante de este
elemento se encuentra oxidado como Fe 3+, el cual resulta también soluble en
este medio.

El yogur sin enriquecer presentó valores de hierro total muy parecidos a los de la
leche, lo cual se corresponde con lo informado por la literatura (21, 22). Es de
destacar que tanto la leche como el yogur sin enriquecer poseen valores de
hierro superiores a los informados para otros países, los cuales oscilan entre 1 y
2 ppm.
Las pequeñas variaciones obtenidas en los resultados evidencian que los mismos
se encuentran dentro del rango de precisión del método analítico empleado (17,
23).
Con respecto al hierro ferroso puede notarse que en el yogur hay mucha más
estabilidad de dichos iones, habiéndose oxidado alrededor de un 12%, lo que
está relacionado con la mayor acidez de este producto. Cabe, entonces, pensar
que la absorción del nutriente será mejor en el yogur que en la leche
enriquecida, ya que el medio ácido es un factor que coadyuva a una mayor
utilización del hierro de los alimentos (1, 8). No obstante, debe aclararse
convenientemente que no es factible predecir con exactitud la efectividad de
ningún alimento enriquecido para incrementar los niveles de hierro en el
organismo, sin antes hacer estudios de absorción según los métodos
recomendados por la Organización Mundial de la Salud (1), ya que hay múltiples
factores que pueden afectar la bioutilización de este nutriente.
Si se analizan los requerimientos de hierro establecidos por la FAO para lactantes
y niños (13) puede decirse que con la ingestión diaria de un litro de leche o
yogur enriquecido se garantiza cubrir más del 70% de las necesidades de hierro
de los mismos.
En la tabla 2 se observa que los rangos de valores del índice de TBA de la leche
patrón son más bajos que los de las leches enriquecidas, pero en ninguno de los
casos se sobrepasan las cifras entre 0.42 y 0.64, por arriba de los cuales según
se informa en la literatura (19) el grado de oxidación puede ocasionar sabores
extraños. Los datos obtenidos con la leche patrón fueron semejantes a los
encontrados por otros autores en leches cubanas (13), mientras que las de los
productos enriquecidos no coincidieron con los informes presentados por Wong y
King (11) cuando adicionaron 10 ppm como FeSO4..7H2O a leche entera de vaca
pasteurizada. Dichos autores detectaron afectaciones de la grasa provocadas por
la presencia del ión ferroso, lo que dio lugar a que las cifras del índice del TBA
fueran altas.
Los resultados de la evaluación sensorial (tabla 3) evidencian que la leche patrón
al igual que la enriquecida obtuvo calificación de excelente a través de todo el
período de estudio. En ningún caso los panelistas detectaron sabores ni olores
extraños referentes a la adición de hierro, ni tampoco de oxidación de grasa. Con
relación al yogur, el que contenía 10 ppm de hierro obtuvo calificación de
excelente solamente hasta las 72 horas de producido, ya que en las siguientes
evaluaciones algunos jueces detectaron sabor astringente, el que se acentuaba
con el paso del tiempo de conservación.
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Tabla 2.
Valores de densidad óptica (DO) como expresión del límite de ácido tiobarbitúrico (TBA)
en leches control y enriquecidas
Tiempo de conservación (horas)

24 48 72
Control 0.031 – 0.040 0.036 – 0.042 0.038 – 0.045
Enriquecida 7 ppm 0.036 – 0.045 0.037 – 0.040 0.037 – 0.047
Enriquecida 10 ppm 0.037 – 0.047 0.039 – 0.042 0.052 – 0.057
Tabla 3.
Resultados de la evaluación sensorial de la leche y yogur enriquecidos
Leche Yogur
Tiempo (horas) Tiempo (días)
Muestras
24 48 72 1 2 3 4
Control 19.0 19.0 19.4 19.2 18.4 18.6 17.9
Enriquecida 7 ppm 18.4 19.4 19.0 19.0 17.9 18.4 17.7
Enriquecida 10 ppm 18.1 19.0 19.3 19.6 18.1 16.7 16.4
Calificación: Excelente (17.5 – 20.0 ), Buena (15.4 – 17.4)
Analizando estos resultados se decidió evaluar las dos últimas producciones de
yogur enriquecidos por un grupo de catadores adiestrados en la cata de yogur y
en la detección de sabor metálico, respectivamente (6 jueces) utilizando el
método de evaluación de yogur del Centro Tecnológico de la Leche para Chile y
América Latina de la FAO (25).
Los resultados obtenidos por este método de evaluación (tabla 4) arrojaron que
el yogur con adición de 7 ppm de hierro fue calificado como bueno obteniendo
una puntuación relativamente alta, aún a la semana de producido. El yogur con
10 ppm fue considerado no aceptable en todas las evaluaciones y se le situaron
como principales defectos, sabor astringente, así como olor ligeramente
defectuoso. Se señaló por algunos jueces que el coágulo era muy fino lo que
modificaba también la consistencia. Con estos datos se definió que la dosificación
de 7 ppm de hierro no produce alteraciones indeseables en el yogur.
Tabla 4.
Puntuación obtenida para el yogur enriquecido evaluado por el método del Centro
Tecnológico de leche de Chile y América Latina (FAO)
Tiempo de conservación (días)

Producto
1 3 5 7
Enriquecido 7 ppm 23.5 23.0 23.0 22.0
Enriquecido 10 ppm 19.0 17.0 14.5 -
De la composición nutricional promedio que aparece en la tabla 5 se puede

apreciar que estos productos se corresponden con leche y yogur parcialmente
descremados que se producen en otros países (21).
Tabla 5.
Composición nutricional y algunos índices físico químicos de calidad de la leche y el yogur
enriquecido con 7 ppm de hierro, comparados con productos semejantes (expresado en
100 g de alimento)
Leche
Leche Yogur Yogur Yogur
Composición pasteurizada
enriquecida enriquecido inglés holandés
italiana
Valor energético (Kcal) 51 49 51 55 58
Humedad (g) 89.54 88.50 89.86 89.00 88.00
Sólidos totales (g) 10.46 11.50 10.14 11.00 12.00
Proteínas (g) 2.74 3.50 2.75 3.2 3.3
Grasa (g) 2.40 1.80 2.50 2.50 3.20
Hidratos de carbono no
4.69 5.00 4.34 4.60 4.00
totales (g)
Lactosa (g) 4.69 - 2.88 - -
Monosacáridos (g) - - 1.46 - -
Cenizas (g) 0.63 - 0.55 0.70 -
Fe (mg) 1.05 0.10 0.93 0.10 -
Ca (mg) 164.00 120.00 125.00 120.00 120.00
P (mg) 73.00 94.00 68.00 93.00 90.00
Mg (mg) 18.00 - 16.00- - -
Na (mg) 100.00 - 75.00 - 50.00
K (mg) 150.00 - 120.00 - 150.00
Acidez (% ácido láctico) 0.13 - 0.84 - -
pH 6.70 - 4.20 - -
Las diferencias encontradas pudieran deberse a la influencia que ejercen la dieta

animal, la raza, el clima y otros factores en el contenido de los macro y micro
elementos presentes en la leche (21, 22).
CONCLUSIONES
Es posible enriquecer la leche fluida con 7 y 10 ppm de hierro y el yogur natural
con 7 ppm en forma de sal ferrosa de FeSO4..7H2O sin afectar su calidad durante
los tiempos de garantía establecidos en las normas cubanas vigentes. La adición
de esta sal no produjo afectaciones de tipo oxidativo en la grasa de la leche ni
siquiera después de 7 días de almacenamiento a 10°C.
La ingestión de un litro de leche o yogur enriquecidos con la sal ferrosa de
FeSO4.7H2O suministra alrededor de 10 mg de hierro, cantidad que cubre en
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gran medida al requerimiento diario de este nutriente en los niños y otras

poblaciones que los consumen.
BIBLIOGRAFÍA.
1. OMS (1975): Lucha contra la anemia nutricional, especialmente contra la carencia de
hierro. Informe de la reunión mixta ADI/OIEA/OMS. Serie de informes técnicos. Núm.
580. Ginebra.
2. Chandra. Y. R. (1970): La anemia ferropénica en la población de América Latina y el

Caribe. Boletín O.S.P. vol LXII. Núm.5.
3. Cabrera.A: Chí. N.Díaz.Y. y Gay.J. (1969): Encuesta nutricional de San Andrés de

Caiguanabo. Bol. Hig. Epid.8:3.Cuba.
4. Cabrera.A: Chí. N.Díaz.Y. y Gay.J. y Mateo de Acosta.G. (1970): Encuesta nutricional

de Alquizar.Bol.Hig.Epid.8:3.Cuba.
5. Torre de la E.E. y Artigas.E. (1973): Valores de la hemoglobina en niños entre 6 y 12

meses de edad.Rev.Cub.Ped. 45:69,l,Cuba.
6. . . . (continúa hasta la referencia Nº 25)

15.3. DESINFESTACIÓN DEL FRIJOL DE SOJA POR IRRADIACIÓN

M. Alvarez, E.Prieto, J.Mesa, R. Fraga y V. Fung
Instituto de Farmacia y Alimentos. Universidad de La Habana. Cuba.
Fuente: Revista Alimentaria No 276. Octubre 1996. Madrid. España.
RESUMEN
En el trabajo se estudió el efecto de la irradiación con dosis de 0.5 y 1.0 kGy en la
desinfestación del frijol de soja y en diferentes componentes químicos de importancia
en este producto. Los resultados mostraron la efectividad de las dosis aplicadas en el
control del plagamiento por insectos de la soja durante su almacenamiento. Los
contenidos de proteínas totales, grasa y humedad, así como las características de
identidad y de calidad de la grasa extraída al producto irradiado, no se alteraron por
la irradiación.
INTRODUCCIÓN
El frijol de soja es un producto fácilmente plagado por insectos, lo que ocasiona
alteraciones y pérdidas del mismo durante su almacenamiento, en Cuba las
especies Tenebroides mauritanicos (L), Tribolium castaneum Herbst, Rhizopertha
dominica (F), Sitophilus oryzae (L) y Corcyra cephalonica (Staint) han sido
detectadas en este producto en diferentes ocasiones (1,2).
El método tradicionalmente utilizado para el control de insectos en granos y
cereales es la fumigación, pero por los inconvenientes que presenta,
fundamentalmente los relacionados con la salud de los consumidores y del
personal involucrado en la actividad, las autoridades sanitarias de diferentes
países han establecido numerosas restricciones para su aplicación y en algunos
casos se ha prohibido totalmente (3,4).
La tecnología de irradiación ha sido demostrada como un método eficaz en la
desinfestación de estos productos (3-11) y supera además las limitaciones de la
fumigación (3,5). Específicamente en Cuba se han obtenido resultados
satisfactorios en harinas de trigo y de maíz, arroz, frijoles y cacao plagados con
las especies de insectos de mayor importancia económica para estos productos
(7-11).,
Dosis de radiaciones ionizantes de hasta 1kGy son capaces de controlar los
insectos que plagan los alimentos (3-11) y ya desde 1980 se concluyó la
inocuidad de los productos alimenticios irradiados con dosis de hasta 10 kGy
(12), valor 10 veces mayor que el máximo establecido por el Codex Alimentario
en su norma sobre alimentos irradiados (13) para la aplicación de esta tecnología
con objetivos desinfestantes.
Atendiendo a todo lo anteriormente planteado y a la gran importancia de la soja
en la dieta consumida en la actualidad, el presente trabajo tuvo como objetivos
lograr la desinfestación del frijol de soja mediante el procesamiento con
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radiaciones ionizantes y conocer su efecto en algunos componentes químicos de

importancia en este alimento.
El frijol de soja (Glicine max) utilizado tuvo un plagamiento medio (7 insectos
por kg de producto) según los criterios de evaluación de la infestación en granos
almacenados (1,14), la especie presente fue Tribolium castaneum Herbst, lo que
se conoció después de incubar muestras del producto en cajas entomológicas
durante 45 días a 30  1ºC de temperatura y 73% de humedad relativa (1),
debido a la existencia de estadíos microscópicos al comenzar la investigación. La
especie encontrada se identificó por comparación con material existente en el
Instituto de Investigaciones para la Industria Alimentaria (IIIA).
El producto envasado en bolsas de polietileno (400 g por bolsa) se procesó con
radiaciones ionizantes en condiciones ambientales en la planta de irradiaciones
del IIIA, la que posee un irradiador de cobalto-60. El total de bolsas se dividió en
3 grupos, irradiándose uno con una dosis media mínima de 0,5 kGy, según lo
expresado en la literatura sobre la suficiente efectividad de esta dosis para el
control de la infestación en granos, cereales, etc. (5,6), otro grupo se irradió con
una dosis media global de 1,0 kGy, que es el mayor valor de dosis admitido
internacionalmente para este objetivo (12,13), el grupo restante, control, se
mantuvo sin irradiar. El control dosimétrico del proceso se realizó mediante el
empleo de los dosimétricos Fricke y cérico-ceroso.
Los 3 grupos de productos fueron almacenados durante 60 días en condiciones
controladas, iguales a las fijadas para conocer el grado de plagamiento del frijol
de soja al comienzo de la experiencia.
Con posterioridad a la irradiación del producto y periódicamente durante su
almacenamiento (15, 30 y 60 días) se hicieron los conteos de los estadíos
macroscópicos de insectos por tamizado y examen visual (15) a muestras de 1
kg de cada uno de los grupos, tomadas siguiendo un diagrama Z (16). Estas
muestras después de evaluadas se colocaron en cajas entomológicas durante 45
días en las condiciones de temperatura y humedad relativa antes citadas para
cuantificar también los estadíos imposibles de detectar visualmente en el
momento del análisis. La efectividad del tratamiento se determinó mediante la
aplicación del método de Abbott (17).
Inmediatamente después de irradiada la soja, se determinaron los contenidos de
proteínas totales (18), grasa (19) y humedad (18). Además, durante los dos
meses de almacenamiento se le determinó a la grasa del producto, extraída en
frío (20), los índices de yodo, refracción, acidez y peróxido (20).
Para el análisis estadístico de los resultados se aplicó la prueba de t de student
(p  0,05), para determinar si existían o no diferencias significativas entre las
muestras irradiadas con las diferentes dosis y el control.

Los resultados de los análisis entomológicos mostraron que en el frijol de soja no
irradiado existió un incremento de la infestación a partir de 7 insectos x kg -1,
llegando a tener 32 insectos x kg-1, siempre de la especie Tribolium castaneum
Herbst, a los 60 días de almacenamiento en las condiciones controladas (tabla
1).
Tabla 1.
Efecto de la irradiación en la infestación existente en el frijol de soja y su
comportamiento durante el almacenamiento postratamiento del producto.
Cantidad de insectos por kg de producto*

Dosis
Tiempo de almacenamiento (días)
(kGy)
0 15 30 60
0 7 16 20 32
0,5 0 0 0 0
1,0 0 0 0 0
*insecto presente: Tribolium castaneum Herbst.
Sobre la efectividad de la irradiación en el plagamiento existente en el producto
se obtuvo que las dosis aplicadas 0,5 y 1,0 kGy no permitieron el desarrollo de
los estadíos biológicos, huevos y larvas pequeñas, que estaban presentes en la
soja en el momento de aplicarse el tratamiento, es decir, hubo una incapacidad
de desarrollo de los estadíos biológicos, huevos y larvas pequeñas, que estaban
presentes en la soja en el momento de aplicarse el tratamiento, es decir, hubo
una incapacidad de desarrollo de los mismos como consecuencia de la
irradiación, lográndose un 100% de mortalidad, que se constató al no detectarse
estadíos microscópicos, ni vivos ni muertos, después de incubadas las muestras
en las cajas entomológicas en las condiciones establecidas. Durante los 60 días
de almacenamiento del producto postirradiación, las muestras permanecieron
totalmente desinfestadas (tabla 1). Estos resultados corroboraron lo planteado
tanto en la literatura internacional (3-6) como en las investigaciones realizadas
en Cuba (7-11) sobre la factibilidad de las dosis estudiadas, en la desinfestación
de cereales y granos.
Sobre el efecto del procesamiento con radiaciones ionizantes en los contenidos
de proteínas totales, grasa y humedad del frijol de soja, el análisis estadístico de
los resultados arrojó que no hubo diferencias significativas (p  0,05) en los
productos irradiados con respecto al control (tabla 2), lo que está en
concordancia con lo encontrado en un trabajo realizado en Pakistán (21), en el
cual se aplicaron dosis de hasta 5 kGy y tampoco hubo afectación en los mismos.
Estos resultados también coinciden con los obtenidos cuando se aplicaron las
dosis adecuadas a otros granos y cereales para controlar su plagamiento por
insectos (7, 9-11).
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Tabla 2.
Efecto de la irradiación del frijol de soja en el contenido de diferentes componentes
químicos de importancia para el producto.
Componente químico (%)

Dosis (kGy)
Proteínas totales* Grasa* Humedad*
0 36,4 20,6 10,4
0,5 36,5 20,4 10,3
1,0 36,1 20,5 10,1
* No diferencia significativa (p  0,05) entre 0 kGy y cada dosis de irradiación.

En la determinación de las características de identidad, índice de yodo y de
refracción, de la grasa extraída a la muestra control y las irradiadas no se
encontraron variaciones significativas (p  0,05) debido al tratamiento aplicado
(tabla 3). Tampoco se presentaron diferencias para igual nivel de significación en
las características de calidad de la grasa evaluada, es decir en el índice de acidez
y de peróxido, durante el almacenamiento de las muestras en las condiciones
controladas (tabla 4). Aunque la aplicación de la tecnología con dosis
desinfestadas no dio lugar a la aceleración de un proceso lipolítico, ni tampoco
oxidativo de los lípidos del frijol de soja, ambos índices se incrementan con el
tiempo de almacenamiento, como era esperado.
Los lípidos se encuentran entre los compuestos químicos más radiosensibles, sin
embargo, al aplicar las dosis que aseguran el control de insectos en productos
alimenticios, no se encontró variación en el índice de acidez de la grasa presente
en el cacao y el trigo (11,22), lo que coincide con los resultados de este trabajo
con el frijol de soja. Sobre el índice de peróxido, tampoco se encontraron
planteamientos específicos para la soja, pero este presentó un comportamiento
similar, inmediatamente postirradiación, al encontrado en la grasa de cacao
irradiado con 0,5 kGy (11).
Tabla 3.
Efecto de la irradiación del frijol de soja en las características de identidad de la grasa
extraída al mismo postratamiento.
Características de identidad
Dosis (kGy) Indice de iodo* Indice de refracción*
(g I2 x g grasa-1) ( 40ºC)
0 119,10 1,469
0,5 119,93 1,469
1,0 120,44 1,469
* No diferencia significativa

Tabla 4.
Efecto de la irradiación del frijol de soja en los índices de calidad de la grasa extraída al
mismo durante el almacenamiento postratamiento del producto.
Indice de calidad
Indice de acidez* Indice de peróxido*
Dosis (kGy)
(mg KOH x g grasa-1) (meq O2 x kg grasa-1)
t=0 t=60 t=0 t=60
0 4,00 4,94 6,5 12,0
0,5 4,20 5,02 6,3 10,9
1,0 4,22 4,90 6,5 13,3
* No diferencia significativa (p  0,05) entre 0 kGy y cada dosis de irradiación.

CONCLUSIONES
La aplicación de la tecnología de irradiación con dosis de 0,5 y 1,0 kGy logró
mantener el frijol de soja totalmente desinfestado durante su almacenamiento en
condiciones que precisamente favorecen el desarrollo del plagamiento.
Las dosis aplicadas no afectaron los contenidos de proteínas totales, grasa y
humedad de la soja y tampoco alteraron las características de identidad de la
grasa extraída al producto, ni aceleraron los procesos lipolítico y oxidativo para la
higienización de los granos y cereales.
BIBLIOGRAFÍA.
1. Hall, D.(1980): Handling and storage of grains in tropical and subtropical areas, 3.
ed., Roma, FAO.
2. La Rosa, J., y Vázquez, L. (1987): “Distribución, daños y lucha contra los principales
insectos de los productos con vegetales almacenados”, Memorias I Seminario
Científico Internacional de Sanidad Vegetal, Ciudad de La Habana.
3. Ahmed, M. (1988): Desinfectación de granos y almacenamiento de papas después de

la irradiación. Primer Taller sobre Irradiación de Alimentos, IIIA, Ciudad de La
Habana, I.
4. OIEA (1984): Tratamiento de Alimentos por Irradiación, Viena, OIEA.
5. IAEA (1982): Training manual on food irradiation technology and techniques,

technical report series No. 1114, 2. ed., IAEA, Viena.
6. ….. (continúa hasta la Nº 22)
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15.4. CARACTERIZACIÓN ANALÍTICA DE ALGINATO DE SODIO

H. Zumbado(1), D. Fajardo(1), J. Díaz(2)
(1) Instituto de Farmacia y Alimentos. Universidad de La Habana. Cuba
(2) Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología. Cuba
Fuente: Revista Alimentaria No 329. Enero-Febrero 2002. Madrid. España
RESUMEN
Se realizó una caracterización estructural y físico química a dos muestras de alginato
de sodio de diferente procedencia. Se determinaron sus características espectrales
en la región del IR, el peso molecular y la relación entre sus ácidos urónicos
(relación M/G), así como también se realizó una evaluación de ambos productos
atendiendo a las especificaciones establecidas por los organismos internacionales
para su empleo como aditivo alimentario.
Se concluyó que el alginato de sodio de procedencia nacional posee un peso
molecular de 426 579 g/mol y es rico en ácido gulurónico (relación M/G = 0.56)
mientras que el polímetro de procedencia mexicana resultó ser una mezcla
constituida por tres tipos de alginatos de diferente peso molecular: 1 584 893, 794
328 y 501 187g/mol y posee mayor contenido en ácido manurónico (relación M/G =
6). Así mismo, ambos productos cumplen con las especificaciones físico químicas
establecidas por los organismos internacionales para su empleo como aditivo
alimentario, aunque el alginato cubano posee un mayor contenido de calcio.
INTRODUCCIÓN
Los alginatos son polisacáridos coloidales hidrófilos que se obtienen de las algas
marinas de la clase Phaeophyceae, conocidas comúnmente como algas pardas.
Estos productos son ampliamente utilizados a nivel mundial en la industria de los
alimentos debido a sus propiedades como agentes espesantes y gelificantes, así
como también por su capacidad de actuar como suspensores y estabilizantes
(Gordon, 1990; Indergaard, 1991).
La obtención de alginato de sodio de producción nacional es un objetivo en torno
al cual diferentes instituciones científicas han desarrollado tareas investigativas
desde la década del 80. Este interés se sustenta en la gran riqueza marina
explotable que posee Cuba y en los beneficios que a largo plazo puede reportarle
a la economía del país.
A partir de 1994, el Departamento de Química Básica del Instituto de Farmacia y
Alimentos de la Universidad de La Habana, ha realizado diferentes estudios
dirigidos a la obtención y caracterización físico química y reológica de alginato de
sodio procedente de Sargassum sp (Lewis y col., 1995; Zumbado y col., 1999a;
Zumbado y col., 1999b) y a su empleo como aditivo en diferentes sistemas
alimentarios (Zumbado, 1999; Zumbado y col., 2000); sin embargo, la
introducción de este polímero exige también investigaciones dirigidas a su
caracterización estructural.
Está bien establecido que los alginatos son copolímeros lineales constituidos por
unidades de ácido -D-manurónico y -L-gulurónico, los cuales se encuentran

unidos a través de enlaces glicosídicos y están a su vez distribuidos en tres

bloques diferentes (Smidrod, 1974) (figura 1). Sin embargo, tanto la proporción
entre los monómeros como su ordenamiento dentro de las cadenas, depende de
la especie de alga de la cual proceda el alginato y de otros muchos factores
ecológicos. Se ha demostrado además que la relación en que se encuentran los
ácidos urónicos influye directamente en las propiedades reológicas de este
polímero. Así mismo, el peso molecular es otro importante parámetro analítico
que influye directamente en estas propiedades y que depende no solo de la
especie de alga sino también del método de obtención utilizado.
Figura 1. Estructura del ácido algínico
Teniendo en cuenta los elementos anteriormente expuestos se plantea el

presente trabajo con los siguientes objetivos:
1. Realizar la caracterización estructural de una muestra de alginato de sodio de
procedencia nacional y de un producto mexicano, atendiendo a tres
parámetros fundamentales: las características espectrales en la región del IR,
el peso molecular y la relación entre sus ácidos urónicos (relación M/G).
2. Evaluar ambos productos atendiendo a las especificaciones establecidas por
los organismos internacionales para su empleo como aditivo alimentario.
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Características de las muestras empleadas
Se emplearon muestras de alginato de sodio de producción nacional obtenidas a
partir de Sargassum sp, en el Instituto de Farmacia y Alimentos de la
Universidad de La Habana y alginato de sodio mexicano ALGIMAR F (105 cps)
obtenida a partir de Macrocystis pyrisfera, en el Centro Interdisciplinario de
Ciencias Marinas del Instituto Politécnico Nacional de México. Ambas muestras
fueron almacenadas en recipientes de plástico herméticamente cerrados a
temperatura ambiente.
Espectro IR
Los espectros IR del alginato cubano y del alginato de referencia se registraron
en un espectrofotómetro Spekol IR-75, siguiendo el procedimiento de las
pastillas de KBr y barriendo un rango de número de ondas () entre 4000 y 200
cm – 1.
Determinación del peso molecular
La determinación del peso molecular se realizó con una columna de filtración
sobre gel TSK G4000SW (300 x 8 mm) TOYO SODA Co, empleando como fase
móvil Agua, NaN3 0.05%, NaCl 0.25M; a una velocidad de flujo de 0.8 mL/min y
presión de 12 atm a temperatura ambiente (25 ºC).
Para la calibración de la columna se utilizaron como patrones polímeros de
dextrana (Pharmacia) T500k, T110k, T70k, T40k, T20k, T10k y polietilenglicol
PEG 6000 y PEG 1000; inyectando 20 L de cada patrón a una concentración de
50 mg/mL. El volumen de exclusión y el volumen total fueron calculados a partir
de los volúmenes de elución de la dextrana T2000k y la glucosa
respectivamente, preparadas ambas a igual concentración (50 mg/mL).
Las soluciones de alginato (cubano y mexicano) se prepararon a una
concentración de 20 mg/mL y se calentaron a 100 ºC durante 5 minutos.
Posteriormente se centrifugó a 1000 rpm y del sobrenadante se inyectaron 20 L
de cada solución.
Se empleó un detector de índice de refracción acoplado al sistema y se
registraron los cromatogramas en un sistema computarizado (BIOCRHOM 2.1)
con el cual se procesaron los datos obtenidos. La determinación de los pesos
moleculares se realizó a partir del coeficiente de partición (K av) el cual fue
calculado según:
Ve − Vo
K av =
Vt − Vo
donde: Kav: Coeficiente de partición
Ve= Volumen de elución del componente (mL)
Vt = Volumen total (mL)
Vo= Volumen muerto o de exclusión (mL)

Determinación de la relación ácido manurónico / ácido gulurónico

(Relación M/G)
Hidrólisis
La hidrólisis del polisacárido se realizó según el método descrito por Haug y
Larsen (1962). Se tomaron 50 mg de muestra y se hicieron reaccionar con 0.5
mL de H2SO4 al 80% durante 18 horas para posteriormente se añadir 6 mL de
agua destilada y lograr una solución ácida 2 N; la hidrólisis se continuó a 100 ºC
durante 5 horas y se neutralizó añadiendo un ligero exceso de CaCO 3 hasta que
no se observó desprendimiento de gas. Finalmente el precipitado se filtró y lavó
2 veces con agua destilada resultando un volumen total de 12 mL.
Cromatografía de intercambio iónico
Para la determinación de la relación M/G se utilizó una columna convencional
(200 x 20 mm) con una resina de intercambio aniónico AG 1-8X, 200-400 mesh
en forma AcO- (Haug y Larsen, 1962). Los 12 mL resultantes de la hidrólisis se
mantuvieron en reposo durante 30 minutos a pH=8 antes de ser aplicados a la
columna, con el objetivo de convertir las lactonas en ácidos.
La separación se realizó empleando un gradiente lineal de 1 mL/min en un rango
de concentraciones desde 0.5 hasta 2M de ácido acético con un volumen total de
300 mL. Se recogieron fracciones de 3 mL en un colector Pharmacia LKB y la
detección se realizó por la técnica colorimétrica del Orcinol (Haug y Larsen,
1962). Las fracciones positivas frente al orcinol correspondientes a cada uno de
los ácidos urónicos se mezclaron y se cuantificaron con ayuda de una curva de
calibración empleando un patrón de ácido glucurónico. Los resultados obtenidos
para la fracción correspondiente al ácido gulurónico se multiplicaron por un factor
de conversión igual a 0.66 teniendo en cuenta la destrucción preferencial del
ácido manurónico durante la hidrólisis (Haug y Larsen, 1962).
Análisis físico químico
La pureza de los productos en estudio se evaluó a través de los métodos de
ensayo descritos en FAO. FOOD AND NUTRITION PAPER, 1992. Los análisis
realizados fueron los siguientes:
• Ensayo de pureza
• Determinación de las pérdidas en el secado
• Determinación de la presencia de fosfatos
• Determinación de impurezas insolubles
• Determinación del índice de pH
• Determinación de cenizas totales
• Prueba límite de arsénico
• Prueba límite de plomo
• Determinación de metales pesados (expresados como plomo)
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Determinación de calcio
Para la determinación de calcio se empleó una técnica de espectroscopia de
absorción atómica utilizando un equipo SP-9 Pye Unicam de la firma Philips, con
el empleo de una llama aire/C2H2. La cuantificación se realizó a través de una
curva de calibración empleando una sal certificada de CaCO 3 en un rango de
concentraciones entre 10 y 100 g/mL.
Todos los análisis se realizaron por duplicado, calculándose la desviación
estándar en los casos que así lo permitieran.
Espectro IR
En la figura 2 se reportan los
espectros IR correspondientes al
alginato cubano y al alginato
mexicano, observándose similares
bandas de absorción para ambas
muestras. En este sentido, se
destacan 3 señales fundamentales:
una banda correspondiente a la
vibración de valencia del grupo
hidroxilo (OH) alrededor de los 3500
cm – 1, la vibración del grupo carbonilo
del carboxilato (C=O) en las
proximidades de los 1680 cm – 1
y la
vibración de valencia carbono-oxígeno
(C-O) cercano a los 1050 cm – 1.
Obviamente el espectro IR para este
tipo de compuesto está dominado por
las señales correspondientes a los
grupos hidroxilos y se caracteriza por
presentar bandas anchas, lo cual es Figura 2. Espectros IR del alginato cubano
atribuible al elevado peso molecular (A) y del alginato mexicano (B).
de estos polisacáridos. Nishide y col
en 1984 reportaron espectros
similares en un estudio comparativo de muestras de alginato de sodio
procedentes Kjellmaniella crassifolia.
Determinación del peso molecular
En la tabla 1 (figura 3) se reportan los resultados obtenidos para la calibración
de la columna bajo las condiciones cromatográficas empleadas, evidenciándose
una buena linealidad avalada por el valor obtenido de R 2= 0.9707, el cual indica
que la regresión explicó el 97% del error total.

Tabla 1
Calibración de columna en la determinación del peso molecular
por cromatografía de filtración sobre gel.
PM Tr Ve Kav log PM
2 000 000 6.93 5.54 0.00 6.30
500 000 9.35 7.48 0.23 5.70
110 000 11.10 8.88 0.39 5.04
70 000 13.04 10.43 0.57 4.85
40 000 13.56 10.85 0.62 4.60
20 000 14.81 11.85 0.74 4.30
10 000 15.67 12.54 0.82 4.00
6 000 16.81 13.45 0.93 3.78
1 000 17.83 14.2 1.02 3.00
Tr: Tiempo de retención (minutos), Ve: Volumen de elución (mL),
Kav: Coeficiente de partición, PM: Peso Molecular (g/mol)
6 y = -2,952 x + 6,3656
R2 = 0,9707
log PM
3
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Kav
Figura 3. Calibración de columna en la determinación del peso molecular
Los cromatogramas obtenidos y valores de peso molecular resultantes para

ambos productos aparecen en la figura 4 y en la tabla 2, respectivamente.
En el caso del alginato cubano, la muestra está constituida por un polímero
homogéneo de peso molecular del orden de 10 5 g/mol, resultando coincidente
con los reportados por Fujihara y col (1989) en muestras de alginato de sodio
obtenidas de Sargassum fullvellum.
En relación con los resultados obtenidos para el alginato mexicano resulta
interesante comentar que el mismo resultó estar formado por tres fracciones de
polímeros de diferente peso molecular lo cual nos lleva a inferir que este
producto está constituido por una mezcla de tres tipos de alginatos, obtenidos en
diferentes procesos de extracción. Se conoce que esta metodología es
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usualmente empleada por firmas productoras mexicanas con el objetivo de lograr

un producto final de viscosidad deseada (Ferrer, 1995).
Por otra parte, las diferencias encontradas entre los pesos moleculares del
alginato cubano y las fracciones del producto de referencia pueden ser atribuidas
a diferencias en la fuente de extracción y en los métodos de obtención
empleados.
Figura 4. Cromatogramas obtenidos en la determinación del peso molecular para el

alginato cubano (A) y el alginato mexicano (B).
TABLA 2
Pesos moleculares obtenidos para las muestras de alginato evaluadas
Alginato Alginato mexicano

Parámetros
cubano Fracción 1 Fracción 2 Fracción3
Tr 9.56 7.60 8.60 9.35
Ve 7.65 6.00 6.90 7.48
Kav 0.25 0.10 0.20 0.23
log PM 5.63 6.20 5.90 5.70
PM 426 579 1 584 893 794 328 501 187
Tr: Tiempo de retención (minutos), Ve: Volumen de elución (mL)
Kav: Coeficiente de partición, PM: Peso Molecular (g/mol)
Determinación de la relación M/G

La relación M/G encontrada para ambas muestras, empleando la cromatografía
de intercambio iónico, se muestra en la tabla 3.

TABLA 3
Relación ácido manurónico / ácido gulurónico (M/G) obtenida para los alginatos
evaluados.
FRACCIONES Relación
Ácido manurónico Ácido gulurónico M/G
PRODUCTO
Concentración Concentración
Absorbancia Absorbancia
(mg/mL) (mg/mL)
Alginato cubano 0.211 0.046 0.569 0.124 0.56
Alginato mexicano 0.511 0.127 0.157 0.032 6
Los resultados obtenidos para el caso del alginato de producción nacional están
en concordancia con reportes de la literatura, donde se plantea que de forma
general, la relación M/G es menor que la unidad para muestras de alginato
provenientes de Sargassum. Nishide y col (1984) estudiaron alginatos obtenidos
de siete especies de Sargassum encontrando relaciones M/G entre 0.39 y 0.65.
Así mismo, Mizuno y col (1982) reportan valores de 0.34 a 0.56 para muestras
de alginato extraídos de cinco especies de Sargassum.
La relación M/G encontrada en el alginato mexicano de referencia es
marcadamente superior a la unidad (6), lo que puede deberse a que las fuentes
de obtención son diferentes. Se conoce que las algas de la especie Macrocystis
pyrisfera, abundantes en el litoral mexicano y fuente de obtención de este
alginato, brindan polímeros de relación M/G  1, (Ferrer, 1995). Otras especies,
como por ejemplo Kjellmaniella crassifolia, son contentivas de alginatos
altamente ricos en ácido manurónico y cuya relación M/G puede alcanzar valores
de hasta 13, (Nishide y col., 1984).
Análisis físico químico de los productos evaluados.
Los resultados de la caracterización físico-química realizada a las 2 muestras de
alginato de sodio estudiadas, aparecen en la tabla 4, en la cual puede observarse
que los productos evaluados cumplen con todos los parámetros especificados por
los organismos internacionales para su empleo como aditivo alimentario, lo que
garantiza la pureza y calidad de estos hidrocoloides.
TABLA 4
Análisis físico químico de los productos evaluados.
Alginato de Sodio Alginato de Sodio Especificación

PARAMETROS
Cubano Mexicano (FAO, 1992)
Ensayo de pureza (%) 95.62 ± 1.85 100.14  2.11 90.8 – 106
Pérdidas en el secado (%) 10.19  0.043 13.63  0.081 15 (máx.)
Cenizas totales (%) 22.69  0.61 22.02  0.63 18 – 27
Sólidos insolubles (%) 0.095 ± 0.003 0.061  0.001 1 (max.)
Fosfatos No detectado No detectado No detectable
Índice de pH 7.5 7.1 6–8
40d78409-8f5a-44ad-af96-811f110af4ad
Alginato de Sodio Alginato de Sodio Especificación

PARAMETROS
Cubano Mexicano (FAO, 1992)
Metales pesados (expresados como Pb) (ppm) Pasa la prueba Pasa la prueba 40 (máx.)
Plomo (ppm) Pasa la prueba Pasa la prueba 10 (máx.)
Arsénico (ppm) Pasa la prueba Pasa la prueba 3 (máx.)
Calcio (mg/ 100 g) 546.9  10.21 155.6  3.84 –
Referente al contenido de calcio se observan niveles 3.5 veces superiores en el

alginato cubano en comparación con el producto mexicano tomado como
referencia. Estas diferencias pudieran ser atribuidas a diferencias en los procesos
empleados para la obtención de estos productos. En el caso del alginato de
procedencia nacional, la precipitación se realizó con adición de CaCl 2 para
obtener alginato de calcio, el cual fue transformado, primero a ácido algínico
empleando HCl y posteriormente a alginato de sodio por adición de Na 2CO3. Por
su parte el alginato mexicano de referencia pudo haber sido tratado
directamente con HCl y posterior adición ce Na2CO3 o bien haber sido obtenido
por el mismo proceso descrito para el alginato cubano pero con una etapa de
descalcificación más eficiente.
Así mismo las diferencias entre las especies de algas empleadas como fuente de
obtención (Macrocystis pyrisfera para el alginato mexicano y Sargassum sp para
el producto nacional) son un elemento a considerar a la hora de explicar estos
resultados.
El hecho de que el alginato cubano posea un mayor contenido de calcio, unido al
elevado peso molecular de este polímero y a la relación M/G encontrada y
discutida con anterioridad, apunta a inferir una elevada viscosidad de sus
soluciones y una alta capacidad para la formación de gel. No obstante, esta
hipótesis debe ser comprobada a través de un estudio reológico de las soluciones
de este polímero.
CONCLUSIONES
Luego de analizar y discutir los resultados de este estudio se pueden arribar a las
siguientes conclusiones:
1. El alginato de sodio de procedencia nacional posee un peso molecular de 426
579 g/mol, mientras que el producto mexicano resultó ser una mezcla
constituida por tres tipos de alginatos de diferente peso molecular: 1 584
893, 794 328 y 501 187g/mol.
2. El alginato de sodio de procedencia nacional es rico en ácido gulurónico
(relación M/G = 0.56), en tanto el polímero mexicano posee mayor contenido
en ácido manurónico (relación M/G = 6).
3. Ambos productos cumplen con las especificaciones físico químicas
establecidas por los organismos internacionales para su empleo como aditivo
alimentario, aunque el alginato cubano posee un mayor contenido de calcio.

BIBLIOGRAFÍA
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partir de algas de arribazón a las costas cubanas. Rev. Alimentaria. No 304. Julio-
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• Zumbado, H; Lewis, L.; Cañizares, E. (2000). Empleo de alginato de sodio obtenido

de algas de arribazón como agente espesante en la elaboración de puré de frutas.
Revista Alimentaria, No 309. Enero-Febrero 2000. Madrid. España.
40d78409-8f5a-44ad-af96-811f110af4ad
15.5. VALIDACIÓN DE UN MÉTODO PARA LA DETERMINACIÓN DE

PATULINA EN JUGOS Y PURÉS DE FRUTAS POR HPLC.
Eyda Otero Fernández-Trevejo, José Antonio Arias Verdés y Ramón Sersa
Espinoza
Fuente: Revista Cubana Aliment Nutr 2001;15(1):20-5. Instituto de Nutrición e
Higiene de los Alimentos
RESUMEN
Se validó el método de la Association of Official Analytical Chemist (AOAC) para la
determinación de patulina en jugo de manzana por cromatografía líquida de alta
presión (HPLC) con detector ultraviolera a 275 nm y una columna RP18, para jugo de
manzana y puré de frutas. Se empleó como fase móvil una mezcla al 10% acetonirrilo-
agua con una velocidad de flujo de 2,7 mLlmin. La patulina presentó un tiempo de
retención de 14,8  0,3 min. La ecuación de regresión fue y = 1952,5X + 1673,5 y el
coeficiente de correlación lineal de 0,9991. Se obtuvo un recobrado medio del 82,51 %
y un coeficiente de variación del 3,33 % para los niveles de contaminación ensayados.
La repetibilidad de una muestra contaminada con 33 g/L de patulina fue de 3,12 g/L.
Se estableció para los jugos el límite de detección en 1,72 g/L y el de cuantificación
en 5,2 g/L. Los purés de frutas fueron previamente diluidos y centrifugados,
proponiéndose para el mango una purificación adicional por columna. Fue diseñado un
control de calidad interno para el procesamiento de las muestras.
Palabras clave: PATULINA: CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA PRESION;

ANALISIS DE REGRESIÓN.
INTRODUCCIÓN
La patulina es una micotoxina producida como metabolito secundario por un gran
número de hongos de los géneros Penicillium y Aspergillus, entre los que se
encuentra incluido el P. expansum. Se le confiere alta toxicidad para células de
plantas y animales. Presenta carácter hepatotóxico, nefrotóxico e inmunotóxico.
Aunque su carcinogenicidad no ha sido demostrada, los expertos proponen
continuar los estudios en animales de experimentación en especies de no
roedores.
La patulina puede detectarse en frutas, hortalizas, cereales enmohecidos y
piensos, no obstante, no puede excluirse la presencia de esta micotoxina en las
frutas aparentemente sanas. El grado de contaminación está relacionado con el
grado de podredumbre y la patulina apenas se extiende fuera de los tejidos
alterados; por consiguiente la exposición humana no es posible sino a partir de
frutas elaboradas.1,2
Estudios realizados en diferentes países indican una moderada a alta incidencia
de patulina, particularmente en productos de manzana, aunque los niveles de
contaminación son generalmente bajos. Ocasionalmente, altas concentraciones
de patulina se han encontrado, alcanzando 1000 g/L o más. Varios países han

establecido un límite regulatorio de 50 g/L, valor que recomienda la

Organización Mundial de la Salud.
Varios métodos analíticos han sido publicados entre los que se encuentran la
cromatografía de capa delgada con revelado de color 3-5, la cromatografía de
gases con agentes derivatizantes y más recientemente la cromatografía líquida
de alta presión (HPLC) con detector UV o arreglo de diodo. 6,7
El objetivo de este trabajo fue establecer y validar un método de análisis de
patulina en jugos y compotas de manzanas por HPLC con detección ultravioleta.
METODOS
Se realizó la validación del método oficial de la Association of Official Analytical
Chemist (AOAC) para la determinación de patulina en jugo de manzana por
HPLC,6 según los principios del Codex.
Este método es aplicado para la detección y cuantificación de patulina en jugo de
manzana y fue extrapolado a otras matrices como puré de peras y mango. La
patulina fue extraída con acetato de etilo y purificada por partición en una
solución de carbonato de sodio. La muestra extraída se secó con sulfato de sodio
anhidro.
Después de evaporar el acetato de etilo, la patulina se redisolvió en 300 L de
fase móvil (10 % acetonitrilo-agua). Para la identificación y cuantificación se
inyectaron 20 L de extracto en un cromatógrafo líquido de alta presión Knauer,
con una bomba isocrática de doble pistón acoplado a un detector Shidmazu UV-
visible modelo SPD-6AV y un integrador Shidmazu modelo C R6A Chromatopac.
Se empleó una columna cromatográfica de 25 cm x 4 mm, rellena con Spherisol
C18 de 100 Aº y 5 m de tamaño de partícula. La columna se almacenó con el
80 % de acetonitrilo agua bidestilada. Se trabajó con el flujo de la fase móvil en
2,7 mL/min. Se estableció la longitud de onda el detector UV a 275 nm y la
sensibilidad a 0,04 unidades de absorbancia en la escala completa.
Para verificar la linealidad de la respuesta del detector UV con respecto a la
concentración de patulina se construyó una curva de calibración con 4 puntos por
triplicado a partir de una solución intermedia de 8,26 g/mL, en frascos
volumétricos de 10 mL con las concentraciones siguientes: 0,248; 0,496; 1.24 y
2.478 g/mL. La determinación de la concentración del patrón de patulina para la
construcción de la curva fue realizada según procedimiento de la AOAC. 8
Para ensayar el método se emplearon muestras de 1 kg de jugo de manzana y
de puré de mango, las cuales son representativas de otras frutas como pera,
melocotón y fruta bomba en cuanto a las interferencias presentes. Las muestras
se dividieron en 5 porciones, una porción fue utilizada como blanco muestra y las
restantes fueron contaminadas con 33; 103,16; 51,63 y 21,16 g/L. La primera
porción contaminada se utilizó para los estudios de repetibilidad y el resto para
conocer la exactitud del método. Cada porción de ensayo fue subdividida en
muestras de 5 mL cada una. Se estableció el límite de detección como la
40d78409-8f5a-44ad-af96-811f110af4ad
cantidad que equivale a 3 veces la desviación causada por el ruido de fondo de

una muestra de jugo de manzana sin contaminar y el de cuantificación como 3
veces el límite de detección del método y se implantó un sistema de control
interno de la calidad.
Los resultados fueron sometidos a tratamientos estadísticos. Se realizó una prue-
ba de Student para determinar los límites superiores e inferiores de la pendiente
de la curva de calibración, y una prueba de Duncan con un nivel de significación
5 %, para determinar si existían diferencias significativas entre los valores de
recobrado obtenidos para los 3 niveles de contaminación empleados en los
estudios de exactitud.
RESULTADOS
La figura 1 presenta la curva de calibración y la ecuación de regresión que re-
laciona las áreas promedio de cada pico calculadas por integración electrónica y
la cantidad de patulina en el intervalo de 4,96 a 49,6 ng, con un coeficiente de
regresión lineal de 0,9991. Los límites superior e inferior de la pendiente fueron
de 2085 a 1820 respectivamente, con una varianza de 41,66.
Figura 1. Curva de calibración

Bajo las condiciones descritas en este artículo, 24,8 ng de patulina producen la
señal, con un tiempo de retención de 14,8 ± 0,3 min (fig. 2).
En la figura 3 se presenta un cromatograma de una muestra de jugo de manzana
contaminada con 33 g/L, donde se observa una buena resolución entre los picos
del hidroximetilfurfural, HMF (contaminante natural de las frutas), la patulina y
otras interferencias provenientes de la matriz y los solventes, con una
repetibilidad de 3,12 g/L y un coeficiente de variación del 5,33 %.
En la tabla 1 aparecen los recobrados de las muestras de jugo de manzana
contaminadas con patulina en recorrido entre 21,16 a 103,26 g/L. Los valores
de recuperación media se encontraron entre 81,09 y 83,54 %, con un coeficiente

de variación máximo del 3,49 %. Entre las medias de los 3 niveles de

contaminación, no hubo diferencias significativas, estableciéndose un recobrado
medio 82,51 %, una desviación típica de 2,74 y un coeficiente de variación de
3,33 %.
Figura 2. Cromatograma de un patrón de Figura 3. Cromatograma de una muestra

24,8 ng de patulina. de jugo de manzana contaminada con 3
g/L.
Tabla 1
Recobrados de patulina en jugo de manzana
Niveles de contaminación
Parámetros
103,26 g/L 51,63 g/L 21,16 g/L
Valor medio (g/L) 85,71 42,81 17,16
Porcentaje de recuperación 83,54 82,91 81,09
Desviación estándar 1,96 2,89 1,78
CV (%) 2,36 3,49 2,19
El límite de detección y cuantificación se estableció en 1,72 Y 5,16 g/L de patuli-

na, respectivamente para los jugos de manzana, pera y melocotón.
Una muestra de jugo de manzana de 25 g/L de patulina enviada como material
de referencia, para el estudio intercalibración FAPAS, dio como resultado 25,3
40d78409-8f5a-44ad-af96-811f110af4ad
g/L de patulina, muy cercano al valor real, lo cual demuestra la competencia

técnica del método.10
En el procesamiento de las muestras de puré de mango y pera fue necesario di-
luir con 5 mL de agua y centrifugar a 3000 r.p.m. durante 15 min para eliminar
los sólidos disueltos y otras interferencias previo a la extracción; a pesar de ello,
en el mango continuaron presentes interferencias asociadas con determinados
pigmentos que impedían una adecuada separación de los picos, por lo que fue
necesario realizar una segunda purificación de los extractos mediante cartuchos
de 1 g de silicagel. El extracto se pasó por columna disuelto en 2 mL de tolueno.
La patulina fue eluida con una mezcla tolueno-acetato de etilo 70:30. Después de
evaporar el solvente, se reconstruyeron las muestras en 600 L de fase móvil.
Los límites de detección y cuantificación establecidos para estos casos fueron de
3,45 y 10,4 g/L respectivamente.
DISCUSIÓN
El tiempo de retención de la patulina se retrasó debido a cambios en la composi-
ción de la fase móvil dados por la evaporación del acetonitrilo al ser sometido a
la desgasificación, lo cual se resolvió ajustando la concentración de dicha fase.
El método validado muestra mejor precisión que el informado en otro estudio
(8,6 %) que utilizó una muestra de jugo de manzana contaminada con 30 g/L
de patulina, determinada por HPLC con detector de arreglo de diodo. 9
Dicho método presentó porcentajes de recuperación similares a los informados
por otros autores,3,4,6 que incluyen la cromatografía en capa fina. Recuperaciones
entre 90 y 101 % aparecen en la literatura, pero con coeficientes de variación
más elevados. 9-11
El límite de cuantificación es similar al del método oficial suizo 1 y está por debajo
del método oficial francés1 que utiliza en la purificación columnas de silicagel.
En las muestras contaminadas de jugos y purés que permanecieron un tiempo
mayor de 2 min en contacto con la solución de carbonato de sodio, se
presentaron recobrados con valores entre 50 y 60 %. Otras pérdidas fueron
observadas cuando la evaporación del solvente llegaba a sequedad en un
evaporador rotatorio, siendo más conveniente una segunda etapa de secado bajo
corriente de nitrógeno. Estas 2 afectaciones en el recobrado se establecieron
como los puntos críticos de control del método.
Para determinar patulina en jugos y puré de frutas, el método descrito es rápido,
simple, sensible, confiable y adecuado. Se recomienda que para procesar 10
muestras de jugo o puré se realice en paralelo 1 blanco y 2 duplicados de una
muestra contaminada con un nivel de 50 g/L de patulina, cuyos recobrados
deben encontrarse entre 79 y 85 % con un coeficiente de variación entre los
duplicados menor del 5 %.

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40d78409-8f5a-44ad-af96-811f110af4ad
15.6. CAROTENOIDES SÉRICOS Y SU RELACIÓN CON LA DIETA EN UN

GRUPO DE ADULTOS CUBANOS
1 2 3
Consuelo Macías Matos, Florian Schweigert, Graciela Serrano Sintes, Gisela Pita
4 2 5 5
Rodríguez, Andrea Hurtienne, Denia Reyes, y Elsa Alonso Jiménez
Fuente: Revista Cubana Aliment Nutr 2002;16(2):105-13. Instituto de Nutrición
e Higiene de los Alimentos
RESUMEN
El objetivo del trabajo fue obtener el perfil de carotenoides séricos en un grupo de
adultos cubanos aparentemente sanos y relacionarlo con la ingesta dietética. En el
estudio participaron 30 voluntarios (20 mujeres y 10 hombres) con edades
comprendidas entre 22 y 53 años. Se les tomó una muestra de sangre para las
determinaciones de carotenoides y vitamina A en el suero por cromatografía líquida
de alta resolución (HPLC); paralelamente se les realizó una encuesta de frecuencia
de consumo semicuantitativa que recogía la información de los alimentos
consumidos los 30 días precedentes. La encuesta incluyó 38 alimentos ricos en
vitamina A y carotenoides, 26 de origen vegetal y 12 de origen animal. Se hizo un
estimado de los alimentos de mayor consumo y su aporte en carotenoides
provitamina A y no provitamina A, así como el de vitamina A y la ingestión media de
carotenoides. Los niveles medios de ingestión fueron licopeno 6,86 mg/día (dado por
el consumo de tomate y papaya), betacaroteno 2,81 mg/día (principalmente tomate
y zanahoria), luteína 0,79 mg/día (calabaza y chícharos), zeaxantina 0,12 µg/día
(naranjas), betacriptoxantina 1,38 mg/día (naranja y papaya) y alfacaroteno 0,60
mg/día (zanahoria y plátanos). Las medias de los carotenoides séricos fueron:
licopeno 38,14 ± 15,94 µg/dL; betacaroteno 16,64 ± 6,36 µg/dL; luteína 16,20 ±
7,61 µg/dL; betacriptoxantina 8,33 ± 6,03 µg/dL; alfacaroteno 6,48 ± 3,42 mg/dL y
zeaxantina 2,30 ± 0,91 µg/dL. El perfil de carotenoides estuvo caracterizado por una
elevada concentración de licopeno y alfacaroteno por un abundante consumo de
tomate y plátanos respectivamente sobre los valores habituales relacionado con el
consumo. Se encontró correlación entre la ingesta y los niveles séricos para los
carotenoides provitamina A y la zeaxantina. Este resultado permite utilizar con
buena precisión la encuesta de frecuencia de consumo en estudios epidemiológicos
para la estimación de los carotenoides.
Palabras clave: CAROTENOIDES/sangre; VITAMINAS EN LA DIETA; FRUTAS; VEGETALES;

ANTIOXIDANTES; VITAMINA A/sangre.
1 2
Doctora en Ciencias Químicas. Licenciada en Bioquímica. Investigadora Titular. Institut
3
für Ernährungswissenschaft, Uni Potsdam. Alemania. Licenciada en Alimentos.
4
Especialista. Doctora en Medicina. Especialista de II Grado en Bioquímica Clínica.
5
Investigadora Auxiliar. Técnica de Laboratorio.

INTRODUCCIÓN
Los carotenoides son un grupo de pigmentos naturales liposolubles que el ser
humano no es capaz de sintetizar y necesita adquirirlos por medio de la dieta. Se
encuentran fundamentalmente en las frutas y los vegetales y les proporcionan
coloración amarilla, anaranjada y roja que a veces se enmascara por el color de
la clorofila dando coloración verde oscura como ocurre en algunos vegetales de
hojas.
En estudios epidemiológicos recientes se ha demostrado una asociación entre ni-
veles elevados de carotenoides en la dieta o en sangre y un efecto protector
contra el desarrollo de enfermedades crónicas como ciertos tipos de cáncer,
enfermedades cardiovasculares, enfermedades degenerativas de la mácula y
1-6
cataratas. Este hecho, sumado a la función de algunos de estos compuestos
como precursores de la vitamina A provoca un interés creciente.
El perfil de carotenoides séricos está determinado fundamentalmente por la die-
ta. Por lo tanto, cambia con la época del año y se manifiestan características por
7-11
países. En el suero humano se han identificado, gracias a la cromatografía
líquida de alta resolución (HPLC), unos 20 carotenoides, muchos de ellos
12
isómeros. Generalmente se cuantifican 6 que se encuentran mayoritariamente
en todos los individuos de distintos países y son: alfa-caroteno, beta-caroteno,
beta-criptoxantina, luteína, zeaxantina y licopeno. Todos ellos tienen actividad
como antioxidantes y solo los 3 primeros son precursores de la vitamina A.
El objetivo del presente estudio fue caracterizar el perfil de carotenoides en
sangre de un grupo de adultos cubanos aparentemente sanos, identificar los
alimentos que contribuyen a la ingestión de cada carotenoide y relacionar los
valores séricos con los de la dieta. Este estudio constituye
el paso inicial en la adquisición de datos de carotenoides individuales en la
población cubana para posteriormente evaluar cambios en las fracciones en
relación con diferentes enfermedades crónicas.
MÉTODOS
El estudio se realizó en febrero de 1998 y participaron 30 voluntarios cubanos
(20 mujeres y 10 hombres) con edades comprendidas entre 22 y 53 a (media =
36 a).
De cada participante se tomó una muestra de sangre en ayunas por punción de
la vena antecubital. La sangre se recogió en tubos con anticoagulante (EDTA), se
centrifugó y el plasma se dispensó en microtubos con tapa que se cerraron des-
o
pués de pasarle una corriente de nitrógeno. Las muestras se guardaron a -75 C
y se mantuvieron congeladas y protegidas de la luz durante el traslado al
Instituto de Nutrición de Potsdam.
A 200 µL de plasma se le añadieron 200 µL de etanol para precipitar las proteí-
nas; seguidamente se extrajo con 1 mL de n-hexano y se agitó durante 10 min.
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Se centrifugó y la capa orgánica superior fue transferida a otro tubo de ensayo.

El proceso de extracción se repitió, se unieron ambos extractos y se evaporaron
a sequedad bajo corriente de nitrógeno. El residuo fue resuspendido en 200 µL
de isopropanol y se puso en baño ultrasónico durante 5 min.
Se determinaron 6 carotenoides: luteína, zeaxantina, beta-criptoxantina, alfa-
caroteno, beta-caroteno y licopeno y el retinol plasmático por HPLC según un
13
método de gradiente en fase reversa en una columna C30 (5 mm, 250 ×
4,6mm; YMC, Wilmington, USA). El sistema de HPLC consistió en 2 bombas
Waters Modelo 515 operando a un flujo de 1 mL/min, un inyector automático
(Modelo Waters 717 plus). La mezcla de solventes comprendió:
− Solvente A: metanol (Roth Chemicals Germany), metil-terbutil-eter (Sigma
Deisenhofen, Alemania) y agua con 1,5 % de acetato de amonio 85:15:2.
− Solvente B: metanol, metil-terbutil-eter y agua (8:90:2).
El gradiente de elución comenzó con 100 % del solvente A, pasando a 93 % del
mismo solvente al primer minuto, manteniéndose por 3 min, seguido de un
gradiente lineal de 45 % de A por 17 min y manteniéndose a 45 % durante 1
min, entonces lineal durante 11 min hasta alcanzar 5 % de A donde se mantuvo
por 4 min, finalizó regresando a 100 % de A en 2 min. Al finalizar el gradiente la
columna se reequilibró con 100 % del solvente A durante 10 min. En la figura 1
se muestra el cromatograma tipo donde se puede observar la separación de los
carotenoides.
Figura 1. Cromatograma de los principales carotenoides del plasma de uno de los

individuos estudiados. Los picos numerados corresponden a: 1) luteína, 2) zeaxantina, 3)
beta-criptoxantina, 4) alfa-caroteno, 5) beta-caroteno y 6) licopeno.

Para la detección y caracterización de los picos se usó un detector de arreglo de

fotodiodo (Modelo Waters 996). Los carotenoides y el retinol fueron cuantificados
midiendo su absorción a 450 y 325 nm respectivamente. Los tiempos de
retención se compararon con estándares externos. Los estándares externos de
luteína, zeaxantina, beta-criptoxantina y licopeno fueron obsequiados por
Hoffmann-La Roche, de Suiza, y alfa-caroteno, beta-caroteno, retinol y plamitato
de retinol fueron de Sigma, Deisenhofen, Alemania.
El mismo día de la toma de la muestra de sangre se realizó una encuesta de fre-
cuencia semicuantitativa de consumo que recogía la información de los 30 d
precedentes, correspondiendo a la época del año de mayor disponibilidad de
frutas y vegetales. La encuesta incluía 38 alimentos ricos en vitamina A y
carotenoides, 26 de origen vegetal y 12 de origen animal. Los datos primarios se
recogieron en términos de medidas caseras, las cuales fueron llevadas a gramos.
La conversión de la ingestión de alimentos a cantidades de carotenoides se rea-
14
lizó mediante el sistema computadorizado CERES.
Las concentraciones de los carotenoides individuales se estimaron a partir de la
15
unificación de los datos de una base española y otra que comprende datos de
diferentes países recopilada por especialistas del Instituto de Nutrición de
16
Wageningen. De acuerdo con ellas solamente se computan los alimentos de
origen vegetal. Con estos datos se creó una tabla auxiliar de carotenoides. Los
valores se expresaron en µg/100 g de alimentos.
Por su estrecha relación con los carotenoides se realizó adicionalmente el análisis
de la vitamina A para el cual se incluyeron todos los alimentos encuestados. Los
porcentajes de adecuación de la ingestión de vitamina A se calcularon a partir de
las Recomendaciones Nutricionales y Guía de Alimentación para la población
17
cubana, considerando valores entre 90 y 110 % como adecuados, entre 70 y
90 % bajos y menores de 70 % inadecuados.
Se seleccionaron los alimentos consumidos por más del 50 % del grupo y se
calculó el consumo medio (gramo por día) y un estimado de su aporte en
carotenoides provitamina A y no provitamina A, así como el aporte de vitamina
A.
Los resultados de la ingestión dietética y los valores en plasma se exponen como
media y desviación estándar; por la elevada variabilidad en ambos casos se
incluyen los valores de la mediana. Se realizó el cálculo de la correlación entre
carotenoides séricos y en la dieta utilizando el coeficiente de correlación de
Pearson con un nivel de confiabilidad del 95 %.
RESULTADOS
En la tabla 1 se presentan los alimentos ricos en carotenoides y vitamina A de
mayor consumo. Solamente una tercera parte de los alimentos que se incluyeron
en la encuesta fueron consumidos por más del 50 % del grupo de estudio.
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Tabla 1.
Frutas y vegetales ricos en carotenoides de mayor consumo por un grupo de adultos
cubanos sanos. Febrero, 1998
% de consumidores
Alimento
n=30 g/persona/d
Tomate 100 155
Naranja 97 135
Chícharos 97 61
Plátano fruta 77 40
Papaya 70 67
Zanahoria 70 24
Plátano “vianda” 70 47
Calabaza 56 17
Lechuga 56 9
La contribución específica de las frutas y los vegetales a la ingestión de cada

carotenoide se muestra en la tabla 2. El beta-caroteno, principal carotenoide
provitamina A, por su amplia distribución en los alimentos fue aportado por casi
todos los alimentos que se incluyeron en la encuesta, aunque solo el tomate y la
zanahoria contribuyeron en más del 50 %; el primero por las cantidades tan
elevadas en que fue consumido y el segundo por su alto contenido. Al alfa-
caroteno contribuyeron los plátanos, que caracterizan la dieta cubana, y la
zanahoria. El 82 % de la ingestión de beta-criptoxantina fue debido a la naranja
y la frutabomba.
Con respecto a la ingestión de carotenoides no provitamina A, los principales
responsables de la ingestión de luteína y zeaxantina fueron la naranja, la
calabaza y el chícharo, mientras que el aporte total de licopeno se debió a solo 3
alimentos: tomate, papaya y guayaba. Otros contribuyentes potenciales hubieran
sido la toronja rosada y el melón de agua pero fueron muy poco consumidos. El
huevo, que tiene un alto contenido de luteína, fue consumido por todo el grupo
de estudio, pero no se computó ya que no está incluido en las bases de datos
usadas.
Los mismos alimentos citados anteriormente como contribuyentes de
carotenoides provitamina A fueron los principales responsables de la ingestión de
vitamina A además del hígado y los huevos (tabla 2).
La tabla 3 muestra las cantidades ingeridas de los carotenoides y de la vitamina
A. Se destacó el valor extremadamente alto del licopeno (mediana = 5,58 mg/d)
y como consecuencia el valor elevado de los carotenoides totales (10,9 mg/d). La
media y la mediana de la vitamina A se encontraron por encima de las
cantidades recomendadas, aunque el 40 % del grupo tuvo ingestiones
consideradas como inadecuadas.

Tabla 2.
Contribución de alimentos a la ingestión de carotenoides y vitamina A en un grupo de
adultos cubanos sanos. (Expresado en término de porcentaje). Febrero, 1998
Carotenoides provitamina Carotenoides no provitamina A

Alimento Beta Beta
Alfacaroteno Luteína Zeaxantina Licopeno Vitamina A
criptoxantina caroteno A
Tomate 30 12 78 18
Naranja 54 9 5 9 65 5
Chícharo 5 5 29
Plátano
10 7
fruta
Papaya 28 16 5
Zanahoria 52 26 6 14
Plátano
18 5
“vianda”
Calabaza 6 6 28 22
Mandarina 6
Maíz 8
Guayaba 5
Hígado 11
Huevos 7
Contribución mínima 5 %
Tabla 3.
Ingestión de carotenoides y retinol en un grupo de adultos cubanos aparentemente sanos
(mg/d)
Media (DE) Mínimo Máximo Mediana

Luteína 0,789 (0,861) 0,008 3,642 0,569
Zeaxantina 0,124 (0,136) 0,000 0,680 0,079
Beta-criptoxantina 1,378 (1,433) 0,102 4,805 0,751
Alfa-caroteno 0,600 (0,694) 0,005 3,389 0,434
Beta-caroteno 2,813 (2,222) 0,405 8,992 2,198
Licopeno 6,855 (5,536) 0,482 23,563 5,581
Carotenoides totales 13,476 (2,195) 7,811 36,348 10,916
Vitamina A 0,919 (0,591) 0,055 2,576 0,826
n= 30
En la tabla 4 se observan las concentraciones plasmáticas de los carotenoides y
de la vitamina A. La fracción principal la constituyó el licopeno (46 %), seguido
por el beta-caroteno (20 %) y la luteína (16 %). No se encontró ningún individuo
con valores deficientes de vitamina A (<20 µg/dL), inclusive el mínimo estuvo
por incima del valor (30 mg/dL) que se considera representativo de un estado
nutricional adecuado de esta vitamina.
Al correlacionar los valores del plasma con la ingestión dietética se encontró que
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el alfa-caroteno presentaba la mayor correlación (r = 0,52; p<0,001). También

tuvieron una correlación significativa para p<0,05 el beta-caroteno (r = 0,47), la
zeaxantina (r = 0,46), la beta-criptoxantina (r = 0,41) y los carotenoides totales
(r = 0,44). No se encontró correlación significativa para la luteína (r = 0,31), el
licopeno (r = 0,16) ni la vitamina A (r = 0,10).
Tabla 4.
Valores de carotenoides y retinol plasmático en un grupo de adultos cubanos
aparentemente sanos (µg/dL)
Media (DE) Mínimo-Máximo Mediana

Luteína 16,20 (7,61) 5,86-41,13 13,11
Zeaxantina 2,30 (0,91) 0,91-4,44 1,99
Beta-criptoxantina 8,33 (6,03) 1,60-28,81 6,33
Alfa-caroteno 6,48 (3,42) 2,14-17,34 5,66
Beta-caroteno 16,64 (6,36) 7,14-30,76 15,33
Licopeno 38,14 (15,94) 16,35-92,00 23,01
Carotenoides totales 88,09 (20,14) 33,36-119,17 71,53
Vitamina A 52,54 (11,39) 30,23-83,02 51,77
n= 30
DISCUSIÓN
Se aprecia poca variedad en el consumo de frutas y vegetales. Alimentos ricos en
carotenoides, como los vegetales de hojas verdes, el pimiento y el melón de
agua, disponibles en el mercado en la época encuestada, fueron de bajo
consumo. Las causas parecen ser la falta de hábito y la poca accesibilidad.
Las cantidades absolutas y la proporción en que se encuentran los carotenoides
en el plasma varían para cada país en dependencia de las fuentes de alimento y
de sus hábitos dietéticos. Mientras que el perfil de carotenoides séricos de los
españoles lo caracteriza una fracción particularmente elevada de beta-
18
criptoxantina por el consumo de naranjas y mandarinas, y el de Francia,
Alemania y otros países la fracción de beta-caroteno y luteína por el consumo de
10,19,20
vegetales de hojas verdes y zanahoria; en el estudio realizado se destaca
una predominante fracción de licopeno por un consumo elevado de tomate y una
fracción de alfa-caroteno con valores superiores a los habituales en la literatura
por el consumo de plátano, alimento típico de la dieta cubana.
El licopeno constituye la fracción principal en el plasma de individuos de la ma-
9,10,20,21
yoría de los países de cultura occidental. Por el contrario, esta fracción no
aparece en estudios realizados en la región de Linxian en China y su ausencia en
el suero, unido a las bajas concentraciones de otros antioxidantes, se relaciona
22
con una incidencia elevada de cáncer de esófago y estómago.

En el presente estudio, el licopeno no solo constituye la fracción principal sino

también se observa que sus valores medios absolutos en plasma son superiores
a los informados en la literatura, inclusive a los de países como Italia, Estados
8,10,21
Unidos e Inglaterra donde el tomate forma parte del menú diario. Los
valores medios de ingestión también sobrepasan los informados en la
8,21
literatura. La época del año en que se realizó la toma de muestra y encuesta
dietética coincidió con el “pico” de la cosecha de tomate. Todos los encuestados
refirieron haber consumido tomate durante el mes anterior, muchos de ellos
entre 6 y 10 unidades por día.
La ingestión y las concentraciones en plasma presentaron valores más bajos para
7-11
el beta-caroteno y semejantes para la luteína a los de otros países.
Se encontró una tendencia a concentraciones más elevadas de los carotenoides
provitamina A en las mujeres que en los hombres, tal y como se reporta en la
7,10,11
literatura, pero no se llevó a cabo el análisis estadístico por lo pequeño de la
muestra.
La variabilidad tanto de los niveles de ingesta como de los valores séricos es muy
alta para todas las fracciones, lo cual está descrito en la literatura y se explica
porque depende de lo que ingiere cada individuo en cantidad y tipo de alimento y
de otros factores como absorción, sexo e índice de masa corporal.
El haber encontrado correlación entre los valores del suero y la dieta para 4 de
los 6 carotenoides analizados permite utilizar con buena precisión la encuesta de
frecuencia de consumo en estudios epidemiológicos para la estimación de los
carotenoides. La falta de significación estadística para la luteína, puede deberse a
que no se computó el huevo, rico en este carotenoide, por no aparecer en las
bases de datos utilizadas. Otros autores que no encontraron correlación para el
licopeno, consideran que esto puede deberse a que las concentraciones
plasmáticas de este carotenoide reflejan la ingestión a medio o largo plazo más
23
que a corto plazo como sucede para el beta-caroteno.
Los valores normales del retinol plasmático parecen responder a que el 53 % del
grupo ingería suplementos que contienen vitamina A, ya que solo el 50 % cubría
las recomendaciones diarias.
El grupo estudiado no pretende ser representativo de la población cubana. Sin
embargo, los resultados obtenidos están apoyados por otros estudios dietéticos
realizados en la misma época del año en distintos grupos de población donde se
24,25
aplicó igual o similar encuesta de frecuencia de consumo (Marrero García M.
Estimación de la ingestión de carotenoides en adolescentes de la Secundaria
Básica de la localidad de Alamar; Reyes ME. Estimación de la ingestión de
carotenoides en adultos de Ciudad de La Habana; Abreu MM. Estimación de la
ingestión de carotenoides en adultos sanos del municipio Ranchuelo. Tesis de
maestría de Nutrición en Salud Pública. 2000).
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AGRADECIMIENTOS
Este estudio se realizó gracias al apoyo financiero brindado por la Oficina
Alemana de Intercambio Científico (DAAD). Los autores agradecen a los volunta-
rios que participaron en el estudio y al Laboratorio de Dietética del Instituto de
Nutrición e Higiene de los Alimentos (INHA) por la asistencia técnica en la
evaluación de las dietas.
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40d78409-8f5a-44ad-af96-811f110af4ad
15.7. OCURRENCIA DE AFLATOXINA M1 EN LECHES CRUDA,

ULTRAPASTEURIZADA Y ORGÁNICA PRODUCIDAS Y
COMERCIALIZADAS EN EL ALTIPLANO MEXICANO
1 1 1 1 1 1
J. Pérez , R. Gutiérrez , S. Vega *, G. Díaz , G. Urbán , M. Coronado y A.
2
Escobar
1
Departamento de Producción Agrícola y Animal. Universidad Autónoma
Metropolitana-Xochimilco, México, D. F.
2
Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA), Apartado 10, San José de las
Lajas, La Habana, Cuba
Fuente: Rev Salud Anim. v.30 n.2 La Habana Mayo-Ago. 2008
RESUMEN
Muestras de leche procedentes del Altiplano Mexicano (9 cruda, 20 ultrapasteurizada
y 15 orgánica) fueron analizadas para determinar la presencia de aflatoxina M 1
empleando columna de extracción de fase sólida (C18), prederivatización con ácido
trifluoracético y cromatografía líquida acoplada a un detector fluorescente. Los
resultados mostraron que el 59% de las muestras presentaron niveles de aflatoxina
M1 y todos los casos se encontraron por encima del límite máximo de residuo de
0.05 µg/Kg propuesto por la Unión Europea. Las medianas de aflatoxina M 1
encontradas en muestras de leche cruda, ultrapasteurizada y orgánica fueron 16.21;
16.1 y 23.1 µg/Kg respectivamente. El porcentaje de muestras por encima del límite
máximo de residuo fue menor en leche de producción orgánica (20%) comparada
con las leches crudas y ultrapasteurizadas que estuvieron por encima del 50 y 60%
respectivamente.
Palabras clave: aflatoxina M1; leche orgánica; México
INTRODUCCIÓN
Cuando los rumiantes consumen alimentos contaminados con aflatoxinas del tipo
B y G, estas son metabolizadas y excretadas en la leche como aflatoxinas M 1 y
M2 (2, 37, 16). La Agencia Internacional de Investigaciones de Cáncer (IARC) ha
reportado a las aflatoxinas B1 y M1 como posible carcinógenos humanos (19),
estos reportes conjuntamente con otros que han demostrado el efecto tóxico de
las aflatoxinas han llevado a que se establezcan límites máximos de residuo
(LMR) en alimentos. La Unión Europea (UE) ha establecido un LMR para la
aflatoxina M1 en leche y productos lácteos de 0.05 µg/Kg (11), mientras el Codex
Alimentarius de la FAO y la FDA de los Estados Unidos han propuesto valores de
0.5 µg/Kg (6, 42).
En el ámbito mundial son múltiples los reportes sobre la presencia de aflatoxina
M1 en leche y productos lácteos desde hace más de tres décadas (40, 48, 26, 35,
28, 27, 37, 33, 38, 7), tema que no ha perdido su vigencia, si se considera que
la inocuidad alimentaria constituye hoy la prioridad principal de muchos países y
de organismos internacionales (12).

En países de América Latina y el Caribe en la última década se ha reportado la

presencia de aflatoxina M1 en leche y productos lácteos (quesos), algunos de
ellos son Argentina (24), Brasil (31, 37); Colombia (9), México (23, 4, 5) y en
Trinidad y Tobago (30). En la mayor parte de los informes se evidenció una
incidencia alta de aflatoxina M1 en muestras analizadas, pero con porcentajes
bajos de muestras con niveles de concentración superiores al propuesto por la
UE (10).
En México los estudios de aflatoxina M1 fueron realizados en el periodo entre
1996-1998 (5) y se desconoce cómo su comportamiento en los últimos años,
además esto se agudiza ya que se ha mencionado que más del 25% de la
producción de las cosechas de alimentos a nivel mundial están contaminadas con
algún tipo de micotoxinas. Es de destacar que la agricultura orgánica está
adquiriendo también creciente importancia en varios países en desarrollo, entre
ellos México con la producción de diversos productos, entre lo que se destacan:
café, granos de maíz azul y blanco, ajonjolí, hortalizas, maguey y otros (39). La
ganadería orgánica recién comienza y los alimentos orgánicos constituyen una
actividad comercial con buenas perspectivas a largo plazo (20,21); la definición
de leche orgánica aún no se ha establecido, pero lo que se considera hasta ahora
es que dicha leche proviene de una ganadería que cumple con un conjunto de
requisitos y condiciones como son respeto al medio ambiente y a los animales,
se evita el uso de agroquímicos y medicamentos sintéticos. El cumplimiento de
estas medidas puede ser verificado por agencias certificadoras (3).
La producción anual se desconoce, pero se sabe que la superficie de la
producción orgánica en México, creció de 25 000 a 220 000 hectáreas en el
periodo de 1994 al 2004. De esas, alrededor del 80% están certificadas y el
restante 20% en proceso de certificación (46). La superficie mundial dedicada a
la producción orgánica alcanza las 22 811 267 hectáreas de los cuales el 21,4 %
se encuentra en América Latina. El país que más hectáreas tiene en producción
orgánica es Argentina que paradójicamente es el tercer lugar con 1.84% del total
de su superficie agropecuaria, ocupando el primer lugar Uruguay con un 4%
(18).
Pocas investigaciones se han conducido para evaluar la inocuidad de los
alimentos orgánicos (25). En la producción orgánica no está autorizado el uso de
fungicidas, por lo que es posible que aparezcan las micotoxinas como
contaminantes naturales en los alimentos cuando existen condiciones climáticas
propicias y, no se cumplen las buenas prácticas agrícolas de manejo y de
almacenamiento. Lo anterior constituye un peligro para el sistema de producción
de leche orgánica. En estudios realizados en leche orgánica y quesos producidos
de la misma se ha reportado la presencia de aflatoxina M 1 (44; 17; 46).
Fue objetivo de este trabajo evaluar la presencia de aflatoxina M1 en muestras de
leche cruda, ultrapasteurizada y orgánica producidas y comercializadas en el
Altiplano Mexicano.
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Un total de 35 muestras de leche ultra pasteurizadas de la cuales 15 fueron
orgánicas, se obtuvieron en diferentes supermercados de la Ciudad de México
durante el periodo de octubre del 2006 a febrero del 2007, además 9 muestras
de leche cruda se colectaron en zonas de la Ciudad de México y Texcoco en el
mismo periodo. La leche cruda se transportó al laboratorio en frascos plásticos
en nevera con hielo y se almacenó a 4°C hasta su análisis. Todas las muestras
fueron tomadas bajo las pautas establecidas en la Guía para el Muestreo de
Leche y Productos Lácteos (29) y analizadas antes de la fecha de su vencimiento.
Las muestras de leche fueron analizadas para determinar su contenido de
aflatoxina M1 por HPLC con detector de fluorescencia de acuerdo a lo establecido
en el método 986.16 de la AOAC (1). La aflatoxina M1 se extrajo de la leche
previamente diluida y caliente a 80ºC sobre una columna de extracción de fase
sólida C18, se lavó la columna con agua:acetonitrilo (95:5 v/v) y se eluyó la
Aflatoxina M1 con éter dietílico sobre otra columna de sílica gel (40-120 mesh),
seguidamente se eluyó con diclorometano:metanol (95:5 v/v). La Aflatoxina M1
extraída con diclorometano: metanol se llevó a sequedad por rotoevaporación. Al
residuo seco se le adicionaron 100 L de hexano y se agitó en vortex por 1
minuto, posteriormente se agregaron 50 L de ácido trifluoroacético (TFA), se
agitó nuevamente en vortex por 1 minuto y se colocó en baño térmico a 40 ºC
por 30 minutos. Posteriormente se evaporó bajo nitrógeno y se resuspendió en
500 L de la fase móvil para su análisis por HPLC. Del estándar de aflatoxina M 1
se tomaron 50 L de la concentración conocida y se procedió de la misma forma
anteriormente descrita.
Se empleó un cromatógrafo líquido de la firma comercial Merck-Hitachi con
detector fluorescente (longitud de excitación y emisión de 365 y 425 nm
respectivamente) y una columna de fase reversa (Lichrocart100 C18 5µm
250x0.4 cm), como fase móvil se empleó una mezcla de
acetonitrilo:metanol:agua en una proporción de 20:20:60 v/v/v, el flujo fue 1
mL/min y se aplicaron 50 µL de estándar de referencia o de la muestra
previamente filtrada por 0.45µm de diámetro de poro. Los cromatogramas
fueron registrados usando una interfase Perkin Elmer NCI 900 y procesados con
el software TOTALCHROM (Versión 6.2).
Todos los reactivos utilizados fueron de calidad reactivo de la firma comercial
Burdick & Jackon y los disolventes metanol y acetonitrilo fueron grado HPLC. El
ácido trifluoroacético fue de JT Baker calidad HPLC. El patrón comercial de
aflatoxina M1 fue suministrado por Sigma-Aldrich (Sigma, St Louis MO, USA) se
diluyó en acetonitrilo benceno (90:10 v/v) y se comprobó su concentración
midiendo su densidad óptica a 350 nm acorde con lo planteado en la AOAC (1)
(Method 971.22 a-Preparación de soluciones y b-Determinación de la
concentración). La columna Lichrocart RP18 (250-4.6 mm di 5µm) fue obtenida
de Merck (Darmstadt Germany) y la columna de extracción de fase sólida C18
(5g) fue conseguida de Phenomenex (StratTM).
Se evaluó la eficacia del método analítico evaluando la linealidad en un intervalo

de 0.1 a 1 µg/mL por triplicado en cada punto y el recobrado en muestras de
leche empleando un nivel de contaminación de 40 ng/g.
Linealidad: Se procesaron cuatro concentraciones en un intervalo de 0.1, 0.25,
0.5 y 1.0 µg/mL del patrón de referencia por triplicado para determinar la
pendiente, el intercepto y el coeficiente de determinación entre el área y la
concentración del analito.
Para la determinación del límite de detección y cuantificación (LD, LC) se
procesaron curvas en el intervalo de la determinación (0.1-1 µg/mL) y en una
cercana al límite de detección (0.05, 0.1 y 0.2 µg/mL) por triplicado en cada uno
de los puntos. Se procedió a determinar los valores de LD y LC y se consideraron
tres y diez desviaciones estándares del blanco para (n) medidas individuales
(Ecuaciones 1 y 2) (34).
Límite de detección = (Ybl + 3 Sbl) /b (1)
Límite de cuantificación = (Ybl + 10 Sb)/b (2)
donde:
Ybl = Estimado de la respuesta del blanco
Sbl = Desviación estándar del blanco
b = Pendiente de la curva de calibración.
Exactitud: Se preparó un nivel de concentración de 40 µg/Kg por triplicado para
el análisis de recobrado.
En la figura 1 se presenta el perfil
cromatográfico de las aflatoxinas M1 y
B1 cuando la muestra es prederivatizada
con ácido trifluoroacético, con tiempos
de retención de 3.08±0.10 y 5.21±0.10
respectivamente. La curva de
calibración (y= 103281x – 5948.7)
mostró una linealidad significativa
(p<0.05) en un intervalo de 0.1 a 1
µg/Kg con un coeficiente de
determinación de 0.9982. Los límites de
detección y cuantificación fueron 26.5 y
30.1 ng/µL respectivamente. El
Figura 1. Perfil cromatográfico de las
recobrado (exactitud) de aflatoxina M1
derivatizaciones de Aflatoxina M1 y B1
en leche fue de 91% para un nivel de con ácido trifluoroacético.
40 µg/Kg con una precisión del 5%.
Trabajos similares donde se ha empleado este método oficial para la
determinación de aflatoxina M1 en leche muestran límite de detección de 15
ng/Kg, valores de recobrados por encima del 90% y valores de precisión entre 7-
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9% (16; 48). Las mayores diferencias encontradas fueron en los tiempos de

retención debido a cambios en la composición de la mezcla de la fase móvil, las
características de la fase reversa empleada en la columna y el flujo empleado,
sin embargo estos resultados obtenidos en el laboratorio muestran que el
método fue eficiente para evaluar la presencia de aflatoxina M 1 en los niveles que
exige la UE y la FDA para 0.05 y 0.5 µg/Kg respectivamente. Además, existe la
posibilidad de proponer métodos no oficiales para el análisis de AFM 1 y validarlos
bajo las pautas indicadas en la Norma ISO 17025, a través de pruebas de
proeficiencia e intralaboratorio. Su aplicación se debe hacer en muestras
problema, un ejemplo de ello se presenta en el trabajo de Gallo et al. (13).
En la tabla 1 se muestra un resumen del número de muestras en diferentes
intervalos de contenidos de aflatoxina M1 en las muestras de leches cruda,
ultrapasteurizada y orgánica producidas y comercializadas en el Altiplano
Mexicano, donde el 59.1% de todas las muestras presentaron niveles de
aflatoxina M1 superior al LMR establecido por la UE (10). El 20% de las muestras
de leche orgánica presentaron niveles superiores al valor establecido por la UE y
la FDA, mientras que los porcentajes de las muestras de leche cruda y
ultrapasteurizada fueron 66 y 50%, respectivamente.
Tabla 1
Frecuencias de ocurrencia de aflatoxina M1 en leches cruda, ultrapasteurizada y orgánica
por intervalo de concentración (g/kg).
nd – 0,05 0,051 – 0,49 0,5 – 9,9 10 - 50 > 50

L. ultrapasteurizada (n=
8 1 1 7 3
20)
L. orgánica (n= 15) 9 1 2 2 1
L. cruda (n= 9) 1 1 1 5 1
SUMA 18 3 4 14 5
Porcentaje (%) 40,9 6,8 9,0 32,0 11,3
Los resultados logrados difieren a lo informado por Carvajal et al. (4) para leches
pasteurizada y ultrapasteurizada. Estos investigadores encontraron contenidos
de AFM1 mayores a 0.05 µg/Kg en 13% de sus muestras estudiadas (n = 290),
en tanto que en este estudio el 52.3% de las muestras (n = 44) presentaron
niveles superiores a 0.05 µg/Kg, incluso la leche con categoría de orgánica
presentó en 20% de los casos (n = 15) valores superiores al límite señalado, lo
cual pone en evidencia que la presencia de aflatoxina M1 en leche es una
problemática actual en México.
Otros estudios realizados en los últimos 7 años en países como Brasil (16; 31);
Colombia (9); Italia (13; 14; 32); Grecia (36) y Corea (22), manifiestan
incidencia alta de aflatoxina M1 en muestras de leche y productos lácteos
(>75%), sin embargo los niveles de concentración (ng/Kg) son bajos y no
sobrepasan en muchos de los casos los límites establecidos por la UE. En este

trabajo no obstante presentar una incidencia del 50%, las medianas obtenidas
para las muestras de leches cruda y ultra pasteurizada fueron mayores al LMR.
Una posible causa de estos valores pueden ser las variaciones de la humedad
relativa en el ambiente, que favorecen la presencia de hongos toxigénicos en los
alimentos destinados al consumo animal. Otro factor que influye en los
resultados obtenidos, pudo tener como origen el consumo de granos y
concentrados, donde existe una probabilidad de la presencia de estas toxinas en
los mismos. La presencia de micotoxinas en México en alimentos del consumo
animal y humano ha sido reportada por varias décadas (15; 8; 41; 23).
En estudios anteriores se ha podido constatar que concentraciones bajas de
aflatoxina M1 pueden deberse a la dilución de lotes altamente contaminados con
numerosos lotes libres o con bajos niveles de contaminación con aflatoxina M 1,
que hace que aparezca una incidencia alta con bajos niveles (32; 33).
Los análisis realizados en muestras de leche orgánica mostraron un valor de su
mediana superior a los registrados para las leches cruda y pasteurizada (Tabla
2), esto pudo deberse a que el factor de dilución a que fue sometido la muestra
es mucho menor, sin embargo su incidencia solo fue del 20% (Tabla 1). Los
hallazgos están en correspondencia con los encontrados por otros autores, donde
se plantea que la frecuencia de aparición de leche orgánica debe ser menor al
resto de la leche, siempre y cuando se cumplan las buenas prácticas
agropecuarias (43; 44). La producción de leche orgánica representa una opción
para la agroindustria, ya que un sector de los consumidores ha modificado en los
últimos años sus preferencias, en la búsqueda por encontrar en el mercado
alternativas que no representan riesgos a corto y a largo plazo para su salud. No
obstante, es probable que aun cuando los productores de leche cumplan con las
características de la producción orgánica aprobadas y establecidas por
organismos certificadores, la aflatoxina M1 y otras sustancias tóxicas puedan
estar presentes en la leche y alimentos orgánicos (45). Este estudio demuestra
que la leche orgánica no está exenta de contaminarse con micotoxinas.
Tabla 2
Valores de las medianas, mínimos y máximos de los contenidos de aflatoxina M1 (g/kg)
en leches cruda, ultrapasteurizada y orgánica comercializadas en el Altiplano Mexicano.
L. ultrapasteurizada L. orgánica L. cruda

Mediana 16,1 23,1 16,2
Mínimo 0,2 0,2 0,4
Máximo 76,6 88,6 92,3
Debido a la alta incidencia de aflatoxina M1 encontrada en el presente estudio en

muestras de leche comercializadas en el Altiplano Mexicano se recomienda
desarrollar un programa de pesquisaje permanente con la meta de prevenir lotes
de leche contaminadas con niveles de aflatoxina M 1 por encima del nivel
40d78409-8f5a-44ad-af96-811f110af4ad
regulatorio establecido en México (0.5 µg/Kg) que evite que la misma pase a la
cadena alimentaria.
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15.8. ANÁLISIS DE LOS COMPUESTOS VOLÁTILES DEL TOMATE DE

ÁRBOL (Cyphomandra betacea Sendtn.) MEDIANTE
MICROEXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA
1 2
Clara E. Quijano * y Jorge A. Pino
1
Universidad de los Andes, Facultad de Ciencias Departamento de Química. Cra.
a
1 Este No. 18- A-10- (Q-826), Bogotá, Colombia E-mail:
cquijano@uniandes.edu.co
2
Instituto de Investigaciones para la Industria Alimenticia, Carretera al Guatao km
3 ½, C.P. 19 200, La Habana, Cuba
Fuente: Ciencia y Tecnología de Alimentos Vol. 16, No. 3, 2006
RESUMEN
Los compuestos volátiles del tomate de árbol (Cyphomandra betacea Sendtn.)
fueron aislados por microextracción en fase sólida del espacio de cabeza y
analizados por cromatografía de gases-espectrometría de masas. Entre los 84
compuestos identificados, 55 se reportan por primera vez. El hexanoato de metilo y
1,8-cineol aparecen como los constituyentes volátiles mayoritarios del tomate de
árbol. Palabras clave: tomate de árbol, Cyphomandra betacea, Solanaceae,
compuestos volátiles, HS-SPME, GC-MS.
INTRODUCCIÓN
El tomate de árbol (Cyphomandra betacea Sendtn.) es una especie, que
pertenece a la familia Solanaceae, nativa de Perú y que crece en varias regiones
tropicales y subtropicales en el mundo (1). En Colombia, esta planta se cultiva
en varias regiones y se considera un producto promisorio exportable.
El tomate de árbol es un arbusto, que puede alcanzar hasta los 5 m de altura.
Sus frutos son bayas ovaladas y alargadas (de unos 10 cm de largo y 5 cm de
ancho); cuando jóvenes son de color verde claro y oscuro y al madurar se tornan
anaranjado o rojo oscuro con cáscara lisa y brillante. En su interior, tiene
numerosas semillas pequeñas, circulares y planas rodeadas por un gel de color
púrpura con alto contenido de antocianinas; las semillas se encuentran reunidas
en el centro de la pulpa de color amarillo. Esta pulpa es jugosa, de olor
agradable y sabor dulce, astringente y ligeramente ácida. Generalmente se
consume como dulce y en jugo (2,3).
Los compuestos volátiles asociados al aroma del tomate de árbol han sido
analizados con el uso de distintas técnicas que incluyen la destilación-extracción
con disolvente simultáneas (4), extracción líquida-líquida (5), extracción con CO2
supercrítico (6), así como destilación a presión reducida (7) y como resultado se
han identificado 84 compuestos en concentraciones muy variables,
probablemente debido a los distintos procedimientos usados para su aislamiento.
La microextracción en fase sólida del espacio de cabeza (HS-SPME) es una
técnica de aislamiento de compuestos volátiles sencilla, rápida, que no emplea

disolvente y con costos relativamente bajos, que se ha utilizado en el estudio del

aroma de diversas frutas (8).
El presente trabajo tuvo como objetivo el análisis de los compuestos volátiles del
tomate de árbol (Cyphomandra betacea Sendtn., var. roja) mediante HS-SPME y
GC-MS.
Para el estudio se utilizaron frutas maduras recolectadas en Caquetá, Colombia y
transportadas por aire al laboratorio antes de las 24 h de cosechadas.
El equipamiento para la SPME fue de Supelco Inc. (Bellefonte, EE.UU.). Se
utilizaron 3 fibras diferentes: polidimetilsiloxano 100 μm (PDMS),
polidimetilsiloxano-divinilbenceno 65 μm (PDMS/DVB) y
carboxenpolidimetilsiloxano 75 μm (CAR/PDMS). Las fibras fueron activadas de
acuerdo a las instrucciones del fabricante. Se realizaron pruebas preliminares con
la fibra de PDMS para establecer las condiciones experimentales para HS-SPME
de los compuestos volátiles del tomate de árbol, particularmente la temperatura
y tiempo de extracción. Para cada extracción, se mezclaron 50 g de pulpa de
fruta sin semillas y 50 mL de una solución de NaCl al 20 % en una licuadora
Braun MR 400 por 10 min y posteriormente se centrifugó a 3 000 rev/min
durante 10 min. Una cantidad de 7 g del sobrenadante fue inmediatamente
colocada en un vial de 15 mL. En cada extracción, la muestra se mantuvo por 15
min para alcanzar el equilibrio térmico y después, la fibra se expuso en el
espacio de cabeza de la muestra durante 30 min. La muestra fue mantenida en
agitación a rev/min a 40ºC. La desorción se realizó por 2 min en el inyector del
cromatógrafo de gases a 250ºC para las fibras de PDMS y PDMS/DVB, y a 300 ºC
para la fibra de CAR/PDMS.
El análisis por cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) se
realizó en un equipo HP 6890 Serie II acoplado a un detector de masas HP-
5973N y a una columna de cuarzo HP-5MS (30 m x 0,25 mm d.i. x 0,25 μm). El
programa de temperatura usado fue: 2 min isotérmico a 50ºC y rampa hasta
220ºC a 4ºC/min. El gas portador utilizado fue helio a 1 mL/min. La temperatura
del inyector, interfase y detector fue de 230ºC. Se inyectó en modo splitless (2
min). Los espectros de masas se midieron a 70 eV. Se calcularon los índices de
retención cromatográficos a partir de una mezcla de n-alcanos de C8-C25.
Los compuestos fueron identificados por comparación de sus espectros de masas
con los reportados en las bases NIST/EPA/NIH y FLAVORLIB (obtenida con
registros de sustancias patrones) y confirmados en muchos casos por
comparación de sus índices de retención (IK) con los de sustancias patrones.
Las determinaciones cuantitativas se hicieron por el método de normalización
interna de análisis por duplicado y se expresaron como porcentajes de áreas en
el cromatograma.
40d78409-8f5a-44ad-af96-811f110af4ad
En el análisis de compuestos volátiles mediante HS-SPME, hay que tener en
cuenta su estructura y volatilidad, la selectividad de la fibra, así como otros
parámetros tales como: la temperatura, tiempo de extracción, agitación, adición
o no de alguna sal y condiciones de desorción. La polaridad de la fibra condiciona
la selectividad del aislamiento, por lo que debe elegirse la fibra atendiendo a las
características de los compuestos a analizar.
Para establecer las mejores condiciones para aislar los compuestos volátiles del
tomate de árbol se ensayaron tres fibras disponibles.
Los resultados con la fibra de PDMS/DVB fueron mejores, debido al mayor
número y concentración de compuestos volátiles. Por tal razón, se seleccionó
esta para analizar los componentes volátiles del tomate de árbol. Debido a que
en el presente trabajo solo es de interés el estudio cualitativo, no se evaluaron
los parámetros experimentales que pudieran influenciar en los resultados
cuantitativos. Con los parámetros seleccionados se obtuvieron cromatogramas
reproducibles con muy pequeña variación de las áreas de picos. Es interesante
señalar, que debido a la presencia de algún disolvente en los otros trabajos
reportados (4-7) fue imposible detectar compuestos muy volátiles, e.g.
acetaldehído, a diferencia de lo que ocurre cuando se emplea la HS-SPME.
En total se identificaron 84 compuestos volátiles, 56 de los cuales se informan
por primera vez en esta fruta (tabla 1).
De acuerdo a las clases químicas presentes, los ésteres dominan el perfil de
volátiles. Estos componentes (50,7 % del total de la composición) incluyen
numerosos ésteres metílicos. De ellos, el hexanoato de metilo y butanoato de
metilo, junto con el butanoato de etilo son los mayoritarios. Los estudios
anteriores (4,5,7) también reportaron concentraciones elevadas de ésteres. La γ-
butirolactona, no reportada anteriormente, fue la única lactona identificada;
mientras que a diferencia de un reporte previo (5), no se encontraron
hidroxiésteres.
En el grupo de terpenoides (27,2 % del total de la composición), varios
hidrocarburos y derivados oxigenados fueron identificados, todos
monoterpenoides. De ellos, el 1,8-cineol y α-terpineol fueron los de mayor
concentración. Los estudios anteriores no habían reportado concentraciones altas
de 1,8-cineol (4-7).
Los compuestos carbonílicos y alcoholes constituyeron 4,7 y 5,2 % del total de
los compuestos volátiles aislados, donde sobresalen el decanal y el 2-metil-2-
dodecanol, este último no informado anteriormente. Otras clases presentes
fueron los ácidos (9,6 %) y fenoles (0,2 %).
Las discrepancias observadas con trabajos anteriores pueden atribuirse no solo a
la técnica de aislamiento, sino al origen de las frutas y al estado de madurez.
El aroma del tomate de árbol rojo ha sido descrito como frutal, herbal, con notas
a madera y especiadas, y con un olor que recuerda al del tomate (3).

Ciertamente, muchos de los compuestos identificados pudieran contribuir al
aroma de esta fruta, particularmente los ésteres, con su bajo umbral de
detección (9) pudieran aportar las notas frutales, mientras que el eugenol y metil
eugenol pueden ser responsables de la nota especiada y el 1,8-cineol de la nota
herbácea (10). Muchos de los ésteres identificados en el tomate de árbol han
sido reportados en otras frutas tropicales y subtropicales; ésteres metílicos
similares a los encontrados en el presente trabajo han sido señalados como
importantes contribuyentes del aroma de las frutas tropicales (3).
Tabla 1. Compuestos volátiles identificados en el tomate de árbol
Compuesto Identificaciona IK %
acetaldehido* A 435 0,2
ácido acetico A 610 0,4
butanoato de metilo A 729 2,7
hexanal A 802 t
butanoato de etilo A 804 2,4
pentanoato de metilo A 828 0,1
butanoato de isopropilo* A 845 0,1
2E-hexenal A 855 0,5
3Z-hexenol A 859 0,3
m-xileno* A 870 t
acetato de 3-metil-3-butenilo* C 885 0,1
-butirolactona A 915 1,8
hexanoato de metilo A 927 36
-tuyeno* B 930 t
benzaldehido* A 960 t
sabineno B 975 0,1
-pineno* A 979 0,1
dehidro-1,8-cineol* B 991 0,6
hexanoato de etilo A 998 0,3
octanal* A 999 0,4
acetato de 3Z-hexenilo* A 1005 0,3
-terpineno* B 1017 0,3
p-cimeno* A 1025 0,2
heptanoato de metilo* A 1026 0,1
limoneno A 1029 0,4
1,8-cineol A 1031 16,4
(Z)--ocimeno B 1037 t
-terpineno A 1060 0,7
dihidromircenol* B 1074 0,1
terpinoleno B 1089 0,1
p-cimeneno* B 1091 0,3
benzoato de metilo A 1092 0,6
linalol A 1097 0,6
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nonanal* A 1101 0,7
cis-oxido de rosa* B 1108 0,3
octanoato de metilo* A 1127 1,8
alcanfor* A 1146 0,1
2E,6Z-nonadienal* A 1155 0,1
p-menta-1,5-dien-8-ol B 1170 0,2
terpinen-4-ol A 1177 0,7
ácido octanoico* A 1180 0,1
butanoato de 3Z-hexenilo B 1186 0,9
-terpineol A 1189 3,1
salicilato de metilo A 1192 0,3
-terpineol* B 1199 0,3
decanal* A 1202 1,1
2-fenoxietanol* B 1228 0,5
neral* A 1238 0,1
carvona* A 1243 t
geraniol A 1253 0,3
geranial A 1267 0,1
ácido nonanoico* A 1271 0,3
acetato de 1,1-dimetilfenetilo* C 1306 0,2
acetato de -terpinilo* B 1349 0,1
acetato de citronelilo* B 1353 0,5
eugenol A 1359 0,1
ácido decanoico* A 1371 0,3
cuminato de metilo* B 1375 0,7
acetato de geranilo* A 1381 0,3
metil eugenol* A 1404 0,1
dodecanal* A 1409 0,6
2-metil-2-dodecanol* C 1423 4,4
cumarina* C 1434 0,1
geranilacetona B 1455 0,6
-isometilionona* C 1480 1
(E)--ionona* B 1489 0,3
butanoato de 1,1- dimetilfenetilo* C 1492 0,4
2-tridecanona* B 1496 0,1
salicilato de isopentilo* B 1537 0,4
ácido dodecanoico* A 1571 1,4
salicilato de pentilo* C 1585 0,2
tetradecanal* A 1613 0,4
benzofenona* A 1628 T
leptospermona* B 1631 1,2
cis-dihidrojasmonato de metilo* B 1656 0,7
ácido tridecanoico A 1672 0,6
2-pentadecanona* A 1696 0,4

2-hexil-(E)-cinamaldehido* B 1750 0,7
ácido tetradecanoico* A 1771 0,9
tetradecanoato de isopropilo* C 1830 0,9
ácido pentadecanoico* A 1871 0,7
ácido 9Z-hexadecenoico* A 1953 0,9
ácido hexadecanoico* A 1971 4,1
t Indica menos de 0,1 % en el cromatograma.
* Identificado por primera vez en esta fruta.
a La identificación según: A, coincidencia de espectro de masas e IK con
sustancias patrones; B, coincidencia de espectro de masas e IK con literatura; C,

coincidencia de espectro de masas con literatura.
CONCLUSIONES
El estudio de los compuestos volátiles del tomate de árbol (Cyphomandra
betacea Sendtn., var. roja) mediante microextracción en fase sólida del espacio
de cabeza y cromatografía de gases-espectrometría de masas arrojó la
identificación de 84 compuestos, de los cuales 55 se reportan por primera vez. El
hexanoato de metilo y 1,8-cineol aparecen como los constituyentes volátiles
mayoritarios del tomate de árbol.
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40d78409-8f5a-44ad-af96-811f110af4ad
15.9. MÉTODO DE MICROEXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA PARA EL

ANÁLISIS DE COMPUESTOS VOLÁTILES EN CERVEZAS
Isabel Thorndike* y Jorge A. Pino
Instituto de Investigaciones para la Industria Alimentaria. Carretera al Guatao, km
3 ½, La Habana, Cuba, C.P. 19200.
Fuente: Ciencia y Tecnología de Alimentos Vol. 20, No. 1, 2010
RESUMEN
Se desarrolló un método por microextracción en fase sólida para la determinación de
compuestos volátiles en cerveza mediante cromatografía de gases-espectrometría
de masas. Se evaluaron tres fibras comerciales comúnmente empleadas en cerveza:
PDMS, PDMS/DVB y CAR/PDMS, cuatro concentraciones de cloruro de sodio (0;
12,5; 25 y 37,5 % m/ v), tres tiempos de pre-extracción (5, 10 y 15 min). Para la
optimización del tiempo y temperatura de extracción se utilizó un diseño de
superficie de respuesta. Los valores optimizados fueron fibra de CAR-PDMS (85 m),
adición de 2 g de cloruro de sodio a 8 mL de muestra, 10 min de preextración,
extracción a 35 ºC por 30 min y 2 min de deserción.
Palabras clave: cerveza, SPME, compuestos volátiles.
INTRODUCCIÓN
En la cerveza existen diferentes compuestos volátiles que caracterizan o le
confieren determinadas características aromáticas deseadas o no deseadas al
producto final (1). La escasa concentración e inestabilidad de muchos de estos
compuestos dificulta la obtención de un concentrado a partir del alimento, que
sea representativo del aroma original y que esté libre de contaminantes u otras
sustancias producidas durante el aislamiento. De ahí que se han desarrollado
técnicas especiales para su aislamiento y concentración, generalmente basados
en la destilación a vacío, técnicas del espacio de cabeza, extracción con
disolventes (2, 3).
El desarrollo de métodos analíticos más sensibles y selectivos se encamina a
detectar componentes en los alimentos. El desarrollo de la técnica de
microextracción en fase sólida (SPME por sus siglas en inglés) ha sido el mayor
avance en el área de los análisis de los microcomponentes orgánicos volátiles
realizados en la última década, principalmente cuando se analiza el progreso del
análisis instrumental y la cuantificación de las muestras concentradas (4). Dentro
de las principales ventajas que presenta este método se encuentran su
simplicidad operacional, el poco tiempo de manipulación de la muestra, lo cual
permite eliminar los errores de este tipo, presenta gran sensibilidad, pues para la
determinación existen parámetros específicos, así como su rapidez a la hora de
ejecutar la determinación (2).
Por tanto el objetivo de este trabajo fue optimizar un método por SPME para la
determinación de compuestos volátiles en cerveza.

Para la estandarización del método se utilizaron fibras para SPME, viales de 15
mL con rosca y membrana de silicona/PTFE y un porta-fibra manual (holder),
todos comercializados por Supelco (Bellefonte, EE.UU.). La extracción de los
compuestos volátiles mediante HS-SPME fue realizada evaluando cada una de las
condiciones en un baño de agua termostatado, con agitación magnética.
Posteriormente la fibra fue retirada del vial e insertada en el puerto de inyección
del cromatógrafo de gases.
Las condiciones iniciales se prefijaron de acuerdo a los reportes encontrados y
las experiencias del laboratorio (5-7). Los viales fueron herméticamente cerrados
con una membrana de silicona. Al inicio del análisis fueron prefijadas algunas
condiciones: 2 g de cloruro de sodio, 8 mL de cerveza, 15 min de extracción a
35ºC, agitación a 100 min-1 y tiempo de desorción de 2 min. Posteriormente se
realizó la extracción de los volátiles en muestras de cerveza Bucanero, con las
condiciones prefijadas de HS-SPME y se identificaron los componentes de la
fracción volátil de la cerveza por cromatografía de gases acoplada a GC-MS.
Se evaluó la capacidad de extracción de tres fibras comerciales reportadas como
las más utilizadas en la extracción de compuestos volátiles (PDMS 100 ì m;
CAR/PDMS 85 ì m y PDMS/DVB 65 ì m).
Se estudiaron tres tiempos de pre-extracción según reportes encontrados, (5, 10
y 15 min), (2). La cantidad utilizada de cerveza se estableció en función de
lograr el mínimo volumen del espacio de cabeza con relación a la muestra, pero
conservando la altura del espacio de cabeza que permitiese la exposición de la
fibra a los volátiles, sin contacto directo con la muestra. Por esta razón, dado que
los viales utilizados fueron de 15 mL, se adicionaron 8 mL de cerveza
previamente filtrada para desgasificar la muestra. Además se evaluó el tiempo
de desorción de los volátiles retenidos por la fibra de PDMS (2 y 4 min) en el
puerto de inyección del cromatógrafo de gases, configurado en modo splitless.
La extracción de los compuestos volátiles se hizo a tres temperaturas controladas
y tres tiempos de extracción, mediante un diseño de superficie de respuesta con
un modelo factorial de tres niveles. Períodos de tiempo de 10, 15 y 20 min
fueron evaluados a temperaturas de 20, 30 y 40ºC.
El análisis se realizó en un cromatógrafo de gases con detector de ionización por
llama de hidrógeno Konik 4000A HRGC con una columna DB-5 (30 m x 0,25 mm
x 0,25 mm) J & W Scientific, Products GMBH Köln). La temperatura del inyector
fue de 250 ºC para las fibras de PDMS, PDMS/DVB y CW/DVB, así como 280 ºC
para la fibra de CAR/PDMS según las temperaturas recomendadas por el
fabricante (Supelco, Bellefonte, EE.UU.). Se utilizó un inserto de 0,75 mm en el
inyector del equipo para favorecer la desorción rápida de los analitos. La
temperatura del detector fue de 250 ºC. El horno se programó desde 50 ºC por 2
min e incremento hasta 250 ºC a 4 ºC/min y sostenido por 8 min. El gas
portador empleado fue hidrógeno con un flujo de 1 mL/min. Los índices de
40d78409-8f5a-44ad-af96-811f110af4ad
retención cromatográficos de los compuestos volátiles se calcularon a partir de

una serie homóloga de n-parafinas (C8-C24).
En el trabajo experimental se utilizó un equipo Shimadzu GCMS QP-5000 (Tokio)
con una columna XTI-5 (30 m x 0,25 mm x 0,25 ì m) (Restek, EE.UU.). El horno
se programó de forma similar a GC-FID. Las temperaturas del inyector y la
interfase fueron 280 y 250 ºC, respectivamente. El gas portador fue helio con un
flujo de 1 mL/min. Los parámetros de adquisición del detector de masas fueron
por ionización electrónica a 70 eV y con un rango de m/z de 35 a 45 Dalton.
Se aplicó la estadística descriptiva que incluyó el valor promedio y desviación
estándar. Se aplicó la prueba de Bartlett para comprobar la homogeneidad de
varianza en todos los casos. La diferencia entre los valores promedios de las
variables dependientes se examinó mediante análisis de varianza de clasificación
simple. En caso de existir diferencias significativas se aplicó la prueba de rangos
múltiples de Duncan (8). Para el procesamiento se usó el programa Statistica
ver. 6 (StatSoft Inc., Tulsa, EE.UU.).
La optimización de la temperatura y tiempo de extracción de la HS-SPME se
realizó mediante las técnicas de superficie de respuesta. Estas técnicas son una
combinación de análisis de regresión y diseño experimental para proporcionar
medios económicos de localizar un conjunto de condiciones experimentales, o
sea una combinación de niveles de factor que proporcionen una respuesta
máxima o mínima. Estas técnicas poseen un rasgo muy distintivo a diferencia de
otras técnicas estadísticas y es su naturaleza secuencial, lo que las hace
apropiadas para la mayoría de las investigaciones que son de tipo continuo (y
por consiguiente secuencial).
Se utilizó un modelo de diseño factorial de tres niveles (modelo 32), lo que
equivale a dos factores con tres niveles. Los factores fueron la temperatura y
tiempo de extracción, mientras que las variables de respuesta fueron el área
total del cromatograma y el número total de picos cromatográficos detectados
(siempre que no fueran contaminantes o posible producto de degradación de la
fibra). Los datos experimentales de área total se transformaron a su valor
logarítmico para garantizar la suposición de aditividad en el análisis de varianzas
(8).
La eficiencia de la extracción de los componentes volátiles depende, en gran
medida, del tipo de fibra a utilizar (4). Se utilizó la técnica HS-SPME debido a
que es una técnica simple y de bajo costo. Dentro de la misma se seleccionó la
variante de espacio de cabeza para evitar la contaminación de la fibra con la
muestra de cerveza.
La figura 1 presenta los resultados de la comparación de las fibras con distintos
tiempos de deserción. El procesamiento estadístico de los datos de área total de
los diferentes experimentos indicó que fueron significativos la fibra, el tiempo y
su interacción para p≤0,05, lo que indica que el área total no se comportó igual
para cada tiempo y fibra. Con la fibra de CAR-PDMS y 2 min de desorción se

logró la mayor área total. Este resultado concuerda con los reportados por otros
autores (9,10). Sin embargo, otros estudios informan que la fibra de PDMS es
más selectiva para el análisis de cervezas (7).
Figura 1. Comparación de las fibras con distintos tiempos de deserción
No se encontraron diferencias significativas en las variables de respuesta área

total y número de picos cromatográficos para los dos tiempos de desorción
evaluados con las fibras de CAR/PDMS, PDMS y PDMS/DVB. Teniendo en cuenta
los resultados obtenidos se seleccionó la fibra de CAR/PDMS y tiempo de
desorción de 2 min para continuar el estudio de optimización al lograr en la
extracción un máximo en las dos variables de respuesta.
Para estudiar este efecto se realizaron experiencias con diferentes
concentraciones de cloruro de sodio (0; 12,5; 25 y 37,5 % m/v), las que
corresponden a la adición de 0, 1, 2 y 3 g de sal común a los 8 mL de cerveza.
Sin la adición de cloruro de sodio solo se apreciaron 15 picos cromatográficos;
mientras que la adición de la sal, independientemente de la concentración, arrojó
la presencia de 20, 25 y 24 picos con el gradiente de concentración. La adición
en la cerveza de 25 y 37,5 % en peso de cloruro de sodio logró un máximo en la
eficiencia de la extracción para p≤0,05.
La figura 2 muestra los resultados del análisis estadístico, en el cual se
obtuvieron las mayores áreas totales para las concentraciones de cloruro de
sodio de 25 y 37,5 % y estas no se diferenciaron entre sí. Por tanto, se
seleccionó la concentración de cloruro de sodio de 25 % m/v para continuar las
experiencias.
Otro de los parámetros estudiados fue el tiempo de preextracción debido a su
relación directa con la eficiencia del método de SPME. Para ello se evaluaron tres
tiempos: 5, 10 y 15 min. Los resultados indicaron que con los tiempos de 10 y
15 min se logró un mayor número de picos con respecto a 5 min.
La figura 3 refleja el cálculo del área total. Al comparar estadísticamente los
valores de áreas totales para 10 y 15 min de pre-extracción no se encontraron
40d78409-8f5a-44ad-af96-811f110af4ad
diferencias significativas para p≤0,05. Por tal razón, se seleccionaron 10 min

para continuar la optimización.
Figura 2. Influencia de la concentración salina en el área total de los picos. Fibra

CAR/PDMS, 8 mL de cerveza, 15 min de pre-extracción y 2 min de desorción.Letras
distintas indican diferencias significativas para p≤0,05.
Figura 3. Influencia del tiempo de pre-extracción en el área total. Fibra CAR/PDMS, 8 mL

de cerveza, 2 g de NaCl y 2 min de desorción. Letras distintas indican diferencias
significativas para p≤0,05.
La selección de las variables que afectan el desarrollo de métodos por HS-SPME

se ha realizado sobre la base de no tener en cuenta sus interacciones,
suponiendo que existe independencia entre los factores o variables que
intervienen en los análisis. La interacción es la respuesta diferencial a un factor
en combinación con niveles variables de un segundo factor aplicado
simultáneamente, es decir, es un efecto adicional debido a la influencia
combinada de dos o más factores.

El tiempo y la temperatura de extracción son dos de los factores más

importantes que afectan la presión de vapor y el equilibrio del sistema. Como
consecuencia la repetitividad y la reproducibilidad de los compuestos volátiles en
el espacio de cabeza, serán grandemente afectadas si existen cambios en la
presión de vapor. Por tanto, para lograr un buen desempeño del método se
optimizaron estos dos parámetros. Para el estudio se seleccionó un diseño de
superficie de respuesta con un modelo factorial de tres niveles para dos factores:
temperatura y tiempo, en el que se emplearon como variables de respuesta el
área total de los picos expresado como su logaritmo y el número de picos
cromatográficos
A partir del logaritmo de las áreas totales se obtuvo un modelo de regresión
múltiple. En el gráfico de contorno, la zona definida por los rangos de
temperatura de 30 a 42 ºC y tiempo de 24 a 37 min fue sugerida como la más
adecuada para el análisis de los componentes volátiles en cerveza.
La figura 4 refleja que en esta zona se obtuvieron valores superiores a 0,85 (de
un máximo posible de 1), para la función objetivo (desirability function). El hecho
de que las temperaturas óptimas sean relativamente bajas resulta ventajoso
pues mantener la fibra a bajas temperaturas es una condición favorable para el
procedimiento de SPME (4). El programa arrojó como solución óptima 30,9 min a
37ºC (desirability = 0,983). Teniendo en cuenta facilitar el control de los
parámetros de la técnica se decidió seleccionar 30 min a 35 ºC, (desirability =
0,957) para los factores de tiempo y temperatura de extracción.
Figura 4. Superficie de respuesta para la optimización del tiempo y temperatura de

extracción

CONCLUSIONES
Se optimizó y validó parcialmente un método de HS-SPME para el análisis de
compuestos volátiles en cerveza. Los valores optimizados fueron los siguientes:
fibra de CAR-PDMS (85 m), adición de 2 g de cloruro de sodio a 8 mL de
muestra, tiempo de pre-extración 10 min, 30 min de extracción a 35 ºC y 2 min
de desorción.
REFERENCIAS
1. Augusto, F.; Pires, A.; Dos Santos, E. y Revellino, S. J. Chromatogr. A 889, 3-14,
2000.
2. Kataoka, H.; Lord, H. y Pawliszyn, J. J. Chromatogr. A. 880, 35-39, 2000.
3. Beattie, S.; Devine, S. y Kirk, L.L. Food Chem. 86, 234-240, 2004.
4. Pawliszyn, J. Applications of Solid-Phase Microextraction. Royal Society of Chemistry,

Cambridge, 1999, pp. 3-21.
5. Christopher, J.; Scarlata, C. y Ebeler, S. J. Agric. Food Chem. 47, 2502-2507, 1999.
6. Smith, R. y Hill, G. J. Chromatogr. A 872, 203-213, 2000.

7. Wardencki, W.; Sowinski, P. y Curyo, J. J. Chromatogr. A 984, 89-96, 2003.
8. Baird, D. Experimentación: Una Introducción a la Teoría de las Mediciones y al Diseño

de Experimento, México, D.F, Prentice-Hall Hispanoamericana S.A., 1991.
9. Jelén, H.; Dabrowska, A.; Klensporf, D.; Nawrocki, J. y Wasowiwicz, E. Chem. Anal.
(Warsaw) 49, 869-872, 2004.
10. Liu, M.; Zerg, Z. y Xiong, B. Chromatogr. A 1065, 287-299, 2005.

15.10. VALIDACIÓN DE UN MÉTODO POR CROMATOGRAFÍA DE GASES

PARA LA DETERMINACIÓN DE LOS ÁCIDOS GRASOS QUE
COMPONEN EL D-004 INGREDIENTE ACTIVO
Eduardo A. Rodríguez-Leyes, David Marrero Delange, Víctor L. González
Canavaciolo, Roxana Sierra Pérez y Yuliamny Adames Fajardo.
Centro de Productos Naturales, Centro Nacional de Investigaciones Científicas,
Calle 198 entre Avenidas 19 y 21, Reparto Atabey, Playa, Apartado Postal
6414,Ciudad de La Habana, Cuba.
Fuente: Revista CENIC Ciencias Químicas, Vol. 40, No. 1, 2009.
RESUMEN
El D-004 es un nuevo ingrediente activo obtenido a partir de los frutos de la palma
real cubana (Roystonearegia), el cual ha demostrado su efectividad en modelos
experimentales de hiperplasia prostática. Esta sustancia está compuesta
principalmente por una mezcla de ácidos grasos (AG) saturados e insaturados libres,
entre 8 y 18 átomos de carbono. Se desarrolló y validó un método por cromatografía
gaseosa para la determinación de los AG en el D-004. Los AG fueron analizados como
ésteres metílicos, obtenidos por reacción con cloruro de acetilo al 10 % en metanol y
separados en una columna capilar widebore BPX-5 utilizando ácido tridecanoico como
patrón interno. En el estudio de especificidad se demostró que no hubo interferencias
en la determinación de esta mezcla, una vez que las muestras fueron sometidas a
condiciones de estrés. La determinación del contenido de AG totales fue lineal (r >
0,999; CVs de los factores de respuesta y la pendiente menores que 5 y 2 %,
respectivamente) y sin sesgo en todo el intervalo estudiado, desde 50 a 150 % de la
masa nominal. Se obtuvieron recobrados elevados en el estudio de exactitud (100,4 a
100,8 %), realizado en un intervalo de 80 a 120 % de la concentración nominal. Se
obtuvieron buenos resultados en los estudios de repetibilidad y precisión intermedia
(CV < 2 %), lo que probó que el método es preciso. Conforme a estos resultados, el
procedimiento validado es apropiado para el control de calidad y los estudios de
estabilidad de este ingrediente activo.
Palabras clave: D-004, ácidos grasos, cromatografía gaseosa, validación, Roystonea

regia
INTRODUCCIÓN
La hiperplasia prostática benigna (HPB) es una de las patologías más frecuentes
en los hombres con más de 50 años y su frecuencia se incrementa con la edad.
Hoy día los medicamentos de primera elección para el tratamiento de la HPB son
los inhibidores de la 5-alfa reductasa prostática y los bloqueadores de los
receptores alfa1- adrenérgicos de origen sintético.1 Por otra parte, existen
algunas sustancias de origen vegetal como el extracto lipídico de saw palmetto
(Serenoa repens), que también son ampliamente empleados en el tratamiento de
esta patología.2 Teniendo en cuenta estos antecedentes, queda justificada la
búsqueda de medicamentos eficaces, seguros y bien tolerados a partir de fuentes
existentes en el país para la terapia y prevención de la HPB, los cuales podrían
incrementar la expectativa y la calidad de vida de la población cubana.

El D-004 es un nuevo ingrediente activo que consiste en un extracto lipídico de

los frutos de la palma real cubana (Roystonea regia), el cual ha demostrado
efectividad en modelos experimentales de HPB. 3-5 Esta sustancia está compuesta
por una mezcla de ácidos grasos (AG) libres entre 8 y 18 átomos de carbono,
siendo los ácidos oleico, láurico, palmítico y mirístico los componentes
mayoritarios.
El desarrollo de un nuevo ingrediente activo lleva implícito, entre otros
requerimientos químico farmacéuticos, contar con métodos analíticos
suficientemente exactos y precisos para su control de la calidad y sus estudios de
estabilidad. Actualmente, los AG son analizados principalmente por
Cromatografía de Gases (CG) en forma de ésteres metílicos y separados por
columnas capilares.6,7 Teniendo en cuenta que en este tipo de extracto lipídico la
actividad farmacológica se le atribuye fundamentalmente a los AG saturados
(C12:0, C14:0),2-5 en el presente trabajo se decidió desarrollar y validar una
metodología para la determinación de los AG que componen el D-004 ingrediente
activo por CG empleando una columna apolar, la cual permite la determinación
individual de los AG saturados y la conjunta de los AG insaturados con igual
número de átomos de carbono. El procedimiento propuesto fue validado
siguiendo criterios bien establecidos 8-11 para asegurar su aplicación en el control
de la calidad y estudios de estabilidad de dicha sustancia.
Reactivos y disoluciones
D-004 ingrediente activo (lote 020205) obtenido en el Departamento Química del
Centro de Productos Naturales, Centro Nacional de Investigaciones Científicas
(Ciudad de La Habana). Patrones de los ácidos decanoico (cáprico, C10:0),
dodecanoico (láurico, C12:0), tetradecanoico (mirístico, C14:0), hexadecanoico
(palmítico, C16:0), 9-octadecenoico (oleico, C18:1), octadecanoico (esteárico, C18:0),
tridecanoico (C13:0) y ésteres metílicos de los ácidos octanoico (caprílico, C8:0), 9-
hexadecenoico (palmitoléico, C16:1) y 9-octadecenoico (oleico, C18:1).
Disolución metilante (DME) de cloruro de acetilo 10 % en metanol.
Disolución de hidróxido de sodio en agua (NaOH-H2O) 2 mol/L.
Disolución acuosa de peróxido de hidrógeno (H2O2) 30 %.
Disolución matriz de referencia (DMR). Se pesaron con exactitud de 0,1 mg,
alrededor de 10 mg de cada uno de los ácidos siguientes: C 10:0, C12:0, C14:0, C16:0
y C18:0 en un tubo de ensayos y se aplicó la metodología analítica.
Disolución de Referencia de ácidos (DRA). Se pesaron 15,37; 452,61;
188,10; 247,12; 53,38 y 829,00 mg de los ácidos C10:0, C12:0, C14:0, C16:0, C18:0 y
C18:1 y se disolvieron en 100 mL de n-hexano.
Disolución de patrón interno (DPI). Se pesó con exactitud de 0,1 mg,
alrededor de 1 g de C13:0, y se disolvió en 100 mL de metanol.

En el estudio se emplearon patrones de SIGMA (St. Louis, MO, USA); reactivos y

disolventes (MERCK, Darmstadt, Alemania) y agua destilada.
Equipos
Cromatógrafo de gases GC 14A (Shimadzu, Japón) con detector de ionización por
llama (DILL), acoplado a sistema de cómputo (Konixbert, Barcelona, España),
con columna capilar wide-bore con fase enlazada BPX-5 (30 m x 0,53 mm d.i. y
1,5 μm de espesor de película, SGE, Australia). Programación: de 120 ºC (2 min)
a 320 ºC, a 10 ºC /min . Flujo del gas portador (H 2): 8 mL/min . Temperatura
del detector y el inyector: 320 ºC y volumen de inyección: 1 μL en modo
splitless.
La especificidad del método se comprobó por CG–Espectrometría de Masas (CG-
EM). Se utilizó un cromatógrafo de gases 6890N con detector selectivo de masas
5975 B Inert acoplado a un sistema de cómputo y con columna capilar HP-5MS
(30 m x 0,25 mm d.i., 0,25 μm de espesor de película, Agilent Technologies, CA,
USA). Programación: de 70 °C (1 min) a 180 a 20 °C/min, de 180 a 230 °C a 2
°C/min, y de 230 a 320 °C a 20 °C/min . Temperatura del inyector: 300 ºC, y
volumen de inyección: 0,5 μL en modo splitless. Flujo del gas portador (He): 1
mL /min . Temperaturas de la fuente, la interfase y el cuadrupolo fueron 250,
300 y 150 ºC, respectivamente. La energía de ionización fue 70 eV . El espectro
de masas fue adquirido continuamente de 40 a 800 m/z en modo scan.
En un tubo de ensayos se pesaron, con exactitud de 0,1 mg, alrededor de 100
mg de D-004. Se agregó 1 mL de la DPI, 3 mL de DME, 5 mL de n-hexano y se
cerró herméticamente. Se colocó en un termostato seco a 85 ºC durante 30 min
con agitación vigorosa ocasional. Se sacó del termostato y se dejó enfriar a
temperatura ambiente. Se adicionaron 3 mL de la disolución de NaOH. Se agitó
en la zaranda durante 15 min . Se dejó reposar durante 2 min para separar las
fases y se extrajo una alícuota de 1 mL de la fase orgánica (superior) hacia un
vial, se reconstituyó con 1 mL de hexano, se cerró y se agitó manualmente
durante 30 s. Finalmente se tomó 1 μL por la técnica de solvent-flush para el
análisis por CG.6
Método de análisis cualitativo
Como criterio de identificación por CG-DILL se determinó la retención relativa de
cada uno de los ácidos siguientes: C8:0, C10:0, C12:0, C14:0, C16:1, C16:0, C18:1 y C18:0,
para lo cual se tomó como referencia al patrón interno C 13:0. La retención relativa
determinada fue comparada con la obtenida del análisis de sus patrones
comerciales como ésteres metílicos. La identificación fue corroborada por CG-EM
a través de la comparación de los espectros de cada AG con los de los patrones
comerciales y los que aparecen en la biblioteca Wiley. Los fragmentos
característicos (principalmente, m/z 74, 87, 143) e iones moleculares (M+) de los
ésteres metílicos de los AG fueron examinados e interpretados.

Método de análisis cuantitativo

La determinación cuantitativa se realizó por el método del patrón interno, previo
cálculo de los f mi a partir de la DMR y utilizando como referencia al patrón
interno C13:0. Los ácidos linoleico (C18:2) y linolénico (C18:3) se cuantificaron como
ácido oleico (C18:1), para el ácido C8:0 se utilizó el f m
i calculado para el ácido C10:0
y para el ácido palmitoleico (C16:1) se utilizó el f m
i calculado para el ácido C16:0.
El contenido de cada compuesto ( Ci ) en el D-004 se determinó por el método del

patrón interno,12 mediante la ecuación siguiente:
m
Ai ∙ f i ∙ mpi ∙ 100
Ci = (%)
Api ∙ mm
donde:
Ai área bajo el pico cromatográfico del componente a analizar.
mpi es la masa de patrón interno (mg).
Api es el área bajo el pico cromatográfico del patrón interno.
fm
i es el factor másico de respuesta relativa.
mm es la masa de la muestra.
El contenido total de D-004 se determinó por la sumatoria de los porcentajes
individuales hallados. Los f m
i se calcularon a partir del análisis cromatográfico de
la DMR.
Validación
Aplicabilidad del sistema. Se realizaron seis réplicas de inyección de una
muestra de D-004 siguiendo la preparación descrita anteriormente. A partir de
los cromatogramas obtenidos se determinó: la resolución cromatográfica entre
los ácidos C16:0-C16:1 (n = 3), la cual debía ser mayor o igual a 1; la retención
relativa de cada ácido (n = 3), la que debía coincidir con la calculada con cada
patrón y la repetibilidad de la inyección, para la cual el CV % de la cuantificación
total (n = 6) debía ser menor que 0,8 %.
Especificidad. La especificidad del método fue determinada al comparar los
cromatogramas del D-004, el estándar interno y las muestras de D-004
sometidas a condiciones propicias a la ocurrencia de degradación. Estas
condiciones fueron: termólisis (103 ºC, 7 d), oxidación (1 g de D-004 en 1,5 mL
de H2O2 al 30 % a 25ºC, 7 d), y fotolisis (254 nm a 25 ºC, 7 d); y se llevaron a
cabo en ampolletas de vidrio neutro, a las cuales se les insufló nitrógeno y se
sellaron (n = 3). La pureza cromatográfica de las señales fue comprobada por
CG-EM.
Linealidad. El estudio constó de cinco puntos, con tres réplicas cada uno. Estos
puntos representaron el 50, 80, 100, 120 y 150 % de la masa de D-004 que se
emplea en el análisis de las muestras, por lo que se pesaron alrededor de 50, 80,
100, 120 y 150 mg de D-004 y posteriormente, se procedió con la preparación

descrita anteriormente. A partir de las masas analizadas y las áreas obtenidas,
se calculó la ecuación de regresión: y = b x + a, por el método de los mínimos
cuadrados. Para ello, se graficaron las relaciones de áreas obtenidas (y = Ai/Api)
en función de las relaciones de masas añadidas (y = mi/mpi), donde Ai y mi son
el área y la masa del total de AG y Api y mpi son el área y la masa del patrón
interno. Se realizaron pruebas estadísticas (p= 0,05) para comprobar la
linealidad y proporcionalidad, para lo cual se debían cumplir los criterios
siguientes: coeficiente de correlación (r) ≥ 0,990, coeficientes de variación de los
factores de respuesta (CV f) y de la pendiente (CVb) ≤ 5 % y ≤ 2 %,
respectivamente. Además, los límites de confianza del intercepto (a) debían
incluir el cero.8-11
Exactitud. La exactitud se evaluó por un estudio de recobrado en un intervalo
de 80 a 120 % de la concentración nominal de AG. Se aplicó el método de
Adición de Patrón, para lo cual se utilizó la DRA, la cual simula la proporción en
que se presentan estos AG en el D-004. De esta disolución, se tomaron 1, 2 y 3
mL y se añadieron a tubos de ensayos (n = 3). Luego se llevaron a sequedad a
40 °C con un flujo suave de N2 y se adicionaron 60 mg aproximadamente de D-
004. Se analizaron en paralelo las muestras de D-004 sin y con adición de la
mezcla patrón de AG. La diferencia de resultado de “muestra + patrón” menos
“muestra” se comparó con la cantidad añadida. Con el objetivo de comprobar si
la concentración afectaba los resultados se realizó una prueba de Cochran para
p= 0,05. Los recobrados fueron calculados [(cantidad encontrada/cantidad
añadida) x 100 %] y se les realizó una prueba t de Student (p =0,05) para
comprobar si existían diferencias significativas con el 100 %, según la ecuación
siguiente: 8-11
̅|
|100 - R
texp = √n
CV
donde:
̅ es el recobrado promedio obtenido.
R
n es el número de réplicas.
Precisión. Este parámetro se determinó mediante ensayos de repetibilidad (un
mismo analista realizó 10 réplicas de análisis de la misma muestra, en el mismo
día y en el mismo equipo) y de precisión intermedia (dos analistas analizaron
tres muestras independientes con cuatro réplicas en tres días diferentes, en el
mismo equipo). Se calcularon los CV (%) de la determinación de cada ácido y del
contenido total, y se halló además, el límite de confianza (LC= media ± t x
DE/n1/2) de la determinación del contenido total de ácidos para p= 0,05. Para
determinar si hubo diferencias significativas, se realizó una prueba ANOVA de
dos vías (p= 0,05). Además, se consideró como criterio que los CV deberían ser
≤ 2 %.8-11

El procedimiento analítico permitió una determinación rápida, confiable y
reproducible de los AG que componen el D-004 ingrediente activo. Debido a que
los f m
i de los AG individuales estuvieron alrededor de la unidad, por lo que se
asumió que el f m
i = 1 para el cálculo cuantitativo de cada AG, lo cual coincide con
lo descrito para el análisis de AG por CG con DILL 6,7 y demuestra que en el
proceso de inyección no ocurren efectos discriminatorios.
Al estudiar la aplicabilidad del sistema, se comprobó que la resolución
cromatográfica entre los ácidos C16:1 y C16:0 en las tres determinaciones fue
mayor que el límite de aceptación (1,0); lo cual garantizó una separación
adecuada de las señales de interés (figura 1, tabla 1). La determinación del
contenido total de AG en las seis réplicas de inyección presentó un CV de 0,5 %,
inferior al límite de aceptación (0,8%).
Figura 1. Superposición de los perfiles cromatográficos de D-004 (superior) y ácido

tridecanoico (C13:0) utilizado como estándar interno. Todos analizados como ésteres
metílicos
Tabla 1. Resolución cromatográfica C 16:1-C 16:0 (n = 3) y cuantificación (n = 6).
Réplica R16:1-16:0 Contenido de AG (%)

1 1,47 90,6
2 1,50 90,8
3 1,54 91,2
4 — 90,9
5 — 91,6
6 — 91,7
CV (%) 0,50

También, las retenciones relativas calculadas (n=3) coincidieron con las

obtenidas para los patrones de referencia, todo lo cual permitió comprobar que el
sistema analítico cumplía con los criterios de aplicabilidad para ser utilizado en la
validación del método.
Especificidad. En los cromatogramas obtenidos, se observó una adecuada
resolución entre las señales correspondientes a los AG que componen el D-004
ingrediente activo. No se detectó interferencia con el patrón interno C 13:0 (figura
1), lo cual permitió su empleo como sustancia de referencia. Al analizar los
cromatogramas de las muestras sometidas a condiciones de estrés no se observó
la aparición de ninguna señal que interfiriera con los analitos de interés (figura
2). A su vez, se comprobó por CG-EM la pureza cromatográfica de las señales
correspondientes a las muestras analizadas, con lo que se descartó el
solapamiento de posibles productos de degradación u otras interferencias con los
AG que componen el D-004. El método, por tanto, demostró ser específico para
el análisis del D-004, incluso al ser este sometido a condiciones extremas, por lo
que puede ser utilizado en estudios de estabilidad.
Figura 2. Superposición de perfiles cromatográficos de D-004 (superior) y D-004

sometido a condiciones de degradación (termólisis).
Linealidad. La ecuación de regresión calculada a partir de relaciones de masas

analizadas y las relaciones de áreas obtenidas (tabla 2) para el total de AG fue:
y = (0,914 ± 0,012) x – (0,080 ± 0,121),
con intervalos de confianza calculados para un 95 % de confiabilidad. El
coeficiente de correlación (r= 0,999) fue superior al límite de aceptación (0,990),
el CV de los factores de respuesta (CV f = 0,8 %) y el CV de la pendiente (CVb =
0,6 %) fueron menores que los límites de aceptación (5 y 2 %,

respectivamente), y el intervalo de confianza del intercepto incluyó el cero,

indicando la ausencia de sesgo. Dichos parámetros cumplieron con los criterios
exigidos,8-11 por lo que se pudo considerar que el método es lineal en el intervalo
de masas estudiado.
Tabla 2. Resultados del ensayo de linealidad del método.
mi/mpi Ai/Api
4,7 4,2
5 4,5
4,9 4,4
8,2 7,3
8 7,3
8,2 7,4
10,1 9,2
10 9,1
10,1 9,2
12,2 11
12,2 11
12,1 11
14,7 13,4
14,8 13,5
14,7 13,4
Exactitud. En este ensayo los recobrados promedios obtenidos estuvieron entre

100,4 y 100,8 % (tabla 3). Al aplicar la prueba estadística t se encontró que no
había diferencias significativas entre los recobrados y el 100 %, al ser las t exp.
inferiores a las t tabuladas para un 95 % de confiabilidad (4,30 para los puntos
individuales y 2,31 para el promedio). También se detectó que las varianzas de
las determinaciones en las diferentes concentraciones utilizadas eran
equivalentes, al ser la Gexp. (0,59) < Gtab. (0,87), lo cual indica que el factor
concentración no influyó en la variabilidad de los resultados. En tal sentido, se
encontró que existía una adecuada correlación entre las masas teóricas y las
encontradas en la práctica (mg), al ser r= 0,999 y p < 0,000 1. La ecuación de
regresión fue:
y = (1,016 ± 0,041) x – (0,241 ± 1,575),
lo cual demuestra que la pendiente incluye al 1 y al quedar incluido el cero en el
intervalo de confianza del intercepto no existe sesgo. 8-11 Estos resultados
confirman que el método es exacto en todo el intervalo de concentraciones
estudiado.

Tabla 3. Resultados del estudio de exactitud del método (n = 3).
Masa encontrada (mg)

Añadida Recobrado medio (%) t exp
1 2 3
17,9 17,4 18,6 17,8 100,4 0,23
35,7 36,4 36,1 35,5 100,8 1,19
53,6 52,9 55,3 53,6 100,6 0,48
Total 100,6 0,93
Precisión. En el ensayo de repetibilidad los CV variaron de la forma esperada,
de acuerdo con los contenidos individuales de los AG del D-004 (tabla 4). Así, la
dispersión más alta se obtuvo para el componente que se encuentra en menor
proporción: el C8:0, sin embargo esto no afectó la dispersión de la determinación
para el total, cuyo CV= 0,4 % asegura la repetibilidad de los resultados al ser
aplicado el método, pues es inferior al límite de aceptación comúnmente exigido
para este tipo de análisis (2 %).8-11 Al estudiar la precisión intermedia (tabla 5),
la determinación realizada por los dos analistas en los tres días de estudio (n=
24) presentó un CV= 0,6 %, resultado inferior al límite de aceptación (2 %); 2 lo
que indica que los factores analista y día no influyeron en la precisión de los
análisis. También se constató, mediante la prueba de ANOVA, ausencia de
diferencias significativas entre ambas series de resultados en cuanto a la
determinación del contenido de AG totales (p= 0,43), lo cual confirma la
adecuada precisión del método. Los LC calculados en este ensayo fueron: (90,6
± 0,3) %.
Tabla 4. Resultados del ensayo de repetibilidad (n = 10).
AG Media ± DE (%) CV
C8:0 0,7 ± 0,05 7,1
C10:0 0,7 ± 0,00 0
C12:0 22,8 ± 0,18 0,8
C14:0 9,6 ± 0,05 0,5
C16:1 0,4 ± 0,00 0
C16:0 12,4 ± 0,08 0,7
C18:1 a 41,8 ± 0,23 0,6
C18:0 2,6 ± 0,05 1,9
Total 91,0 ± 0,42 0,4
Tabla 5. Resultados del ensayo de precisión intermedia.
Contenido de AG (%)
Réplicas Analista 1 Analista 2
Día 1 Día 2 Día 3 Día 1 Día 2 Día 3
1 90,5 90,7 90,4 90,4 90,5 90
2 91,1 91,5 90,4 91,3 90,1 90,2

Contenido de AG (%)
Réplicas Analista 1 Analista 2
Día 1 Día 2 Día 3 Día 1 Día 2 Día 3
3 91,6 90,8 90,6 91,6 90 89,3
4 90,6 90,8 89,9 91,1 91,1 90,8
Media (%) ± DE 90,7 ± 0,48 90,5 ± 0,66
CV (%) 0,5 0,7
CONCLUSIONES
El método analítico propuesto para la determinación del contenido de los AG en
el D-004 ingrediente activo, cumplió con los requerimientos para considerarse
validado, demostrando ser específico, lineal, exacto y preciso. De esta manera el
método puede ser utilizado en el proceso de control de calidad y estudios de
estabilidad de este ingrediente activo.
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12. Novák J. Quantitative Analysis by Gas Chromatography, Second Edition, Cazes J.

(ed.) New York, Marcel Dekker, 79-135, 1988.

A péndices
En este apartado se presentan cuatro apéndices que constituyen un resumen de los
aspectos más importantes de los métodos abordados en este libro, presentados en
forma de esquemas y tablas principalmente.
En el apéndice A se sintetizan los contenidos correspondientes al capítulo 1
(Introducción al análisis instrumental de los alimentos), fundamentalmente los
relacionados con el lugar y papel de esta disciplina en las Ciencias Alimentaria, la
metodología analítica general y los criterios de calidad de los métodos e
instrumentos.
El apéndice B contiene los fundamentos generales de los métodos ópticos (capítulos
2-7), los procedimientos para el tratamiento de las muestras, las características del
equipamiento y los métodos de cuantificación empleados.
Los aspectos más relevantes de los métodos cromatográficos se plasman en el
apéndice C (capítulos 8-12), insistiendo en los principios de funcionamiento, los
mecanismos de separación y los aspectos relacionados con la eficiencia de una
columna cromatográfica, así como el instrumental y los procedimientos de
identificación y cuantificación de la cromatografía líquida de alta resolución, la
cromatografía de gases y la cromatografía en capa delgada.
Finalmente el apéndice D recoge un apretado extracto de los métodos
potenciométricos (capítulo 13) haciendo hincapié en el fundamento, los tipos de
electrodos y las aplicaciones analíticas.
Los apéndices que se presentan en este apartado constituyen un intento de
síntesis, sistematización e integración de los contenidos más significativos, pero en
ningún momento sustituyen el estudio profundo y pormenorizado de los capítulos.
El lector debe tener esto muy presente y utilizar estos resúmenes solo como un
material orientador de los aspectos más importantes de cada grupo de métodos. De
hecho lo verdaderamente productivo sería que el alumno elaborara su propio
resumen integrador una vez que haya profundizado en el estudio del cuerpo teórico
de este texto.
Apéndice A
Resumen de los aspectos generales del análisis de los alimentos
A-1. Lugar y papel del análisis de los alimentos en las Ciencias Alimentarias.
A-2. Metodología analítica
A-3. Algunos procedimientos de preparación de la muestra.
Procedimiento Descripción
Homogenización Su objetivo es contribuir a que la porción de ensayo sea representativa de la muestra bruta. Se realiza
triturando y mezclando las muestras sólidas y semisólidas o por agitación fuerte en el caso de los
líquidos, fundamentalmente las suspensiones como los jugos. En el caso de las emulsiones, como la
leche por ejemplo, un calentamiento en baño de María facilita el proceso de homogenización.
Secado y desgrasado Se realizan cuando el contenido de humedad y/o grasa constituyen interferencias para el análisis. El
secado se efectúa sometiendo la muestra a temperaturas superiores a 100ºC en estufa, mientras que el
desgrasado se realiza extrayendo la grasa con solventes orgánicos.
Dilución Se emplea para muestras líquidas en las cuales el analito se encuentra en altas concentraciones o en
productos fuertemente coloreados cuya coloración interfiere en el análisis. Es uno de los procedimientos
más simples de preparación.
Extracción sólido- líquido Consiste en la extracción del analito a partir de una matriz sólida empleando un disolvente adecuado
capaz de solubilizar el componente en estudio.
Destilación El analito se separa del resto de los componentes que pueden interferir en el análisis aplicando un
procedimiento de destilación con vapor de agua.
Incineración La incineración es el proceso de combustión de la materia orgánica que deja un residuo de material
inorgánico conocido como cenizas. En algunas determinaciones de compuestos de naturaleza inorgánica
se requiere eliminar primeramente el material orgánico para facilitar el análisis.
Digestión Es un proceso de hidrólisis (ácida fundamentalmente) de la materia orgánica, que puede incluso, en
función de las condiciones de tratamiento, producir agentes oxidantes que transforman la materia
orgánica a dióxido de carbono, vapor de agua y otros compuestos volátiles.
Reflujo Es una operación que se realiza con el fin de propiciar o acelerar una reacción química entre dos
sustancias mediante la aplicación de calor. Consiste en colocar las sustancias reaccionantes (en
disolución), en un frasco erlenmeyer de tapa esmerilada conectado a un condensador de reflujo o tubo
refrigerante, a través del cual circula agua. Se aplica calor al frasco erlenmeyer, mediante mechero,
plancha de calefacción o baño termostatado, y la reacción ocurre a altas temperaturas sin pérdida de
los reaccionantes, por cuanto los vapores desprendidos se condensan al chocar con el tubo refrigerante
y caen nuevamente en el seno de la solución.
A-4. Criterios de calidad de los instrumentos y métodos de análisis.
Criterios Definición Expresión para el cálculo

Describe la reproducibilidad de los resultados; es decir, la concordancia S
CV= ∙ 100
Precisión entre los valores numéricos de dos o más medidas que se han realizado ̅
X
exactamente de la misma forma
Es la proximidad de la concordancia entre el valor promedio obtenido en una
serie de resultados de ensayo y el valor de referencia aceptado de la X
̅ experimental
Veracidad % Recuperación = 100
propiedad analítica que se está midiendo, o sea, el contenido verdadero de Valor real
un analito dentro de la muestra en estudio
Capacidad de un método o un instrumento analítico de obtener resultados
y = mx + a
Linealidad proporcionales a la concentración de analito en la muestra dentro de un
R2
intervalo determinado
Se define como la pendiente de la curva de calibrado a la concentración
Sensibilidad S = mc + Sbl
objeto de estudio
Es la mínima concentración o la mínima masa de analito que se puede
Límite de detección 3 Sbl
detectar para un nivel de confianza dado.
Es la cantidad más baja de analito en una muestra que puede ser
Límite de
cuantitativamente determinada con cierta confianza. A este límite también 10 Sbl
cuantificación
se le llama límite de determinación
Es el intervalo lineal de un método analítico o de un instrumento, que va
Intervalo de desde la concentración más pequeña a la que se puede realizar la
concentración cuantificación (límite de cuantificación, LOQ) hasta la concentración a la que
la curva de calibrado se desvía de la linealidad (límite de linealidad, LOL).
Se define como la capacidad de un método o un instrumento analítico para
Selectividad medir exacta y específicamente el analito, sin interferencia de impurezas u
otros componentes que puedan estar presentes en la muestra.
Apéndice B
Resumen de los métodos ópticos
B-1. Resumen gráfico de los métodos de absorción
B-2. Resumen gráfico de los métodos de emisión
B-3. Procedimientos más usuales para el tratamiento de muestras en los métodos ópticos estudiados.
Tratamiento de las muestras

Tipo de método
Muestra bruta Porción de ensayo Objetivo del tratamiento
Disolución de la muestra.
Separación del analito por métodos clásicos
Eliminar interferencias absorbentes y poner al analito
(extracción sólido-líquido, destilación, reflujo,
en condiciones propicias para su determinación.
clarificación, dilución, filtración, concentración,
rotoevaporación, otros)
• Convertir un analito que no adsorbe en su estado
nativo en un derivado capaz de absorber en las
Homogeneización, secado, zonas UV o visible.
Espectrometría
desgrasado, otros. • Obtener un derivado absorbente cuyo coeficiente
molecular
Medida exacta de la muestra de extinción molar () es mayor al del analito en su
Reacciones de derivatización
estado nativo → aumenta sensibilidad.
reactivo derivado absorbente • La conversión del analito en un derivado coloreado
analito + ↔
derivatizador usualmente coloreado con diferente estructura química, que se determina
en otra región del espectro, permite su
diferenciación del resto de los componentes de la
matriz que absorben a longitudes de onda similares
a las del analito en su estado nativo.
Descomposición seca: incineración en mufla a altas
temperaturas (500-550 ºC) y posterior disolución de
las cenizas obtenidas en ácidos fuertes.
Digestión húmeda: tratamiento de la muestra con
ácidos minerales en caliente, los cuales oxidan la
materia orgánica resultando una disolución contentiva
del material inorgánico.
Digestión por interacción con microondas:
Homogeneización, secado, muestra mezclada con ácidos minerales u oxidantes
Espectrometría Eliminar la materia orgánica facilitando el proceso de
desgrasado, otros. fuertes, se introduce en horno de microondas, ocurre
atómica obtención de átomos neutros.
Medida exacta de la muestra digestión de la materia orgánica.
Sonicación: La muestra mezclada con ácidos fuertes
se coloca en un baño de ultrasonido. Hay formación de
OH* y de H2O2 ocurriendo digestión de la materia
orgánica.
Algunas muestras se aspiran directamente sin
preparación previa y otras pueden analizarse en
estado sólido
B-4. Características de los instrumentos empleados en los métodos ópticos estudiados.
Espectrofotómetros de Espectrofotómetros de Espectrofluorómetros Espectrofotómetros de

Componentes
absorción molecular UV-Vis absorción atómica (emisión molecular) emisión atómica
Construcción: lámparas de Construcción: lámparas de Construcción: lámparas de arco
wolframio para el visible y deuterio cátodo hueco construidas del de mercurio (254, 302, 313,
para el UV. Emiten radiación mismo elemento que se 546, 578, 691 y 773 nm) o
policromática. analiza. Emiten radiación lámparas de arco de xenón (300
Fuente de radiación monocromática. a 1300 nm). ---
Función: provoca la excitación del
analito por absorción de REM. Función: provoca la excitación Función: provoca la excitación
del analito por absorción de del analito por absorción de
REM. REM.
Monocromadores que aíslan una  Monocromadores que eliminan Filtros de interferencia. Se Monocromadores que eliminan
de la radiación policromática las interferencias producidas emplean 2 selectores de : un las interferencias producidas
proveniente de la fuente. por la emisión de radiación en selector de la  de excitación por la emisión de radiación en
Se ubican entre la fuente y la zona la llama o en el horno de encargado, ubicado entre la la llama, el plasma, el arco o
Selector de 
de la muestra. grafito. fuente y la zona de la muestra, la chispa eléctrica.
Se ubican después de la zona y un selector de la  de emisión Se ubican después de la zona
de la muestra. que aisla la  de máxima de la muestra.
fluorescencia.
La muestra en disolución está La muestra se atomiza sobre La muestra en disolución está La muestra se atomiza sobre
contenida en cubetas de vidrio o una llama u horno de grafito contenida en cubetas de vidrio o una llama, un plasma de
cuarzo, para lecturas en las zonas cuya función es obtener átomos sílice, para lecturas en las zonas argón, un arco o una chispa
del visible o el UV-vis, neutros en estado gaseoso. del visible o el UV-vis, eléctrica, cuya función es
respectivamente. Los átomos del elemento objeto respectivamente. obtener átomos neutros en
Zona de la muestra Las moléculas del analito absorben de estudio absorben REM Las moléculas del analito estado gaseoso y a la vez
REM proveniente de la fuente y se monocromática proveniente de absorben REM proveniente de producir una excitación
excitan a niveles de mayor energía la fuente y se excitan a niveles la fuente y se excitan a niveles térmica de estos. En el
de mayor energía. de mayor energía. En el proceso proceso de desexcitación, los
de desexcitación emiten REM de átomos emiten REM de 
mayor  que la absorbida. característica.
Detector Detectores de fotones que convierten la radiación electromagnética en corriente eléctrica
Registra la señal analítica Registra la señal analítica Registra la señal analítica Registra la señal analítica
Absorbancia Absorbancia Fluorescencia Potencia emitida
Registro y
proceso de datos En la actualidad el registro de la señal analítica se acopla a sistemas computarizados que almacenan la información, realizan cálculos
cuantitativos y poseen enormes bases de datos de espectros de diferentes sustancias, que permiten realizar comparaciones con fines
cualitativos
B-5. Resumen de los procedimientos de cuantificación empleados en los métodos ópticos estudiados
Procedimiento Descripción Procesamiento

Análisis estadístico Aplicaciones
de cuantificación del procedimiento de los resultados
Preparación de disoluciones de un Regresión lineal simple al juego de • R2 cercano a 1
patrón de referencia del analito a valores: concentración del patrón • Anova: significativo
concentraciones crecientes y de referencia vs. señal analítica.
Curva de • Pendiente: significativa
exactamente conocidas. Lectura de la Obtención de la ecuación de
calibración señal analítica, de las disoluciones de • Intercepto: estadística-
regresión y= mx +a, donde
los patrones y de la muestra. y= señal analítica obtenida para la mente igual a cero
muestra
Preparación de disoluciones de un Regresión lineal simple al juego de • R2 cercano a 1
patrón de referencia del analito a valores: concentración del patrón • Anova: significativo
concentraciones crecientes y de referencia vs. señal analítica. • Absorción molecular UV-Vis
• Pendiente: significativa
exactamente conocidas, las cuales se Obtención de la ecuación de • Absorción atómica
Adición de patrón adicionan a réplicas de una disolución regresión y= mx +a, donde y= 0 • Intercepto: estadística-
• Emisión atómica
de la muestra. Lectura de la señal mente igual a la señal
• Fluorometría
analítica de las disoluciones de los analítica obtenida para la
patrones + muestra y de la disolución disolución de la muestra
de la muestra.
Preparación una única disolución de un Conc. PR --------------- Señal PR
patrón de referencia del analito a Conc. M ---------------- Señal M
concentración exactamente conocida.
Patrón externo Lectura de la señal analítica de la ---
Conc. PR ∙ Señal M
disolución del patrón y de la muestra. Conc. M=
Señal PR
Preparación de disoluciones de un Regresión lineal simple al cociente • R2 cercano a 1

patrón de referencia del analito a de la señal analítica obtenida para • Anova: significativo
concentraciones crecientes y el patrón de referencia entre la
• Pendiente: significativa
exactamente conocidas a las cuales se señal analítica obtenida para el
adiciona una sustancia patrón interno patrón interno. • Intercepto: estadística-
mente igual a cero • Emisión atómica
Patrón interno que no esté en la muestra. Obtención de la ecuación de
Lectura de la señal analítica de los regresión y= mx +a, donde
patrones y del patrón interno así como
la señal analítica del analito y del señal del analito en la muestra
patrón interno en la muestra. y=
señal del PI en la muestra
B-6. Parámetros estadísticos a considerar para verificar el ajuste del modelo a los resultados experimentales en los
procedimientos analíticos de curva de calibración, adición de patrón y patrón interno.
Resultados que expresan

Parámetros estadísticos Significado práctico de los parámetros estadísticos calculados
el ajuste del modelo
Cercano al valor 1 Expresa linealidad. Indica la proporción entre el error explicado por la
Coeficiente de determinación (R2) regresión con respecto al error total.
Expresa linealidad. Indica la proporción entre el error explicado por la
Anova simple de la regresión Significativo
regresión con respecto al error no explicado.
Expresa la variación significativa de la señal analítica (absorbancia, potencia
Prueba de hipótesis para la
Pendiente significativa emitida, fluorescencia) con el incremento de la concentración de los patrones
pendiente
de referencia.
Curva de calibración y patrón interno: Expresa que la recta parte del origen,
es decir, que el intercepto es igual a cero. La significación del intercepto es
con respecto a cero.
Prueba de hipótesis para el
Intercepto no significativo Adición de patrón: Expresa que la recta parte del valor de la señal analítica
intercepto
correspondiente a la lectura de la muestra (absorbancia, potencia emitida,
fluorescencia). La significación del intercepto es con respecto a la señal
obtenida para la muestra.
B-7. Resumen gráfico de los métodos refractométricos y polarimétricos.
Apéndice C
Resumen de los métodos cromatográficos
C-1. Resumen gráfico de la clasificación de los métodos cromatográficos

C-2. Mecanismos de separación en cromatografía
Mecanismos Fundamento Aplicaciones

Dicho procedimiento se fundamenta en el fenómeno de reparto, es decir, en la distribución de una mezcla de solutos
(sustancias que se desean separar) entre 2 fases inmiscibles. El reparto o distribución del soluto tiene lugar, atendiendo a su
solubilidad preferencial (lo cual depende de su polaridad), entre la fase estacionaria (FE) líquida unida a un soporte sólido HPLC, CCD y
Reparto inerte, y la fase móvil (FM) que resulta ser el disolvente que fluye a través de la FE y que puede ser un líquido o un gas. Cromatografía
En dependencia de la polaridad de los solutos ocurrirá la separación. Aquellos más solubles en la FM se moverán con mayor de gases
velocidad mientras que los más solubles en la FE quedarán más tiempo retenidos.
En cromatografía líquida,
La separación se realiza en virtud de las diferencias de comportamiento de las sustancias que desean separarse, atendiendo a
su adsorción preferencial por la superficie de un sólido (FE) mientras se mueven por la acción de un disolvente (FM) que puede
ser un líquido o un gas.
Cuando la muestra disuelta en la FM se pone en contacto con las primeras capas de adsorbente, este retiene parcialmente al HPLC, CCD y
sólido, estableciéndose con rapidez un equilibrio entre la cantidad de muestra en la FM y la retenida por el adsorbente (FE).
Adsorción Cromatografía
Este equilibrio es dinámico y reversible.
de gases
La FE adsorbe los componentes de la mezcla de sustancias que desean separarse, mientras que la FM será la encargada de
desorberlos. En dependencia de la fortaleza con que los compuestos se adsorban a la FE, la FM podrá desorberlos
(arrastrarlos) con mayor o menor facilidad. Es este fenómeno el que posibilita que los solutos puedan ser separados, dado
que, en función de su afinidad por la FE, los mismos se moverán a diferentes velocidades.
La interacción que tiene lugar es de naturaleza iónica, es decir los componentes de la mezcla que se desean separar tienen
que estar en forma de iones cargados.
La FE son compuestos orgánicos sintéticos llamados resinas, que poseen cargas positivas o negativas y están unidos a
contraiones lábiles de carga opuesta que son desplazados con facilidad por los iones de la muestra, los cuales interaccionan
con la resina y ocupan sus centros activos (positivos o negativos) luego de intercambiarse con los contraiones.
Intercambio Las resinas intercambiadoras pueden ser catiónicas o aniónicas, en dependencia de su carga y de los solutos que
intercambien. Las resinas catiónicas poseen grupos funcionales cargados negativamente y se emplean para separar iones de HPLC y CCD
iónico
carga positiva (de ahí su nombre de catiónicas) que son atraídos por la resina y se intercambian con los contraiones lábiles.
Las resinas aniónicas están por el contrario cargadas positivamente y se emplean para separar iones de carga negativa (de
ahí su nombre de aniónicas) que se intercambian igualmente con los contraiones lábiles.
La FM es un disolvente que contiene iones de carga igual a la de los solutos que se quieren separar y están interactuando con
la resina (positiva o negativa); entonces se efectúa un segundo intercambio iónico desplazando a los solutos de los centros
activos de la fase estacionaria y eluyendolos.
Este tipo de cromatografía se usa en la separación de mezclas de compuestos en función de la masa molecular de estos y es
aplicable a compuestos con masas moleculares superiores a 2000.
La FE es un gel formado por gránulos o perlas con estructura parecida a un tamiz que contienen poros de diferente tamaño. El
mecanismo de separación consiste en que la solución de la muestra se hace pasar a través del gel que posee un tamaño de
Filtración poro determinado. Las moléculas de alto peso molecular con tamaño superior al de los poros de las partículas del gel no HPLC
sobre gel pueden penetrar en los mismos (se dice que son excluidas) y se mueven libremente a través de la fase acuosa en el exterior
de los gránulos, entre los espacios interpartícula, mientras que las de tamaño inferior al de los poros se introducen en estos y
ven obstaculizado su paso a través del gel, por lo que su avance a través de la columna se retrasa. La FM es generalmente
agua o buffer. En general el orden de elución está dado por el tamaño (o la masa molecular). Las moléculas grandes eluyen
primero y le siguen las demás en orden decreciente de sus masas moleculares.
C-3. Eficiencia de una columna cromatográfica
C-3.1. Algunos conceptos y parámetros cromatográficos de interés
Parámetro Significado Expresión

Eficiencia La eficiencia de una columna cromatográfica
está dada por su capacidad para lograr la
separación de dos o más solutos con una
buena resolución en el menor tiempo posible,
en dependencia de la complejidad de la mezcla
a separar.
Tiempo de El tiempo de retención (tr) de un analito dado
retención (tr) mide el lapso de tiempo que media entre la
introducción de la muestra y el instante en que
la respuesta del detector alcanza su valor
máximo
Resolución (R) La resolución es la medida con que una  tr − tr1 
columna es capaz de separar a dos solutos con R12 = 2  2 
tiempos de retención muy semejantes W
 2 + W 1
Factor de El factor de capacidad describe las velocidades wE

capacidad (k’) de migración de los analitos en la columna y k' =
wM
está relacionado con la constante de
distribución (Kc) de un soluto entre 2 fases, es
decir la relación de la concentración de un
analito A en la fase estacionaria, respecto al t' r
k' =
valor correspondiente en la fase móvil. tm
Se define como la relación de las masas del
analito en la fase estacionaria y la fase móvil,
o también como la relación del tiempo de tr − tm
k' =
permanencia del analito en la fase estacionaria tm
(t’r) respecto al valor correspondiente en la
fase móvil (tm)
Selectividad () La selectividad expresa la retención relativa t' r2
entre los máximos de dos picos adyacentes. =
t' r1
La selectividad es conocida como eficiencia de
la fase estacionaria y en la medida que se
aleje más del valor 1 mejor será la separación
entre los picos, es decir la fase estacionaria es
más selectiva mientras mayor es el valor de .
C-3.2. Teorías de la elución cromatográfica

Teoría de los platos teóricos. Considera que el empaque de una columna cromatográfica
está compuesto por una serie de estrechas capas horizontales llamadas platos teóricos y se
supone que en cada plato tiene lugar el equilibrio del soluto entre la fase móvil y la fase
estacionaria. El movimiento del soluto y el disolvente se considera entonces como una serie
de transferencias sucesivas de un plato al siguiente. La eficiencia de una columna
cromatográfica será mayor en la medida que aumenta el número de platos teóricos, pues
aumentará también el número de equilibrios.
En consecuencia, el número de platos teóricos (N) se utiliza como una medida de la
eficiencia de una columna cromatográfica. Un segundo término, la altura equivalente de un
plato teórico (H) también sirve para este fin. La relación entre ambos parámetros es la
siguiente:
L
N=
H
donde L es la longitud del empaque de la columna
El número de platos teóricos de una columna puede calcularse experimentalmente con los
datos de un pico cromatográfico, según:
2
 tr 
N = 16  
W 
donde tr es el tiempo de retención del soluto y W es la anchura del pico en la base.
La teoría de los platos teóricos fue capaz de describir las velocidades de migración de los
solutos de forma cuantitativa; sin embargo, su utilidad resulta limitada porque no logró
describir los efectos de las variables responsables del fenómeno de ensanchamiento de
banda
Teoría cinética. Parte del hecho de que no todas las moléculas del mismo soluto se
mueven a igual velocidad dentro del empaque de la columna cromatográfica. Ciertas
moléculas de un soluto viajan más rápidamente que el promedio porque están un mayor
tiempo en la fase móvil, mientras otras pueden retardarse debido a que permanecen un
mayor tiempo en la fase estacionaria. La consecuencia de estos procesos es el
ensanchamiento de bandas que afecta la resolución del cromatograma.
Causas del ensanchamiento de bandas:
• Proceso multipaso: Efecto del tamaño y la forma de las partículas, así como, la densidad
del empacado, conduce a que las moléculas de un mismo soluto transiten por diferentes
trayectorias a través del empaque de la columna Se minimiza disminuyendo el tamaño
de partícula del empaque e incrementando su homogeneidad
• Difusión longitudinal: Tendencia de las moléculas difundir desde zonas de mayor
concentración a zonas de menor concentración produciendo un ensanchamiento
adicional del pico cromatográfico. Se minimiza incrementando la velocidad de flujo
• Resistencia a la transferencia de masa: Ocurre una transferencia de masa fuera del
equilibrio. Se minimiza disminuyendo la velocidad de flujo, la viscocidad de la fase móvil
y el espesor de la película de la fase estacionaria.
La ecuación de Van Deemter relaciona la eficiencia de una columna cromatográfica con la
magnitud de estos tres fenómenos y proporciona una relación aproximada entre la
velocidad de flujo () y la altura equivalente de un plato teórico (H). Esta ecuación es
aplicable tanto en cromatografía líquida como en cromatografía de gases.
B
H =A+ + Cu
u
En este caso la magnitud A se relaciona con el efecto multipaso, B es la difusión longitudinal
y C es la transferencia de masa fuera del equilibrio.
De esta expresión se desprende que la eficiencia de la columna cromatográfica aumenta a
medida que se hace mínimo A, B y C, por cuanto también se minimiza la altura equivalente
de un plato teórico lo que conduce al incremento del número de platos teóricos y con ello al
establecimiento de un mayor número de equilibrios del soluto entre ambas fases.
Resulta claro que es preciso llegar a un compromiso entre los factores que afectan la
eficiencia cromatográfica, expresada por la ecuación de Van Deemter. Así hemos visto que
la altura del plato teórico H crece a bajas velocidades de la fase móvil debido a difusión,
mientras que ocurre lo mismo a elevadas velocidades por falta del establecimiento del
equilibrio. Entre estos dos extremos hay un punto que corresponde al flujo óptimo. En la
práctica se trabaja dentro de una zona bastante amplia por cierto, aunque es siempre
recomendable conocer cuáles son los límites dentro de los que es factible situar la velocidad
de la fase móvil en el trabajo diario
C-4. Principios de funcionamiento de los métodos cromatográficos estudiados.
Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) Cromatografía de gases (GLC) Cromatografía en capa delgada (CCD)
El proceso consiste en bombear a presión elevada un El proceso consiste en impulsar, a una velocidad de La muestra o muestras a cromatografiar se aplican,
solvente o sistema de solventes (fase móvil) a través flujo controlada, un gas portador (fase móvil) a utilizando micropipetas en una placa que contiene un
de una tubería capilar, por lo general de acero través de una tubería capilar hasta una cámara de soporte con la fase estacionaria. La aplicación puede
inoxidable. Este líquido llega a una válvula (sistema inyección a altas temperaturas donde se introduce la ser en forma de puntos o en forma de bandas.
de inyección) que permite la introducción de la muestra que se desea analizar. El desarrollo del cromatograma consiste en hacer
muestra que se desea analizar. La muestra se introduce en ésta cámara por pasar la fase móvil (solvente de corrida) a través de
La muestra, casi siempre una solución, se introduce inyección a través de una membrana perforable, la fase estacionaria. Para ello se coloca la placa en
mediante una jeringuilla en el sistema de inyección valiéndose de una microjeringuilla. La temperatura una cámara cerrada que contiene el solvente (o
de volumen exacto y conocido. Accionando una de la cámara y la capacidad calorífica de esta sistema de solventes) que se usará en el desarrollo
válvula se logra que la solución de la muestra se permiten un rápido paso a la fase de vapor, tanto del del cromatograma. Una vez colocada la placa dentro
mezcle con fase móvil líquida y pase a la columna solvente usado en disolver la muestra como de los de la cámara cromatográfica, el solvente asciende
cromatográfica. En su modalidad clásica la columna componentes sólidos de esta. Una vez en estado de por capilaridad arrastrando a los solutos que
cromatográfica es un tubo de acero inoxidable vapor, la muestra es arrastrada por el gas portador, comenzarán a separarse en función de las diferencias
(relleno con la fase estacionaria) de 1 mm a 4 mm de introduciéndola y llevándola a través de la columna de afinidad por la fase móvil y la fase estacionaria.
diámetro interno y longitud variable, según la cromatográfica, la cual se encuentra situada en un Aquellos más afines a la fase móvil se moverán con
necesidad analítica pero por lo general inferior a 50 horno aislado térmicamente a temperatura entre mayor velocidad y recorrerán una mayor distancia.
cm. 50ºC y 350ºC. La detección de los compuestos separados se realiza
En la columna ocurre la separación cromatográfica de En la columna cromatográfica ocurre la separación de mediante métodos de revelado físicos (fluorescencia)
los componentes de la muestra. El mecanismo de los componentes de la muestra en función de las o químicos (reacciones de derivatización in situ) que
separación depende de la naturaleza de la fase móvil diferencias en afinidad de los analitos por la fase permitan visualizar la posición de los mismos en la
y de la fase estacionaria y en esencia, la separación estacionaria mientras son arrastrados por el gas superficie de la capa. Los componentes separados
está determinada por las diferencias en afinidad de portador. aparecen inmovilizados en la placa como manchas.
los analitos por ambas fases. A la salida de la columna se encuentra conectado el
A la salida de la columna se encuentra conectado el detector, el cual es un dispositivo capaz de responder
detector, que puede ser refractométrico, a las pequeñas variaciones en las propiedades físicas
espectrofotométrico, electroquímico, de fluorescencia del gas portador cuando se encuentra acompañado
o de conductividad entre otros. por el analito. En general cada detector está diseñado
La señal producida por el detector, previamente para responder ante una variación específica del gas
amplificada, se recibe en un registrador donde se portador, y pueden ser de conductividad térmica, de
origina el cromatograma correspondiente de señal vs. ionización, de absorción electrónica, etc.
tiempo de retención. La señal producida por el detector de naturaleza
Aunque no es una parte esencial del sistema de eléctrica o transformable en ella, es amplificada y
cromatografía líquida, es posible también acoplar a la enviada al registrador donde se origina el
salida del detector, un colector de fracciones, con el cromatograma correspondiente de señal contra
que se puede obtener separadamente los eluatos tiempo de retención.
correspondientes a un pico o un conjunto de picos
según se requiera para un uso posterior.
C-5. Instrumentación empleada en cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)
Características
Está constituida por un solvente, una solución o un sistema de solventes y ha de ser compatible con el detector que se requiera para llevar a
cabo la determinación.
Fase Móvil Por lo general, la FM se encuentra en recipientes de un 1 litro de capacidad, situados por encima de los demás constituyentes del sistema
cromatográfico. Debe tener un alto grado de pureza y yna baja viscosidad, no obstante siempre es necesario desgasificar y filtrar los
solventes empleados.
Su función es la de extraer el solvente o sistema de solventes (FM) de su reservorio e impulsarlo a altas presiones a través del sistema
cromatográfico, garantizando la velocidad de flujo.
Bombas
Pueden trabajar con un sistema de elución isocrático (la composición de la fase móvil no varía durante el proceso cromatográfico) o con un
sistema de gradiente de elución (la composición de la fase móvil varía paulatinamente durante el proceso cromatográfico).
La válvula de introducción de muestras es un dispositivo que permite la dosificación exacta de volúmenes conocidos de solución o muestra
líquida, de forma rápida para que se mezcle con la FM que se encuentra a presión elevada y pasen a la columna cromatográfica.
Sistema de inyección
En la actualidad existen también los llamados automuestreadores automáticos que son equipos que pueden realizar el proceso de inyección
automáticamente sin apenas atención del analista.
Va conectada entre la válvula de introducción de muestras y la columna analítica. Su función es servir de filtro para evitar la introducción de
Precolumna partículas a la columna y para retener los componentes de la muestra que se adsorberían irreversiblemente en la columna, contribuyendo
así a prolongar su vida útil.
Es la parte del sistema donde se origina la separación de los componentes de la muestra y de la que depende en gran medida la eficiencia
del proceso cromatográfico. Las columnas más empleadas son las clásicas (rellenas con la FE), construidas de acero inoxidable, con
diámetros internos entre 2 mm y 5 mm y longitudes entre 5 y 50 cm, pero las de mayor uso son las de 25 cm.
La mayoría de los rellenos (FE) usados hoy en HPLC tienen como base la sílice porosa, con sus grupos silanoles unidos químicamente a
compuestos que le dan las características deseadas. En función del grupo R unido a la sílica gel las columnas serán de reparto, adsorción,
Columna intercambio iónico o filtración sobre gel.
Las de mayor aplicación son las de reparto fase normal (donde los grupos R pueden ser ciano, diol y amino fundamentalmente) y las de fase
reversa (donde los grupos R son cadenas alifáticas de 2, 8 y 18 átomos de carbono; conocidas como C-2, C-8 y C-18, respectivamente).
Las columnas de HPLC son altamente eficientes debido al pequeño tamaño de partícula (entre 3 y 10 m) y el elevado número de platos
teóricos (12 000 platos / 5 cm)
Su función es detectar los componentes que van eluyendo de la columna cromatográfica. Los más empleados son: detector de índice de
refracción, detector espectrométrico UV-Vis ( fija,  variable y arreglo de diodos), detector de fluorescencia, detector electroquímico y
detector de conductividad.
Detector
Recientemente se emplea el acoplamiento HPLC – espectrometría de masas como técnica eficaz en la identificación de la estructura de
compuestos químicos. Este detector además de ofrecer el cromatograma realiza un espectro de masas a cada uno de los picos obtenidos. La
interpretación de los espectros de masas brinda una información cualitativa poderosa acerca de la identidad de un compuesto.
La salida de la información producida por el detector ante el paso de la muestra, puede registrarse directamente en un cromatograma de
Sistema de registro señal vs. tiempo de retención. La introducción de las computadoras y de los software especializados permite la captación de la información
cromatográfica, su almacenamiento y procesamiento en el momento que se requiera.
C-6. Instrumentación empleada en cromatografía de gases (GLC)
Características
Los gases usados están contenidos normalmente en recipientes o balones de acero con capacidad real de 20 - 50 litros. La presión a la
que pueden estar sometidos los gases en los balones mencionados, es relativamente baja. En todos los cromatógrafos hay dispuestos
manómetros, con ayuda de los cuales es posible fijar con exactitud la presión de trabajo de los distintos gases, la cual determina la
velocidad de flujo. Los gases portadores comúnmente usados son Nitrógeno, Argón, Helio, Hidrógeno y CO 2. Su elección depende del
Gas portador tipo de detector que se vaya a usar.
La función del gas portador es únicamente transportar la muestra (en fase gaseosa) a través del sistema cromatográfico. A diferencia de
la cromatografía líquida, el gas portador no participa en la separación cromatográfica como lo hace la fase móvil (sistema de solventes)
en HPLC.
La cámara de inyección se encuentra a altas temperaturas y su diseño debe permitir que las muestras que se introducen en ella, a través
de una membrana perforable de goma de silicona, se vaporicen rápida y totalmente y se mezclen con el gas portador, haciéndolos entrar
y avanzar a través de la columna cromatográfica.
Sistema de inyección Existen varias técnicas de inyección y las más empleadas son: inyección Split (donde solo una fracción del volumen inyectado se
introduce en la columna cromatográfica y el resto se desvía hacia el exterior, inyección Splitless (en el que la totalidad de la muestra que
se introduce en el inyector accede a la columna) e inyección con programación de temperatura del vaporizador (en el que la muestra se
inyecta en frío y después se programa la vaporización hasta un valor de temperatura preestablecido).
Existen dos tipos de columnas, las empacadas y las capilares. Las columnas empacadas o de relleno son aquellas en las que la fase
estacionaria recubre a un soporte inerte, más o menos regular, el cual llena totalmente el interior de la columna; por lo general tienen
una longitud entre 0,3 y 10 metros y diámetros internos entre 2 y 6 mm. Las columnas capilares están formadas por un capilar de
diámetro interno muy pequeño, en cuyas paredes interiores está dispuesta la fase estacionaria; pueden tener una longitud hasta 10
Columna veces mayor que las columnas empacadas (10 – 100 m) y un diámetro interno mucho menor (0.1 – 0.75 mm), lo que unido a la
ausencia de relleno, las hace mucho más eficientes. Las más empleadas con las de sílice fundida.
La cromatografía de gases de mayor aplicación es la cromatografía gas-líquido, y el mecanismo que se pone de manifiesto es el reparto.
Así, las fases estacionarias son sólidos o semisólidos a temperatura ambiente pero líquidos a temperatura de trabajo.
La columna cromatográfica se encuentra situada en un horno aislado térmicamente. En la mayoría de los equipos la temperatura del
horno puede fijarse en cualquier valor entre 50ºC y 350ºC. Un accesorio, llamado programador, permite variar la temperatura del horno
en función del tiempo dentro de los límites permisibles del equipo.
Horno termostatado Cuando el análisis cromatográfico se realiza con el horno situado a una temperatura fija, se dice que la operación es isotérmica. Si por el
contrario la temperatura varia (en forma lineal o por rampas de temperatura) se dice entonces que el análisis se realiza con
programación de temperatura. La cromatografía a temperatura programada es más eficiente y se emplea en la separación de mezclas
complejas con un rango amplio de puntos de ebullición entre sus componentes.
Su función es detectar los componentes que van eluyendo de la columna cromatográfica. Trabajan a altas temperaturas y los más
empleados son: detector de conductividad térmica, detector de ionización por llama, detector de captura electrónica, detector
Detector termoiónico y detector fotométrico de llama.
También se emplea el acoplamiento GLC – espectrometría de masas como técnica eficaz en la identificación de la estructura de
compuestos químicos.
De forma análoga a HPLC, la salida de la información producida por el detector ante el paso de la muestra, puede registrarse
Sistema de registro directamente en un cromatograma de señal vs. tiempo de retención. Igualmente, los software especializados permiten la captación de la
información cromatográfica, su almacenamiento y procesamiento en el momento que se requiera.
C-7. Procedimientos de identificación empleados en HPLC y Cromatografía de gases
Procedimiento
Descripción del procedimiento Aplicaciones
de identificación
Consiste en comparar los tiempos de retención obtenidos para un pico cromatográfico de una muestra HPLC y
Comparación de los
cromatografiada, con el tiempo de retención obtenido para un patrón de referencia (PR) de la sustancia
tiempos de retención Cromatografía de gases
que se sospecha esté presente en la muestra
Una vez cromatografiada la muestra, se añade a esta una cierta cantidad de PR del compuesto que se
sospecha esté presente. La muestra con el patrón adicionado se vuelve a cromatografiar y si uno de sus HPLC y
Enriquecimiento de pico picos aumenta su área es indicativo que se corresponde con el patrón adicionado. Si por el contrario
aparece un nuevo pico en el cromatograma puede afirmarse que el patrón de referencia no se Cromatografía de gases
corresponde con ninguno de los componentes presentes en la muestra.
Este detector es capaz de realizar un barrido en un amplio rango de longitudes de onda a cada uno de
los componentes eluidos obteniendo el espectro de absorción de cada uno.
Utilización de un detector
Los espectros obtenidos para cada pico de la muestra se comparan con espectros de referencia, lo que HPLC
con arreglo de diodos
permite realizar el análisis cualitativo basado no solo en las propiedades cromatográficas de los eluatos
sino también, en sus características espectroscópicas
Es posible disponer comercialmente de cromatógrafos acoplados a espectrómetros de masas (HPLC–MS

y GLC-MS), como equipos compactos, en los cuales el espectrómetro de masas se ha convertido en un
detector muy valioso en la identificación y cuantificación de los componentes cromatografiados. De HPLC y
Acoplamiento con
forma análoga al detector con arreglo de diodos el uso de computadoras y software especializados
espectrometría de masas Cromatografía de gases
permiten en la actualidad almacenar una enorme cantidad de espectros de masas en espectrotecas y
realizar comparaciones con los espectros obtenidos por el detector de cada uno de los componentes
cromatografiados.
C-8. Procedimientos de cuantificación empleados en HPLC y Cromatografía de gases
Procedimiento Descripción Procesamiento

Análisis estadístico
de cuantificación del procedimiento de los resultados
Preparación de disoluciones de un patrón de referencia Regresión lineal simple al juego de valores: • R2 cercano a 1
(PR) del analito a concentraciones crecientes y concentración del patrón de referencia vs. área bajo • Anova: significativo
exactamente conocidas. Inyección de cada una de las la curva del pico del patrón de referencia.
Curva de disoluciones en el cromatógrafo, obtención de los • Pendiente: significativa
Obtención de la ecuación de regresión
calibración respectivos cromatogramas e integración de los picos • Intercepto: estadística-
y= mx +a, donde
de los PR para obtener el área bajo la curva. mente igual a cero
y= área del pico del analito en el cromatograma de
la muestra (Area pico M).
Preparación una única disolución de un PR del analito a Conc. PR --------------- Area PR
concentración exactamente conocida. Inyección de la Conc. M ---------------- Area pico M
disolución en el cromatógrafo, obtención del
Patrón externo cromatograma e integración del pico del PR para ---
Conc. PR ∙ Area pico M
obtener el área bajo la curva. Conc. M=
Señal PR
Preparación de disoluciones de un patrón de PR del Regresión lineal simple al juego de valores: • R2 cercano a 1
analito a concentraciones crecientes y exactamente concentración del patrón de referencia vs. Area PR / • Anova: significativo
conocidas a las cuales se adiciona una sustancia Area PI.
patrón interno (PI) que no esté en la muestra. • Pendiente: significativa
Obtención de la ecuación de regresión
Inyección de las disoluciones de PR + PI en el y= mx +a, donde • Intercepto: estadística-
Patrón interno
cromatógrafo, obtención de los cromatogramas e mente igual a cero
integración de los picos del PR y del PI para obtener
sus respectivas áreas bajo la curva. Area del analito en la muestra
y=
Area del PI en la muestra
Inyección en el cromatógrafo de la muestra, obtención Ay

del cromatograma e integración del área bajo la curva % componente y =  100
y =n
de los picos correspondientes a la muestra
cromatografiada.  Ay
y =1
Normalización
interna donde Ay es el área de cualquiera de los n picos (el
pico de interés)
y =n
es la sumatoria de las áreas
A y
y =1
C-9. Procedimientos de identificación y cuantificación empleados cromatografía en capa delgada (CCD)
Descripción del procedimiento
El factor de retardo (Rf), es la relación entre la distancia recorrida por un compuesto entre la distancia
recorrida por el solvente de corrida (fase móvil).
Procedimientos de Comparación de los La muestra se aplica inicialmente en la placa junto a patrones de referencia (PR), por lo que al acometer
identificación factores de retardo (Rf) el proceso de revelado se visualizan las manchas correspondientes a los componentes de la muestra y las
manchas correspondientes a los PR. Se calculan entonces los valores de RF de los componentes de la
muestra y de los PR. Cuando una mancha de un PR coincide con una mancha de un componente de la
muestra, la identificación es positiva.
Consiste en raspar la zona de sílica correspondiente al componente que se desea cuantificar y trasvasarla
a un recipiente donde, luego de numerosas extracciones, se realiza la medición directamente por
Elución de los técnicas espectroscópicas (en la zona ultravioleta del espectro si el componente es capaz de absorber o
componentes de la placa mediante una previa reacción de derivatización para obtener un compuesto coloreado que permita
realizar la determinación en la zona visible del espectro).
Este método se emplea muy poco debido a su pobre precisión y exactitud.
Un densitómetro es un equipo capaz de medir una señal analítica de los componentes separados y los
patrones directamente “in situ” sobre la placa cromatográfica. El resultado de esta medición es un
cromatograma de señal vs. distancia de migración de cada uno de los componente de la muestra, en el
cual, de forma análoga a la HPLC y a GLC, el área bajo la curva de cada pico es proporcional a la
concentración.
Procedimientos de La cuantificación de cualquiera de los componentes de la muestra se realiza con ayuda de una curva de
cuantificación calibración. Para ello se aplican en una capa nueva soluciones de un patrón de referencia correspondiente
al componente que se desea cuantificar a concentraciones o masas crecientes y exactamente conocidas.
Se realiza entonces la corrida cromatográfica bajo condiciones idénticas a las utilizadas para la muestra y
Técnicas densitométricas la placa se coloca en el densitómetro para la lectura de la señal analítica de los patrones.
Se obtienen entonces un número de picos equivalentes al número de soluciones patrones aplicadas en la
placa cuyas áreas bajo la curva aumentan en la medida en que aumenta la concentración de los
patrones. El equipo es capaz de integrar estas áreas y como resultado se obtiene un juego de datos de
concentración (o masa) de los patrones vs. área bajo la curva. Esta data se procesa por regresión lineal y
se obtiene una ecuación del tipo
y = mx +a
donde “m” es la pendiente, “a” es el intercepto, “y” es el área bajo la curva del pico del componente de
interés en el cromatograma de la muestra y “x” es la concentración o masa del componente de interés.
C-10. Comparación entre la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y la cromatografía de gases (GLC)
HPLC GLC
Métodos clásicos, SPE, SPME, Derivatización Métodos clásicos, SPE, SPME, Derivatización
ocasional. frecuente.
Preparación de la muestra La muestra debe filtrarse siempre y es El disolvente debe ser volátil y usualmente
disuelta en la fase móvil. con un punto de ebullición menor al de los
analitos.
Volatilidad de la muestra Ningún requisito de volatilidad. La muestra debe ser volátil o volatilizable.
Polaridad de la muestra Separa compuestos polares y no polares. Separa compuestos polares y no polares.
El análisis puede realizarse a temperatura La muestra debe resistir las temperaturas
Labilidad térmica de la muestra
ambiente o por debajo. elevadas del inyector y la columna.
En teoría no existe límite superior, en la Usualmente menor que 500 uma.
Peso molecular de la muestra
práctica la solubilidad es el límite.
En función del diámetro interno de la En función del tipo de columna.
Volumen de inyección
columna.
Adsorción, Reparto, Intercambio iónico y Adsorción y Reparto
Filtración sobre gel. En la separación participa la FE. La FM es
Mecanismos de separación
En la separación participan tanto la FM como solo un portador de la muestra.
la FE.
Columnas Empacadas. Empacadas y capilares.
Sistema de elución Isocrático y Gradiente. Isotérmico y Temperatura programada.
UV-Vis, Arreglo de diodos, Fluorescencia, Conductividad térmica, Ionización por llama,
Detectores Índice de refracción, otros. Captura de electrones, otros.
Acoplamiento HPLC-MS. Acoplamiento GLC-MS.
Comparación de los tr, Enriquecimiento de Comparación de los tr, Enriquecimiento de
Identificación pico, Arreglo de diodos, Acoplamiento HPLC- pico, Acoplamiento GLC-MS.
MS.
Patrón externo, Curva de calibración, Patrón Patrón externo, Curva de calibración, Patrón
Cuantificación
interno, Normalización de área. interno, Normalización de área.
Apéndice D
Resumen de los métodos potenciométricos
D-1. Principios y electrodos

D-2. Aplicaciones de los métodos potenciométricos
Métodos potenciométricos directos:

Requiere sólo la comparación del potencial desarrollado por el electrodo indicador en la disolución
problema con el potencial obtenido cuando se sumerge en una o más disoluciones patrón del analito.
Debido a que la mayoría de los electrodos indicadores son selectivos, normalmente no se requieren
etapas de separación previas.
Valoraciones potenciométricas:
Comprende todos los tipos de valoraciones
potenciométricas, que en su esencia son las mismas que
fueron estudiadas en el análisis químico clásico. La
diferencia estriba en que en el análisis clásico se emplean
indicadores para detectar el punto final de la valoración
mientras que en las valoraciones potenciométricas, el
potencial de un electrodo indicador adecuado se emplea
con comodidad para establecer el punto de equivalencia.
En dependencia del tipo de electrodo indicador que se
emplee pueden realizarse valoraciones por
neutralización, precipitación, formación de complejos y
oxidación reducción
Pueden utilizarse varios métodos para detectar el
volumen consumido de la disolución valorante para
alcanzar el punto final en una valoración potenciométrica.
El método más directo es la construcción de una gráfica
de potencial en función del volumen consumido de
valorante (figura a), cuyo comportamiento es idéntico a
las curvas obtenidas por valoraciones clásicas. El punto
medio del salto brusco de potencial en la gráfica de
valoración se estima de forma visual y se toma como el
punto final, extrapolando hacia el eje x para la
determinación del volumen consumido, V(x), y con estos
datos aplicar la ley fundamental de la volumetría en
cualquiera de sus variantes.
Un segundo procedimiento, más exacto, consiste en
calcular el cambio del potencial por unidad de cambio en
el volumen consumido de valorante, es decir E/V
(primera derivada). Una representación gráfica de este
parámetro permite obtener un punto final más definido
(figura b) con un punto de inflexión en el que resulta más
fácil determinar el volumen consumido del valorante,
V(x).
El tercer método consiste en representar la segunda
derivada (2E/V2) en función del cambio en el volumen
consumido del valorante (figura c).
Es particularmente útil para la valoración de disoluciones
coloreadas, turbias o muy diluidas, en las que no es
posible emplear un indicador.
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Análisis Instrumental de los Alimentos

Book · February 2021

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HÉCTOR ZUMBADO FERNÁNDEZ

Zumbado Fernández, Héctor

Análisis instrumental de los alimentos / Héctor Zumbado Fernández, autor,

1. Química Analítica; 2. Alimentos; 3. Educación Superior; 4. EcuLibro.

Disponible en la Plataforma digital EdUniv-SOCICT

Héctor Manuel Zumbado Fernández (1962-). Cubano.

Capítulo 1. Introducción al Análisis Instrumental de los Alimentos /4

Capítulo 2. Introducción a los métodos ópticos /39

2.3.1.1. Espectros de absorción /44

Capítulo 3. Espectrometría de absorción molecular ultravioleta y visible /55

Capítulo 4. Espectrometría de absorción atómica /89

Capítulo 5. Espectrometría de emisión atómica /115

Capítulo 6. Espectrometría de fluorescencia molecular /132

6.2.2. Tipos de transiciones en fluorescencia /137

Capítulo 7. Refractometría y polarimetría /147

Capítulo 8. Introducción a los métodos cromatográficos /169

8.3.4. Cromatografía de filtración sobre gel /181

Capítulo 9. Cromatografía en columna /185

Capítulo 10. Cromatografía líquida de alta resolución /206

10.3.6.3. Detector de fluorescencia /235

10.7.2. Solubilidad de la muestra en la fase móvil /272

Capítulo 11. Cromatografía de gases /278

11.4.1. Derivatización /321

Capítulo 12. Cromatografía en capa delgada /333

Capítulo 13. Métodos potenciométricos /359

13.4.1. Métodos potenciométricos directos /371

Capítulo 14. Ejercicios y problemas /379

Capítulo 15. Aplicaciones de los métodos instrumentales en la investigación

Apéndice B. Resumen de los métodos ópticos

La Ciencia dispone hoy en día de una serie impresionante de poderosas y

Análisis Instrumental de los Alimentos 1

En el Capítulo 1 se abordan los principios generales del análisis instrumental,

Análisis Instrumental de los Alimentos 2

Análisis Instrumental de los Alimentos 3

1.1. EL ANÁLISIS DE LOS ALIMENTOS

primas, almacenamiento, transportación, etc., proponiendo medidas eficaces

Análisis Instrumental de los Alimentos 6

El control de calidad no se circunscribe solo al producto final, sino que

Análisis Instrumental de los Alimentos 7

3. Estudios nutricionales y toxicológicos.

(deportistas, diabéticos, obesos, personas con trastornos del metabolismo,

1.2. QUÍMICA ANALÍTICA. DEFINICIÓN Y CLASIFICACIÓN DE LOS

Ambos grupos de métodos pueden emplearse con fines cualitativos y

1.3. METODOLOGÍA ANALÍTICA

Análisis Instrumental de los Alimentos 11

• Selección del método analítico

1.3.2. Selección del método analítico.

Los estudios de validación constituyen una parte esencial en el desarrollo de

Los procedimientos de muestreo, en casos particulares, pueden ser totalmente

Análisis Instrumental de los Alimentos 15

depende de las características del método y de los objetivos del análisis.

Nótese que el mayor tiempo es consumido justamente en la etapa de

Análisis Instrumental de los Alimentos 16

2. Muestras muy diluidas, es decir, el o los analitos se encuentran en bajas