MÉTODOS BÁSICOS PARA EL AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTRIAS DEL AGUA

MÉTODOS BÁSICOS PARA EL AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTRIAS DEL AGUA

Rector General
Dr. José Lema Labadie
Secretario General
Mtro. Javier Melgoza Valdivia
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA-Xochimilco

Rector
Dr. Cuauhtémoc V. Pérez Llanas
Secretaria Académica
Lic. Hilda Rosario Dávila Ibáñez

División de Ciencias Biológicas y de la Salud

Director
Dr. Salvador Vega y León
Secretaria Académica
Dra. Patricia Emilia Alfaro Moctezuma

Departamento de Atención a la Salud

Jefa del Departamento
M. en C. María Elena Contreras Garfias

Departamento de Sistemas Biológicos

Jefe de Departamento
Dr. Cuauhtémoc Pérez González

Departamento de Agrícola y Animal

Jefe de Departamento
Dr. Fernando de León González

Comité Editorial
Dra. Patricia Emilia Alfaro Moctezuma
M. en C. Teresa Izquierdo Sánchez
M. en C. Margarita Pulido Navarro

ISBN 970-31-0790-7
978-970-31-0790-2

Primera edición: 2007

Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Xochimilco
Calzada del Hueso N°1100, Colonia Villa Quietud,
04960, México, D.F
 MÉTODOS BÁSICOS PARA EL AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTRIAS DEL AGUA

MÉTODOS BÁSICOS

PARA EL AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN

DE ENTEROBACTERIAS DEL AGUA

MANUAL

Jaime A. Bustos Martínez 1

Elisa Drago Serrano 2
Luis Pedro Moles y Cervantes 3
Rodrigo Ramírez Ibarra 4
Nora Rojas Serranía 2

1 Depto. Atención a la Salud

2 Depto. Sistemas Biológicos
3 Depto. Producción Agrícola y Animal
4 Instituta Nacional de Psiquiatría Ramón de la Fuente
 MÉTODOS BÁSICOS PARA EL AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTRIAS DEL AGUA

ÍNDICE

INTRODUCCIÓN

Principios teóricos
Reglamento del laboratorio

PRIMERA SESIÓN

PRUEBAS BIOQUÍMICAS
PARA ENTEROBACTERIAS

I. Pruebas de identificación
bioquímica de los cultivos puros
seleccionados

TABLA DE RESULTADOS

II. Observación microscópica de los

cultivos puros seleccionados

SEGUNDA SESIÓN

IDENTIFICACIÓN DE LAS
ENTEROBACTERIAS

I. Interpretación de las pruebas

de identificación bioquímica
II. Manejo del material
contaminado

CUADRO 3. CARACTERISTICAS PARA

LA IDENTIFICACIÓN DE LAS
ENTEROBACTERIACEAE MÁS
COMUNES

CUESTIONARIO
 MÉTODOS BÁSICOS PARA EL AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTRIAS DEL AGUA

INTRODUCCIÓN

modular. Pero es necesario que el alumno

consulte la bibliografía especializada cuando
Considerando que el estudio de la
se trate de otro tipo de bacterias, para llevar a
enfermedades transmisibles ocasionadas por
cabo un análisis microbiológico adecuado.
microrganismos patógenos constituye el
objetivo de trasformación del módulo Principios teóricos.
Procesos Celulares Fundamentales (PCF) del
Enterobacteriacea
Tronco Divisional de Ciencias Biológicas y de
la Salud (TD de CBS), el objetivo del presente Las enterobacteriacea son bacilos gram
texto es introducir a los alumnos de este negativos, distribuidos en la naturaleza en
módulo el manejo de los métodos básicos forma amplia, se encuentran en el suelo, en el
empleados en el laboratorio de microbiología, agua sobre las plantas y como su nombre lo
tomando como modelo el aislamiento e indica se encuentran dentro del tracto
identificación de enterobacterias a partir de intestinal de los seres humano y los animales.
muestras de agua. Se aíslan con mucha frecuencia de muestras
clínicas.
La metodología descrita consta de dos
sesiones: La familia enterobacteriaceae está formada
por aproximadamente 31 géneros y 139
1. Aislamiento y observación de las
especies y miles de serotipos. Algunos
características macroscópicas y microscópicas
miembros de la familia siempre se asocian a
de las enterobacterias. Pruebas bioquímicas
enfermedades cuando se aíslan en el hombre,
para enterobacterias
por ejemplo: Shigella, Salmonella, Yersinia
2. Identificaciones de las enterobacterias. pestis, mientras que otros son miembros de la
flora normal que producen infecciones
El objetivo de la primera sesión es que el
oportunistas, por ejemplo: Escherichia coli.
alumno aprenda a observar y a determinar las
Klebsiella pneumoniae. Proteus mirabilis.
características macroscópicas y microscópicas
de las colonias aisladas. Que el alumno Las enterobacterias son causantes de un gran
conozca los fundamentos de las pruebas número de enfermedades infecciosas en el
bioquímicas y realice las que se requieren para humano, entre los más comunes se encuentran
identificar a las enterobacterias. los síndromes diarreicos y disentéricos,
causados por cepas de Escherichia coli,
El objetivo de la segunda sesión es que el
Salmonella y Shigella. La fiebre tifoidea
alumno aprenda a interpretar las pruebas
causada por especies de salmonela. Se tienen
bioquímicas y finalmente identifique las
casos de neumonía causados por Klebsiella
enterobacterias aisladas.
pneumoniae; especies de Proteus, E. coli y
Es recomendable que el alumno resuelva el varios miembros del grupo Klebsiella
cuestionario planteado al final de este Enterobacter se aíslan en heridas traumáticas,
documento, para autoevaluar el logro de los contaminadas con tierra o materia vegetal o de
resultados obtenidos a lo largo de las sesiones incisiones abdominales después de una
y colateralmente retroalimentar los conceptos cirugía. El shock endotóxico es una
básicos recibidos en el aula. manifestación potencialmente letal de la
infección por enterobacterias.
Además, la metodología propuesta en este
texto puede servir de apoyo metodológico para
el desarrollo del trabajo de investigación
 MÉTODOS BÁSICOS PARA EL AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTRIAS DEL AGUA

Pasos para una identificación presuntiva diferentes características metabólicas de los

microrganismos, se puede determinar un perfil
Los pasos a seguir para determinar si una
bioquímico para hacer una clasificación de
bacteria aislada partir de muestras de alguna
especies.
fuente de contaminación puede pertenecer a la
familia Enterobacteriaceae, son los En el caso de las Enterobacteriaceae con unas
siguientes. pocas excepciones muestran las siguientes
características:
En el primer lugar se obtiene una preparación
teñida con Gram, que puede revelar bacilos y  Fermentadores de glucosa.
cocobacilos gram negativos, cuyo tamaño  Citocromo oxidasa negativa.
varia de 0.5 a 2μm de ancho y de 2 a 4μm de  Reducción de nitrato a nitrito
largo. Sin embargo, la diferenciación de
especies no puede hacerse sobre la única base Medios de aislamiento
de la morfología con la tinción de Gram. En general existen tres tipos de medios para el
El segundo paso es observar las características aislamiento de bacterias: los medios no
morfológicas de la colonia cuando crece en un selectivos, los selectivos y los de
medio sólido. Típicamente, los miembros de enriquecimiento. Los primeros permiten el
Enterobacteriaceae producen colonias crecimiento de cualquier microorganismo y se
mucoides o secas relativamente grandes, utilizan generalmente para un aislamiento
dependiendo del medio de crecimiento es el primario. Los segundos como su nombre lo
color de las colonias por ejemplo, colonias indica sirven para el crecimiento selectivo de
color gris opaco en agar sangre sugiere cepas uno a varios tipos de bacterias.
de Klebsiella pneumoniae; colonias rojas en Los de enriquecimiento contienen
agar MacConkey o que tienen brillo verde suplementos que permiten aumentar el número
metálico sobre agar eosina azul de metileno de un tipo de bacterias e inhibir el crecimiento
(EMB), indican que la bacteria es capaz de de otras.
formar acido a partir de la lactosa presente en
el medio. Sin embargo, la diferenciación de Para recuperar las bacterias de interés a partir
Enterobacteriaceae se basa en la presencia o de una muestra que puede contener una mezcla
ausencia de diferentes enzimas codificadas de microorganismos, debe utilizarse medios de
con el material genético del cromosoma cultivo selectivos. Se debe conocer la
bacteriano. composición de cada fórmula, la
concentración relativa y el propósito de cada
El tercer y definitivo paso para una compuesto que se incluye. Por ejemplo, el agar
identificación de miembros de SS contiene alrededor de cinco veces la
Enterobacteriaceae requiere un conjunto de concentración de sales biliares del agar
pruebas bioquímicas. Estas pruebas MacConkey por los que es más inhibitorio
caracterizan las enzimas que dirigen el para E. coli y más selectivo para la
metabolismo de las baterías a lo largo de uno recuperación de especies Salmonella.
o más caminos que pueden ser detectados por
medios especiales. Los sustratos sobre los Se dispone de tres tipos generales de medios
cuales pueden reaccionar estas enzimas están para la recuperación de Enterobacteriaceae a
incorporados al medio de cultivo, junto con un partir de muestras que potencialmente alojan
indicador que puede detectar la utilización del mezclas de bacterias: 1) medio no selectivo
sustrato o la presencia de productos para aislamiento primario (por ejemplo, agar
metabólicos específicos. Mediante la sangre): 2) agar selectivo y diferencial (por
selección de una serie de medios que midan las ejemplo, agar MacConkey y agar Salmonella-
 MÉTODOS BÁSICOS PARA EL AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTRIAS DEL AGUA

Shigella) y 3) caldos de enriquecimiento (por como fuente de carbono y da reacciones más

ejemplo: caldo selenito) en paralelo al agar MacConkey, pero también
puede estar adicionado con sacarosa. Las
Medios de aislamiento selectivos para colonias de bacterias fuertemente
Enterobacteriaceae fermentadoras de lactosa como E. coli, se ven
Existen dos medios principales para el de un color negro verdoso con brillo metálico.
aislamiento selectivo de Enterobacteriaceae: Las fermentadoras débiles como Klebsiella,
el agar MacConkey y el agar eosina azul de Enterobacter. Serratia y Hafnia, producen
metileno (EMB). Los agares MacConkey y colonias púrpura. Las no fermentadoras que
EMB son solamente moderadamente incluyen Proteus, Salmonella y Shigella,
inhibitorios y fueron diseñados en un producen colonias transparentes.
principio para evitar el crecimiento de
Medios de aislamiento altamente selectivos
bacterias grampositivas. Muchas especies de
para Enterobacteriaceae
gramnegativas exigentes también son
inhibidas, sin embargo, todas las Los medios se hacen altamente selectivos al
Enterobacteriaceae crecen bien. La decisión agregar sustancias inhibidoras en
de usar agar MacConkey o EMB es ante todo concentración más altas que en agar
una cuestión personal, dado que las especies MacConkey o EMB. Estos medios son
bacterianas que utilizan lactosa pueden ser utilizados primariamente para inhibir el
diferenciadas por ambos medios. A crecimiento de E. coli y otros coliformes, pero
continuación se describen los medios. permiten el crecimiento de especies
Salmonella y Shigella. Los más comúnmente
Agar MacConkey: es un medio diferencial
utilizados son el agar Salmonella-Shigella
para la selección y recuperación de
(SS), el agar xilosa-lisina-desoxicolato (XLD)
Enterobacteriaceae y bacilos gramnegativos
y el agar Hektoen entérico (HE). La decisión
entéricos relacionados. Contiene sales biliares
respecto de cuál de estos medios utilizar para
y cristal violeta que inhiben el crecimiento de
el aislamiento de patógenos entéricos depende
bacterias grampositivas y de algunas
de la preferencia personal y de las especies que
gramnegativas exigentes. Contiene lactosa
van hacer seleccionadas. A continuación se
como única fuente de carbono. Las bacterias
describen estos medios.
fermentadoras de lactosa producen colonias
que tienen distintos tonos de color rojo, debido Agar SS. Es un medio altamente selectivo
al cambio por la producción de ácidos mixtos formulado para inhibir el crecimiento de la
del colorante indicador rojo neutro (color rojo mayoría de las bacterias coliformes y permitir
a un pH menor de 6.8). Las colonias de el desarrollo de especies Salmonella y
bacterias no fermentadoras de lactosa Shigella. Contiene altas concentraciones de
aparecen sin color, transparentes. sales biliares y citrato de sodio que inhiben a
todas las bacterias grampositivas y muchas
Agar EMB: es un medio diferencial para el
gramnegativas incluyendo las coliformes. La
aislamiento y detección de
lactosa es la única fuente de carbono y el rojo
Enterobacteriaceae o de bacilos coliformes.
neutro es el indicador para la detección de
Contienen colorantes anilínicos (eosina y azul
ácido. Presente tiosulfato de sodio como
de metileno), que inhiben las bacterias
fuente de azufre, cualquier bacteria que
grampositivas y a las gramnegativas exigentes.
produce H2S se detecta por un precipitado
Estos colorantes se combinan para formar un
negro formado con citrato férrico. Las
precipitado a pH ácido y de ese modo sirven
colonias fermentadoras del lactosa aparecen
además como indicadores de la producción de
de color rojo, como cepas poco frecuentes de
ácido. El medio puede contener solo lactosa
 MÉTODOS BÁSICOS PARA EL AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTRIAS DEL AGUA

Salmonella arizone. Las colonias de centros negros. Shigella, Providencia y

Salmonella aparecen sin color con centro muchas especies de Proteus no utilizan ningún
negro, debido a la producción de H2S. las carbohidrato y producen colonias
especies de Shigella muestran colonias sin transparentes. Las colonias de Citrobacter son
color y sin ennegrecimiento. amarillas con centro negro.
Agar HE: incrementa el rendimiento de Medios de enriquecimientos para
especies de Salmonella y Shigella a partir de Enterobacteriaceae
flora normal numerosa. Contiene alta
Estos medios se utilizan para favorecer el
concentración de sales biliares que inhiben el
crecimiento de ciertas especies bacterianas al
crecimiento de todas las bacterias
mismo tiempo que inhibe el desarrollo de
grampositivas y retarda el de muchas cepas
microorganismos no deseados.
coliformes. Las bacterias producen ácidos a
partir de lactosa y sacarosa, y la fucsina ácida Los caldos de enriquecimiento se emplean
al reaccionar con azul de timol, produce un principalmente para la recuperación de
color amarillo a pH bajo. Contiene tiosulfato especies de Salmonella y Shigella de muestras
de sodio como fuente de azufre y la donde el número de bacterias se encuentran en
producción de H2S se detecta mediante citrato un número relativamente bajo. Estos medios
férrico de amonio. Las bacterias funcionan bajo el principio de que E. coli y
fermentadoras rápidas de lactosa como E. coli, otras bacterias gramnegativas se mantienen en
son inhibidas moderadamente y producen una fase de retardo prolongado por los
colonias naranja brillantes o rosado salmón. inhibidores químicos presentes en el caldo.
Las colonias de Salmonella son azul-verdosas Las especies de Salmonella y Shigella se
con centros negros de H2S. Shigella aparece inhiben mucho menos, entran en una fase
más verde que Salmonella y las colonias exponencial de crecimiento y son recuperadas
palidecen hacia la periferia. Las cepas de mucho más rápido de las muestras. Sin
Proteus son inhibidas en cierta forma y las embargo, después de varias horas el medio de
colonias que desarrollan son pequeñas enriquecimiento deja de suprimir el
transparentes. crecimiento de E. coli y otros
microorganismos entéricos los cuales en
Agar XLD: es menos inhibidor de bacilos
última instancia sobrecrecen en el cultivo. Por
coliformes que el agar HE y fue diseñado para
lo tanto, para la recuperación de especies de
detectar Shigella en heces después del
Salmonella y Shigella, se recomienda que el
enriquecimiento en caldo para gramnegativos.
caldo de enriquecimiento se subcultive antes
Contiene sales biliares en concentración
de las 8 horas.
relativamente baja que hace que el medio sea
menos selectivo que el SS y el HE. Contiene Los dos medios de enriquecimiento más
tres carbohidratos para la producción de ácidos comunes son el caldo selenito y el caldo
y el indicador de pH es el rojo fenol. Las gramnegativo (GN).
bacterias lisina positiva, como especies de
Salmonella, producen colonias inicialmente Caldo Selenito: se recomienda para el
amarillas por la utilización de xilosa y colonias aislamiento de salmonelas de muestras que
rojas retardadas por la descarboxilacion de la tienen altas concentraciones de bacterias
lisina. La detección de H2S es similar al del mixtas como heces, orina o aguas cloacales,
agar HE. E. coli especies de Klebsiella- que tienen altas concentraciones de bacterias
Enterobacter y de Proteus producen colonias mixtas. El selenito de sodio inhibe E. coli y
amarillas. La mayoría de las especies de otros bacilos coliformes, incluyendo muchas
Salmonella producen colonias rojas con cepas de Shigella. El medio funciona mejor en
 MÉTODOS BÁSICOS PARA EL AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTRIAS DEL AGUA

condiciones anaerobias. Se recomienda el  Producción de catalasa: se detecta si

subcultivo dentro de las 8-12 horas a agar SS. la bacteria presenta la enzima catalasa,
se requiere de H₂O₂.
Caldo GN: sirve para la recuperación de
 Producción de indol: sirve para
especies de Salmonella y Shigella cuando
comprobar la presencia de la enzima
están en bajo número en las muestras fecales.
triptofanasa, se utiliza el reactivo de
Contienen baja concentración de desoxicolato
Kovac o el Ehrlich.
por lo que es menos inhibidor para E. coli y
otros coliformes. La mayoría de las cepas de  Rojo de metilo: identifica las
Shigella crecen bien. El desoxicolato y el especies bacterianas que producen
citrato que contiene el caldo, son inhibidores ácidos fuertes a partir de la glucosa, se
de bacterias grampositivas. Contiene una requiere el medio Voges-
concentración elevada de manitol, por lo que Proskauer/Rojo de medio (VP-RM)
inhibe el crecimiento de Proteus y a su vez  Prueba de Voges-Ptoskauer: mide la
favorece el crecimiento de Salmonella, ya que conversión de acetil-metil-carbonil o
ambas son capaces de fermentar manitol. El acetoína en diacetilo, se necesita el
caldo puede volverse turbio dentro de las 4-6 medio VP.
horas después de la inoculación, se  Utilización de citrato: detecta la
recomienda el subcultivo en agar HE o XLD capacidad de un microorganismo para
dentro de este lapso. utilizar citrato de sodio como única
fuente de carbono, se requiere el
medio de citrato de Simmons.
Pruebas bioquímicas para la identificación  Producción de ureasa: determina si
la bacteria produce enzima ureasa, se
de Enterobacteriacea
utiliza el caldo urea.
A pesar de que los medios de aislamiento  Producción de ácido sulfhídrico: se
primarios se basan en reacciones bioquímicas identifica si la bacteria es capaz de
que realizan las bacterias en el medio, se liberar azufre en forma de H₂S a partir
requiere de otros métodos para la de aminoácidos que contienen azufre
identificación de la especie. Estos métodos son u otro compuesto que contenga azufre.
las pruebas bioquímicas, que se basan en la Esto se puede observar en el medio
determinación de las características SIM o TSI.
fenotípicas adicionales que reflejan el  Movilidad: se determina si la bacteria
genotipo y por lo tanto, la identidad única de presenta flagelos. Se puede utilizar el
los microorganismos que se analizan. Existe medio SIM o TSI
una gran cantidad de pruebas y numerosos  Actividad de o-nitrofenil-β-D-
esquemas disponibles para la identificación galactopiranósido: con esta prueba
final de especies de Enterobacteriaceae. se detecta la presencia de la enzima β-
Las pruebas que generalmente se utilizan para galactosidasa. Se conoce como prueba
identificar las características metabólicas de ONPG.
las enterobacterias son:  Descarboxilación de lisina, ornitina
y arginina: se utiliza para determinar
 Utilización de carbohidratos: se si las bacterias contienen enzimas para
determina el tipo de azúcares que descarboxilar aminoácidos
pueden fermentar las bacterias, específicos, esto se observa con el
normalmente se utiliza el agar hierro caldo descarboxilasa de Moeller.
triple azúcar (TSI) o medio Kliger.  Producción de fenilalanina
desaminasa: se detecta la presencia
 MÉTODOS BÁSICOS PARA EL AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTRIAS DEL AGUA

de la enzima responsable de la
desaminación oxidativa de la
fenilalanina, se utiliza el agar urea de
Christensen.
 Reducción de nitratos: se comprueba
si la bacteria puede reducir los nitratos
en nitritos, se requiere el caldo nitrato
o agar nitrato.
Selección de medios para un aislamiento
positivo de Enterobacteraceae
A continuación se da una guía para la
selección de medios que pueden ser adecuados
para el aislamiento de Enterobacteriaceae a
partir de muestras clínicas o de otra fuente de
contaminación:
1. Sembrar la muestra en agar
MacConkey o EMB para un
aislamiento primario de todas las
especies de bacilos entéricos
gramnegativos.
2. En caso que se requiera un
aislamiento selectivo de especie
de Salmonella o Shigella, sembrar
en placas de agar XLD o HE.
3. Para el paso anterior, si se
sospecha que la muestra tiene una
baja concentración de Salmonella
y Shigella, enriquecer una porción
de la muestra inoculando en caldo
selenito o GN. Si se utiliza caldo
selenito, subcultivar en agar HE
dentro de las 8 a 12 horas. Si se
utiliza caldo GN, subcultivar
dentro de las 4 horas.
4. Seleccionar colonias sospechosas
para la identificación bioquímica
o para pruebas serológicas.
 MÉTODOS BÁSICOS PARA EL AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTRIAS DEL AGUA

12. Está prohibido fumar e ingerir

alimentos dentro del laboratorio.
REGLAMETO DEL LABORATORIO 13. Todo el material que se va a incubar
debe quedar etiquetado con los
siguientes datos: 1) Grupo: 2) Equipo:
1. Presentarse puntualmente en el 3) Fecha: 4) Tipo de Material. Por lo
horario y laboratorio indicado por la que deberás traer masking-tape y
CTD de CBS. plumón de tinta indeleble de punta
2. Leer la práctica antes de comenzar delgada. Al finalizar la práctica,
cada sesión colocar el material en los recipientes
3. Es obligatorio presentarse con bata de para desecho de material biológico o
algodón de manga larga, cubrebocas esterilización, de acuerdo con las
y guantes de hule látex, cédula de instrucciones del profesor. El material
identificación, el material y equipo que se deseche debe quedar libre de
solicitado en cada sesión. etiquetas y marcas.
4. Recogerse el cabello antes de entrar al 14. Colocar las pipetas usadas sin la
laboratorio. trampa de algodón y con la punta
5. Mantener la puerta y ventanas hacia abajo en recipientes de
abiertas del laboratorio. hipoclorito de sodio comercial diluido
6. Dejar únicamente lo que se va a 1:10.
utilizar sobre la mesa de trabajo 15. Depositar dentro de la bolsa de
7. Limpiar y desinfectar las superficie de plástico especificada para desecho de
la mesa de trabajo antes de iniciar y al productos biológicos de color ROJO.
terminar cada sesión. Por lo que se El material de desecho de acuerdo con
deberá traer en todas las sesiones: las instrucciones del profesor.
Solución desinfectante (hipoclorito de Es necesario apegarse al desarrollo
sodio al 10% o benzal diluido 1:10), especificado en cada una de las sesiones.
toallas de papel secante (sanitas), una
franela, detergente, un recipiente para
preparar jabonadura y una esponja.
8. Presentarse a solicitar el material
requerido en los interlaboratorios con
la cédula de identificación
actualizada.
9. El material entregado deberá ser
revisado por los alumnos
asegurándose que se encuentren en
buenas condiciones y se devolverá en
las mismas condiciones.
10. En caso de deterioro de dicho
material, deberá ser restituido a la
brevedad posible por parte de los
alumnos de dicho equipo.
11. Informar al profesor de manera
inmediata cualquier accidente de
trabajo.
 MÉTODOS BÁSICOS PARA EL AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTRIAS DEL AGUA

O) 6 tubos de 13x100mm con caldo VP-

RM (Voges Proskauer - rojo de
PRIMERA SESIÓN metilo) (color ámbar)
Solicitar en el interlaboratorio de equipo
PRUEBAS BIOQUIMÍCAS PARA
1 Microscopio por equipo
ENTEROBACTERIAS

Cada equipo debe traer en esta sesión

CONTENIDO
A) Toallas de papel secante (sanitas)
I. Pruebas de identificación
B) 1 Bulbo de hule para pipeta Pasteur
bioquímica de los cultivos puros
C) 10 Portaobjetos
seleccionados.
D) 10 Cubrebocas
II. Observación microscópica de los
E) 1 Asa bacteriológica
cultivos puros seleccionados
F) Cerillos o encendedor
Solicitar en el interlaboratorio de cristalería y G) Material para preparar zona estéril
reactivos (por equipo) para trabajo de microbiológico,
plumón, masking-tape.
A) 1 Gradilla
B) 1 Mechero Marca todos los tubos que vas a utilizar
C) 1 Matraz con solución salina isotónica poniendo una etiqueta con los siguientes
estéril (SSI) datos: Grupo, equipo, muestra y fecha.
D) 2 juegos para tinción de Gram: cristal
violeta, lugol, alcohol-acetona,
safranina. ( POR LABORATORIO) 1. Prueba de catalasa
E) 1 Puente para tinción
F) 1 Frasco gotero con aceite de La catalasa en una enzima que descompone el
inmersión. peróxido de hidrógeno (H₂O₂) en oxígeno y
G) 1 Pipeta Pasteur estéril (para la agua, químicamente la catalasa es una
solución salina isotónica estéril) hemoproteína, de estructura similar a la
H) 8 Tiras de papel filtro Whatman No. 1 hemoglobina, excepto que los cuatro átomos
de 2x3 cm estériles de hierro de la molécula están en estado de
I) 1 frasco gotero ámbar con reactivo oxidación (Fe⁺⁺⁺), en lugar de reducido (Fe⁺⁺).
para la prueba de oxidasa Excluyendo a los estreptococos, la mayoría de
J) 1 Frasco ámbar con agua oxigenada al las bacterias descomponen el H₂O₂ con
3% peroxidasas semejantes a la catalasa, salvo que
K) 3 Tubos 13x100mm con medio de cada molécula contiene solo un ión férrico. El
agar hierro triple azúcar (TSI) (medio peróxido de hidrógeno se forma como uno de
inclinado, color anaranjado) los productos finales del metabolismo
L) 3 Tubos 13x100mm con caldo urea oxidativo o aeróbico de los hidratos de
(color rosa) carbono, la catalasa lo transforma en agua y
M) 3 Tubos 13x100mm con medio oxígeno:
inclinado de agar citrato de Simmons
H₂O₂ H₂O +O₂ ↑
(medio inclinado de color verde)
N) 3 tubos de 13x100mm con caldo Catalasa
semisólido de SIM (color ámbar)
 MÉTODOS BÁSICOS PARA EL AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTRIAS DEL AGUA

sustituyendo al oxígeno, es incolora en estado

reducido, pero en presencia de citocromo
Procedimiento oxidasa y oxigeno atmosférico se oxida,
Recuerda que es necesario que laves los formando azul de indofenol. Todas las
portaobjetos con agua y jabón, y para enterobacterias dan una reacción negativa.
desengrasarlos, colocar unas gotas de alcohol- Pseudomona y Neissería son positivas.
acetona y frota la superficie inmediatamente
con una toalla de papel secante antes de
realizar esta prueba. Procedimiento
Realiza la prueba de la catalasa a los Con el asa bacteriológica colecta una porción
cultivos puros, de acuerdo a las siguientes del cultivo puro y extiéndelo sobre un papel
indicaciones: filtro Whatman No.1 estéril de 2x3 cm y sobre
éste adiciona dos gotas de reactivo para la
Coloca sobre el portaobjeto con el asa
prueba de oxidasa.
bacteriológica una porción del cultivo puro de
las bacterias del medio MacConkey, Las bacterias oxidasa positivas producen un
posteriormente agrega una gotita de agua color negro o azul intenso en 10 segundos. La
oxigenada sobre la muestra. Las bacterias que reacción se considera retardada si ocurre entre
son catalasa positiva liberan oxígeno del agua los 10 y 60 segundos posteriores. Si se observa
oxigenada, cuya presencia se manifiesta por la desarrollo de color después de los 60 segundos
liberación de pequeñas burbujas. Las bacterias la prueba se considera negativa. Para evitar
catalasa negativas no producen burbujas al falsos positivos es necesario que sostengas la
adicionar el agua oxigenada. Para evitar falsos tira de papel filtro estéril de uno de los
positivos, nunca toques el agua oxigenada con extremos con las pinzas de disección, evitando
el asa. tocar el centro de la misma.
Anota tus resultados en la tabla de resultados.
Anota tus resultados en la Tabla 1 de
Resultados.
2. Prueba de oxidasa
Elige 2 cultivos puros de agar MacConkey,
uno lactosa positivo (colonias rojas) y el
Los citocromos son hemoproteínas que
otro lactosa negativo (colonias incoloras),
contienen hierro y actúan como el último
que hayan resultado positivos a la prueba
eslabón de la cadena respiratoria, transfiriendo
de la catalasa (+) y negativo a la prueba de
electrones al oxígeno, con formación de agua.
oxidasa (-). Esto es porque todas las
El sistema de citocromos se encuentra en los
enterobacterias presentan estas
organismos aerobios y anaerobios
características. Procede a realizar las
facultativos, la prueba sirve para identificar a
siguientes pruebas de identificación
aquellos organismos que carecen de la enzima
bioquímica.
o son anaerobios obligados.

La prueba de la citocromo oxidasa utiliza

ciertos reactivos colorantes, como el
clorhidrato de p-fenilendiamina, que actúan
como aceptores artificiales de electrones,
 MÉTODOS BÁSICOS PARA EL AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTRIAS DEL AGUA

TABLA 1. RESULTADOS
Características de las bacterias observadas

COLONIA 1 COLONIA 2
MORFOLIGÍA COLONIAL
FORMA
COLOR
ELEVACIÓN
BORDE
CONSISTENCIA
TAMAÑO
OPACIDAD
SUPERFICIE
MORFOLOGIA MICROSCÓPICA
TINCIÓN DE GRAM
PRUEBAS BIOQUIMICAS
CATALASA
OXIDASA
UREA
GLUCOSA
LACTOSA
SACAROSA
MOVILIDAD
Ac. SULFHIDRICO
INDOL
ROJO DE METILO
VOGES PROSKAUER
CITRATO DE
SIMMONS
 MÉTODOS BÁSICOS PARA EL AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTRIAS DEL AGUA

Antes de efectuar las siguientes pruebas de (acetilmetilcarbinol), un subproducto de

identificación es necesario que tomes en reacción neutra. Algunos organismos como los
cuenta las siguientes indicaciones: grupos Klebsiella-Enterbacter producen
acetoína como principal subproducto de la
A. Un juego de bioquímicas consiste en:
fermentación de la glucosa y forman
1 tubo con medio semisólido se SIM
cantidades menores de ácidos mixtos. En
de color ámbar, 2 tubos con caldo VP-
presencia de oxígeno atmosférico y de
RM de color ámbar, 1 tubo con medio
hidróxido de potasio al 40%, la acetoína se
inclinado de citrato de Simmons de
convierte en diacetilo y el α-naftol actúa como
color verde, 1 tubo con medio
catalizador para revelar el color rojo.
inclinado de agar hierro triple azúcar
de color naranja y 1 tubo con caldo La prueba de rojo de metilo determina la
urea de color rosa pálido. producción de ácido y se requiere de
B. Uno de los juegos de bioquímicas organismos que produzcan ácidos orgánicos
corresponde a los controles negativos (láctico, acético, fórmico), a partir de la
o testigos de las pruebas. Estos glucosa por la vía de la fermentación ácida. El
controles se preparan introduciendo el desarrollo de color rojo estable en el medio
asa bacteriológica estéril y fría, sin indica la producción de ácido suficiente como
muestra. Incuba estos tubos sin para mantener el pH a 4.4 o menos, el
sembrar junto con los tubos desarrollo de color naranja intermedio entre el
inoculados a 37°C durante 24 horas. amarillo y el rojo indica una prueba negativa.
C. Emplea los dos juegos de bioquímicas
restantes para cultivo puro
seleccionado. Procedimiento
D. No olvides trabajar dentro del área
estéril de 20 cm de diámetro alrededor Con el asa bacteriológica toma un inoculo
de la flama del mechero. denso de cultivo puro y resuspéndelo en dos
tubos de caldo VP-RM (Voges-Proskauer/rojo
de metilo). Es importante que recuerdes que
son dos tubos por colonia aislada. Deja incubar
1. Voges – Proskauer/ Rojo de Metilo
los dos tubos a 37°C durante 24 horas.
La reacción de Voges – Proskauer recibe el
nombre de dos microbiólogos que trabajaron a
comienzos del siglo xx, siendo los primeros en 2. Citrato de Simmons
observar la reacción de color rojo producida en
medios de cultivo apropiados por tratamiento
con hidróxido de potasio (KOH). El citrato de sodio es una sal de ácido cítrico,
Posteriormente se descubrió que el principio un compuesto orgánico simple que constituye
activo formado por el metabolismo bacteriano uno de los metabolitos del ciclo de los ácidos
es el acetilmetil-carbinol, un producto de la vía tricarboxilicos (Ciclo de Krebs), algunas
butilenglicol. El ácido pirúvico, componente bacterias, obtienen energía por vía alterna de
fundamental, formado por la degradación la fermentación de los hidratos de carbono a
fermentativa de la glucosa, es metabolizado través de la utilización de citrato, como una
luego a través de varias vías: una de las cuales fuente única de carbono. Por supuesto
lleva a la producción de acetoína cualquier medio para detectar la utilización del
citrato, debe estar desprovisto de proteínas y
 MÉTODOS BÁSICOS PARA EL AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTRIAS DEL AGUA

de hidrato de carbono. La utilización del siguiendo la estría formada al picar el medio.

citrato por una bacteria se detecta por Incuba el tubo a 37°C durante 24 horas.
formación de los productos alcalinos. El
medio incluye citrato de sodio, como única
fuente de carbono y fosfato de amonio como 4. Caldo urea
única fuente de nitrógeno. Las bacterias que
pueden utilizar citrato, también puede extraer Los microorganismos que poseen la enzima
el nitrógeno de la sal de amonio, con ureasa hidrolizan urea, liberan amoniaco y
producción de amoniaco, llevando a la producen un color rojo-rosado en el medio.
alcalinización del medio por la conversión del
NH³⁺ en hidróxido de amonio (NH₄OH). El
azul de bromotimol es amarillo a pH menor de Procedimiento
6 y azul a pH mayor de 7.6, el cual es el
Con el asa bacteriológica colecta un inoculo
indicador.
poco denso del cultivo puros de bacterias y
siémbralo en el caldo urea. Incuba el tubo a
37°C durante 24 horas.
Procedimiento
Con el asa bacteriológica toma un inoculo 5. Agar Hierro Triple Azúcar (TSI)
ligero del cultivo puro y siémbralo en forma de
una estría abierta sobre el área inclinada del El principio de la fermentación de hidratos de
medio inclinada de citrato de Simmons. NO carbono se basa en los estudios de Pasteur en
punciones la capa profunda del medio puesto bacterias y levaduras, que afirman que la
que sirve de control de color. Deja incubar el acción de muchas especies de
tubo a 37°C durante 24 horas. microorganismos sobre su sustrato de hidrato
de carbono da como resultado la acidificación
del medio. La utilización de los carbohidratos
3. Indol se puede determinar con el agar (TSI). El
El indol es uno de los productos de medio contiene tres carbohidratos: glucosa,
degradación del metabolismo del aminoácido lactosa y sacarosa, se determina cuál de los tres
triptófano. Las bacterias que poseen la enzima puede ser fermentado por la bacteria. En la
triptofanasa son capaces de utilizar triptófano práctica, microorganismos que son incapaces
produciendo indol, ácido pirúvico y amoniaco de fermentar la glucosa por lo común se
(NH₃). El indol puede detectarse en un medio detectan por las reacciones que producen en el
de prueba con triptófano observando la agar TSI. Una reacción de pico de flauta
aparición de color rojo luego de agregar una alcalino/profundidad alcalina (sin cambio),
solución que contiene p-dimetil- indica ausencia de producción de ácido y una
aminobenzaldehído (reactivo de Kovac). incapacidad del microorganismo para
fermentar la glucosa y otros hidratos de
carbonos presentes. Esta sola reacción es
suficiente para excluir un microorganismo de
Procedimiento
la familia Enterobacteriaceae.
Con el asa bacteriológica recta, colecta un
Procedimiento
inoculo poco denso del cultivo puro de
bacteria y siémbralo por picadura en el medio Con el asa bacteriológica recta, coloca un
SIM introduciendo dicho inoculo por el centro inóculo poco denso del cultivo puro de
y a 3mm del fondo del tubo y extrae el asa bacterias y siémbralo por picadura en el fondo
 MÉTODOS BÁSICOS PARA EL AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTRIAS DEL AGUA

y en forma de estría en la superficie incubada safranina, las bacterias gramnegativas

en el tubo a 37°C durante 24 horas. aparecen rojas o rosadas al observarse con
microscopio, debido a que ahora el interior de
la célula es teñido por la safranina.
III. Observación microscópica de
los cultivos seleccionados A. Preparación del frotis
Antes de llevar a cabo la observación
Un procedimiento útil para el examen de microscópica de los cultivos puros
muestras es el estudio macroscópico de frotis seleccionados es necesario que leas con
preparados a partir de ellas, las cuales deben cuidado las siguientes indicaciones.
ser teñidas por el método adecuado,
a) Lava los portaobjetos con agua y
dependiendo del tipo de microorganismos o
jabón, desengrásalos con unas gotas
parte del mismo que se desea observar. Por
de alcohol-acetona y sécalos con una
ejemplo: tinción simple, diferencial (tinción
toalla de papel secante, ya que si no
Gram), tinción negativa, tinción para cápsulas,
están PERFECTAMENTE LIMPIOS
tinción para esporas, entre otras. El método
Y LIBRES DE GRASA. NO SE
más utilizado es la tinción de Gram.
OBTIENE UN BUEN FROTIS y con
Tinción de Gram ello se dificulta la observación
microscópica de las bacterias.
La coloración de Gram, descubierta por Hans
Christian Gram, es una tinción diferencial
b) Para preparar el frotis es necesario que
utilizada para el examen microscópico de
recojas sólo una pequeña porción de
bacterias. Esta técnica se basa en las
UNA COLONIA AISLADA, para
diferencias estructurales de la pared celular de
poder observar con claridad en el
las bacterias. Con base a esa tinción se divide
microscopio la forma y la coloración
la mayoría de las bacterias en dos grupos,
de las bacterias.
bacterias grampositivias y bacterias
gramnegativas. El procedimiento involucra al
c) Es recomendable que rotules la cara
cristal violeta (violeta de genciana) que actúa
de portaobjetos donde está fijado el
como un colorante primario, el cual penetra a
frotis con un pedacito de masking-
la célula tiñendo todo el citoplasma
tape, para evitar errores al
bacteriano. Posteriormente se adiciona yodo
manipularla.
que sirve como mordiente para formar un
complejo yodo-cristal violeta, estos complejos
d) Recuerda que no es necesario que
son retenidos por la pared de las células
utilices grandes cantidades de
grampositivas, aún después del tratamiento
colorantes para obtener una buena
con el colorante orgánico (alcohol-acetona),
tinción, con una gota o dos de cada
debido a la gruesa capa de peptidoglucano y
uno de ellos es más que suficiente.
ácidos teicoicos de que está constituida la
pared celular. Las bacterias gramnegativas
e) NO TOQUES LAS LENTES O EL
pierden la coloración primaria debido a que los
CUERPO DEL MICROSCOPIO
complejos yodo-cristal violeta salen de la
CON LAS MANOS MANCHADAS
célula cuando los solventes orgánicos
CON LOS COLORANTES.
(alcohol-acetona), aumentan la permeabilidad
de la pared celular ya que está constituida por
f) No olvides trabajar dentro del área
una gran cantidad de lípidos. El colorante
estéril.
secundario o de contraste utilizado es la
 MÉTODOS BÁSICOS PARA EL AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTRIAS DEL AGUA

5. Deja resbalar por goteo lento a

g) Coloca una gotita de SSI estéril en un partir de uno de los extremos del
portaobjetos y con ayuda del asa portaobjetos de la mezcla de
bacteriológica estéril y fría, alcohol-acetona hasta que se
resuspende una pequeña porción del desprenda el colorante
cultivo puro que resembraste en el (aproximadamente 30 seg.) y lava
agar MacConkey, hasta formar una inmediatamente con agua como
mezcla homogénea. de indicó en el punto No. 4.

h) Extiende la suspensión con el asa 6. Escurre las gotas de agua y cubre

hasta formar una partícula fina y la preparación con safranina
uniforme. durante 1 minuto y lava con agua
de la llave (punto No. 4.)
i) Fija el frotis con calor, pasándolo por
la flama del mechero, orientando 7. Deja secar la preparación al aire
hacia arriba la cara del portaobjetos perfectamente pues al quedar
donde preparaste el frotis. El máximo gotas de agua, se dificulta la
calor aplicado debe de ser soportable observación de las bacterias,
sobre el dorso de la mano, de la cara sobre todo al momento de añadir
del portaobjetos orientada hacia la el aceite de inmersión sobre la
flama, para evitar la calcinación de las preparación. No utilices papel
bacterias. para secar la preparación.

j) Realiza la tinción de Gram como a 8. Observa la preparación con el

continuación se describe. objetivo 10x (seco débil) y
después con el de 40x (seco
fuerte).
B. Tinción de Gram
9. Coloca una gota de aceite de
1. Cubre el frotis con cristal violeta inmersión sobre la preparación y
durante 1 minuto. obsérvala con el objetivo 100x
(inmersión)
2. Escurre colorante y lava con la
solución de lugol.
Al terminar la sesión es importante que:
3. Cubre el frotis con lugol durante 1 1. Lava la mesa y desinfecta con la
minuto. solución de hipoclorito al 10% o
con benzal diluído 1:10.
4. Escurre y elimina el exceso de 2. Guarda en refrigeración (4°C) la
lugol con agua. Realiza un goteo caja de agar MacConkey del
suave y continuo del agua de la cultivo etiquetado.
llave para evitar deslavamiento de 3. Deposite la basura en el cesto
las bacterias fijadas sobre el destinado para tal fin.
portaobjetos.
 MÉTODOS BÁSICOS PARA EL AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTRIAS DEL AGUA

Cuadro 3 de Características para

identificación de Enterobacteriaceae
SEGUNDA SESIÓN más comunes.

IDENTIFICACIÓN DE LAS 1. Voges-Proskauer. Adiciona a uno de

ENTEROBACTERIAS los tubos del caldo Voges-Proskauer
los siguientes reactivos en el orden
CONTENIDO indicado.
I. Interpretación de las pruebas de
identificación bioquímica Para evitar la contaminación de los
II. Manejo de material reactivos en la prueba de Voges-
contaminado. Proskauer, utiliza una pipeta de
1mL en cada uno de ellos.
Material y reactivos por equipo
a) 0.6 mL de la solución etílica
Solicitar en el interlaboratorio de de α – naftol al 5%
cristalería y reactivos b) 0.2 mL de la solución de KOH
al 40%
A) 1 Frasco gotero ámbar con el c) Agita el tubo de déjalo en
indicador rojo de metilo reposo de 10 a 15 minuto
B) 2 Pipetas de 1 ml.
C) 1 Frasco gotero con solución etílica Interpretación
de α – naftol al 5%
D) 1 Frasco gotero con solución de Prueba positiva: color rojo en el medio
hidróxido de potasio (KOH) al (presencia de acetoína).
40%, puede utilizarse hidróxido de
sodio (NaOH) al 40% Prueba negativa: color amarillo o
E) 1 Frasco gotero con reactivo de cobrizo en el medio. El tubo control,
Kovac o Ehrlich para la prueba de que es el tubo que no contiene el inoculo
indol. bacteriano, pero si se agregan los
F) 1 Perilla o propipeta. reactivo, deben dar una reacción
negativa.
Los alumnos deben traer en esta sesión.
A) 1 Escobillón para lavar tubos de 13 2. Rojo de Metilo: Adiciona 2 gotas de
x 100mm. indicador rojo de metilo al otro tubo
B) Material para preparar zona estéril con el caldo Voges-Proskauer y agita.
para trabajo microbiológico,
pulmón, masking-tape. Interpretación

Pruebas positiva: Color rojo en el medio

I. Interpretación de las
pruebas de identificación
bioquímica Reacción retardada: Color anaranjado
Prueba negativa: Color amarillo en el
Anota tus resultados en la Tabla 1 de medio
Resultados y compáralos con el
 MÉTODOS BÁSICOS PARA EL AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTRIAS DEL AGUA

El tubo control debe dar una reacción Prueba positiva: El medio de SIM debe
negativa. encontrarse turbio

Prueba negativa: solo debe existir

4. Indol: Agregar 2 gotas del reactivo
crecimiento a lo largo de la picadura.
de Kovac al tubo inoculado del medio
se SIM.
El tubo control debe dar una reacción
negativa

Interpretación
7. Ureasa
Prueba positiva: Aparición de un color
rojo 1 o 3 minutos después de adicionar Interpretación
el reactivo.
Prueba positiva: Color rosa fuerte (rosa
mexicano), en el caldo urea
Prueba negativa: color amarillo.
Prueba negativa: Color amarillo o sin
cambio en el caldo urea
El tubo control debe dar una reacción
El tubo control debe dar una reacción
negativa.
negativa.

5. Ácido sulfhídrico (H₂S): analizar el

8. TSI (hierro triple azúcar)
medio SIM.

Interpretación
Interpretación
Pico de flauta rojo/profundidad amarillo:
Medio Alcalino/Ácido (Alc/A). Glucosa
Prueba positiva: Color negro en la fermentada: lactosa o sacarosa no
picadura o en todo el tubo. fermentada.

Pico de flauta amarillo/ profundidad amarillo:

Medio Acido/Ácido (A/A). Glucosa, lactosa
Prueba negativa: Ausencia de color
y/o sacarosa fermentada.
negro en el tubo
Pico de flauta rojo/profundidad rojo: Medio
Alcalino/Alcalino (ALc/ALc) Reacción
El tubo control debe dar una reacción negativa, no hay fermentación de ninguno
negativa de los carbohidratos.

Producción de H₂S: Medio de color negro.

6. Movilidad: observar el medio SIM
Producción de gas durante la fermentación de
Interpretación cualquiera de los azúcares: Hay formación de
burbujas con quebraduras en el fondo del agar.
 MÉTODOS BÁSICOS PARA EL AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTRIAS DEL AGUA

El tubo control debe dar una reacción negativa. laves con agua y jabón utilizando
guantes de hule. Cuando estén limpios
regrésalos al laboratorista.
Anota tus resultados en la Tabla 1 de 5. Envuelve con el masking-tape todas
resultados y compáralos con el Cuadro 3 de las cajas de cultivo que utilizaste a lo
las características para la identificación de largo de la práctica, colócalas dentro
Enterobacteriaceae más comunes. Describe de las bolsas de polietileno color rojo,
los microorganismos que identificaste, que que se encuentran en el contenedor de
características tienen y que aplicaciones material biológico contaminado.
sanitarias pueden presentan. 6. Lleva las bolsas con tu material de
desecho al depósito provisto para ello.
Consulta con tu profesor o con el
II Manejo de material contaminado técnico laboratorista.

Al finalizar la sesión:
1. Lava y de desinfecta la mesa con la
solución de hipoclorito de sodio al
100% o con benzal 1:10
2. Recoge y deposita la basura en el cesto
destinado para el final
3. Saca del refrigerador y estufa todas las
cajas de cultivo y tubos que utilizaste.
El laboratorio debe quedar
completamente vacío al concluir la
práctica.
4. Coloca un recipiente o en una gradilla
los tubos que utilizaste para realizar
las pruebas bioquímicas, quítales el
masking-tape que hayas utilizado
para etiquetarlos. Tapa los tubos de
gradilla con papel de estraza y rotula
este paquete con el N° de equipo,
grupo, turno y fecha. Lleva el paquete
al interlaboratorio para que sea
esterilizado. Una vez esterilizados los
tubos, se te devolverán para que los
 MÉTODOS BÁSICOS PARA EL AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTRIAS DEL AGUA

CUESTIONARIO 17. Describe las características de la pared

celular de las bacterias grampositivas y
1. Explica el funcionamiento de los
gramnegativas, resaltando sus
diferentes métodos físicos y químicos
diferencias.
de esterilización.
18. ¿Cómo se definen a las bacterias
2. Explica las ventajas y desventajas de
coliformes?
los métodos de la pregunta anterior e
19. ¿Qué indica la presencia de bacterias
indica cuando es recomendable utilizar
coliformes en agua?
cada uno de éstos.
20. ¿Cuál es la importancia clínica de las
3. Indica los principales agentes
bacterias coliformes?
desinfectantes y antisépticos utilizados
21. ¿Todas las bacterias coliformes son de
en la desinfección.
origen fecal?
4. ¿Qué tipo de sustancia suelen utilizarse
22. ¿Qué implicaciones epidemiológicas
comúnmente para desinfectar
tienen la presencia de enterobacterias
superficies?
en las muestras de agua que colectaste?
5. Explica cuál es el objetivo de utilizar el
23. ¿Qué enfermedades gastrointestinales
mechero para preparar la zona estéril
pueden transmitirse en el agua
para el trabajo microbiológico y señala
contaminada con materia fecal?
que factores influyen en la creación de
24. ¿Qué significa las siglas IMViC?
la zona estéril.
25. ¿Cuál es el objetivo de realizar las
6. Menciona otros métodos usados en la
pruebas de identificación IMViC?
industria y en los laboratorios de
26. ¿Por que razón no es recomendable
investigación para crear zonas de
utilizar el asa bacteriológica para
trabajo estériles.
realizar la prueba de la oxidasa?
7. Explica los riegos que puedes tener si
27. Determina el número de bacterias que
no recoges los frascos, los tubos, y las
hay en una colonia después de 24 horas
pipetas después de concluir la sesión.
de incubación. Recuerda que una
8. Explica los riesgos que puedes correr si
colonia de enterobacterias se origina a
no lavas y desinfectas la mesa de
partir de una sola bacteria (UFC) y
trabajo después de concluir cada
éstas se dividen en un tiempo promedio
sesión.
de 30 minutos.
9. Realiza el diagrama de un microscopio,
describe cada una de sus partes e indica
su función.
10. Explica que tipos de bacterias pueden
aislarse en el agua.
11. Explica cuál es el objetivo de sembrar
diluciones del agua.
12. Explica el fundamento del aislamiento
por estría cruzada.
13. Explica que tipo de bacterias pueden
aislarse en agar MacConkey.
14. Explica a qué se le llama medio de
cultivo bacteriológico
15. Explica qué es un medio de cultivo
enriquecido.
16. Explica qué es un medio de cultivo
selectivo.
MÉTODOS BÁSICOS PARA EL AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTRIAS DEL AGUA