CRISPR-Cas9 Documento
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“CRISPR - Cas 9”
Integrantes:
Nidia Michelle Olguin Trejo
Samantha Gigdém Narváez Osorio
INTRODUCCIÓN
ANTECEDENTES GENERALES
La era de la ingeniería genética inicia en 1973, con los primeros
experimentos cuando Stanley Cohen, Herbert Boyer y Paul Berg
(Premio Nobel de Química 1980). Demostraron que el gen para el ARN
ribosomal de la rana podía ser transferido y expresado en una célula
bacteriana. Este puede considerarse como el primer ejemplo de edición
genética. Años más tarde con la mutagénesis dirigida, utilizando ADN
sintético como agente para modificar genes, desarrollándose en 1978
por Michael Smith (Premio Nobel de Química 1993). Produciendo
mutaciones puntuales basadas en la noción de que se pueden inducir
mutaciones específicas en sitios específicos de un genoma. Usando
oligonucleótidos sintéticos producidos, desarrollando y perfeccionando
un método para modificar selectivamente mutaciones en genes. Con el
paso del tiempo la ciencia ha logrado avances aún más grandes
resultado de ello nuevas técnicas de mayor precisión y factibilidad. Entre
ellas podemos encontrar las nucleasas con dedos de zinc en el año
2000 y la tecnología de TALENs (transcription activator-like effector
nucleases) en el año 2010. Las nucleasas unidas a dedos de zinc (ZFN)
son una clase de proteínas de unión al ADN diseñadas que nos facilitan
la edición en una zona específica en nuestro genoma mediante la
creación de rupturas de doble cadena en el ADN, parte de la proteína
reconoce una secuencia de ADN específica y otra parte corta el ADN.
Desarrollada uniendo una serie de dominios de unión al ADN más
pequeños para reconocer una secuencia de ADN más larga. Este
dominio (dominio Cys2His2, que reconoce un triplete específicoo según
los residuos de la α hélice que se hayan elegido) de unión al ADN se
fusiona con una nucleasa que cortará el ADN cercano.
Por otro lado la tecnología TALENs (Transcription activator-like effector
nuclease) son un tipo de enzimas de restricción diseñadas
artificialmente para cortar una secuencia específica de ADN.
Constituidas al fusionar un efector tipo TAL y un dominio cortador del
ADN (una nucleasa que corta hebras de ADN). Los efectores TAL
—TALEs— pueden ser diseñados para cumplir la misión de unirse a
prácticamente cualquier secuencia de ADN, por lo que al unirse a una
nuclaeasa, el ADN se puede cortar en lugares específicos. Las enzimas
de restricción pueden introducirse en células, pueden utilizarse en la
edición génica y del genoma in situ, técnica conocida como edición
genómica mediada por nucleasas.Diseñarla es mucho más fácil en
comparación con dedos de Zinc , sin embargo por ser de gran tamaño
suele ser complicado trabajar con ellas
“Mientras la tecnología TALENs utiliza motivos de unión de ADN para
dirigir a una nucleasa. Las nucleasas unidas a dedos de zinc reconocen
tripletes de ADN, cada dominio de TALEN reconoce un solo nucleótido.
Estas herramientas actualmente son de las más confiables y
empleadas. Aunque ambas herramientas presentan ventajas
considerables (facilidad de localizar secuencias, diseño rápido y
precisión al escindir), también son métodos costosos y, en ocasiones, su
construcción resulta complicada. Por ello, el sistema CRISPR surge
como una alternativa factible para lograr la edición del genoma: es de
fácil diseño e introducción, más económico, rápido y eficiente al
momento de localizar y modificar una secuencia. Por estos factores,
CRISPR se ha convertido en uno de los sistemas con mayor potencial
en la edición genómica y actualmente se estudian sus posibles
aplicaciones en diversos ámbitos” (Lammoglia-Cobo, 2016)
En 1987, un grupo de investigación de la Universidad de Osaka observó
secuencias repetidas de 29 nucleótidos altamente conservadas en el
genoma de Escherichia coli. quienes accidentalmente clonaron una
serie inusual de estas secuencias intercaladas con secuencias
espaciadoras mientras analizaban un gen responsable de la conversión
de la fosfatasa alcalina. Sin embargo, debido a la falta de suficientes
datos de secuencias de ADN, la función de estas matrices seguía
siendo un misterio.Se había pensado que estas secuencias eran ADN
basura; sin embargo, tras análisis bioinformáticos se revelo que las
secuencias entre estos repetidos, llamadas espaciadoras, eran
complementarias con secuencias de algunos fagos y virus que atacan a
las bacterias. Esto confirmo que las bacterias poseían algo similar a un
sistema inmune con memoria. Posteriormente, Koonin y Makarova
propusieron que algunos organismos (principalmente las bacterias y
arqueas) integran fragmentos del ADN de los fagos en su propio
genoma y que, al transcribirse, reconocen las del nuevo virus y forman
un complejo de doble cadena que detiene el proceso infectivo. Es así
como fueron llamadas CRISPR, con el silenciamiento génico por ARN
interferente en eucariontes. Tiempo después, en 2007, otro equipo
demostró que Streptococcus thermophilus podía adquirir resistencia a
un fago, ya que al ser expuesto a éste incorporaba un fragmento de la
secuencia del intruso. Una vez asentadas las bases de CRISPR, las
investigaciones se centraron en establecer las moléculas involucradas
en el procesamiento del ARN con la secuencia complementaria (ARNcr)
y la formación del complejo CRISPR/Cas. Así también se descubrió su
actividad endonucleasa y la presencia de dos sitios de corte, además de
la alta especificidad del ARNcr, se comenzó a plantear la posibilidad de
utilizar a CRISPR/Cas como un sistema de edición genómica.
Es así como en 2012 surge una nueva técnica basada en un sistema
que tienen las bacterias para defenderse del ataque de los
bacteriófagos. Está técnica de edición genética conocida como
CRISPR-Cas9, por sus siglas en inglés, que quieren decir Clustered
Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats o Repeticiones
Palindrómicas Cortas Agrupadas Regularmente utiliza a la enzima Cas9
para introducir cortes de doble cadena en la hebra del DNA;activando el
sistema de reparación endógeno de la célula. Algo a resaltar de este
sistema es que la enzima Cas9 puede ser dirigida al sitio de corte por un
RNA guía (RNAg), el cual se diseña en base a la secuencia del gen que
se desee modificar.
¿Qué es CRISPR?
CRISPR utiliza unas guías y una proteína (Cas9) para dirigirse a zonas
elegidas del ADN y cortarlas. A partir de ahí, se pueden pegar los
extremos cortados e inactivar el gen, o introducir moldes de ADN, lo que
permite editar sus ‘letras’ a voluntad del que las utiliza.
EQUIPO DE UTILIDAD
Nucleofector
4D-Nucleofector™(Lonza)
Esta es una tecnología basada en crear pequeños agujeros en la
membrana celular mediante la aplicación de un pulso eléctrico. La forma
más integral en la que se desarrollan los programas Nucleofector™
específicos del tipo de célula y las soluciones permite la entrega de
sustratos de ácido nucleico no solo en el citoplasma, sino también a
través de la membrana nuclear y en el núcleo. Esto permite una alta
eficiencia de conversión de hasta el 99 % y hace que el éxito de la
transfección sea independiente de cualquier proliferación celular.
Características a resaltar:
LIMPIEZA
PARA SU MANTENIMIENTO
No se requiere mucho para garantizar un funcionamiento fiable del
instrumento Nucleofector ha sido diseñado para su uso en una campana
de extracción estéril con o sin una fuente de radiación UV. La exposición
prolongada del exterior de la carcasa a la luz ultravioleta causará
decoloración sin afectar la funcionalidad del dispositivo Nucleofector.
Cuando los flujos laminares regulares se desinfectan en el sustrato
mediante la radiación UV durante la noche, el dispositivo debe
protegerse con protectores adecuados o retirarse durante períodos
prolongados de exposición a los rayos UV.
El dispositivo Nucleofector está protegido por dos fusibles principales,
ambos ubicados dentro del enchufe integrado en la toma eléctrica
interna. En caso de que se funda el fusible, puede reemplazarlo
fácilmente. Desconecte el dispositivo Nucleofector de la fuente de
alimentación e inserte un destornillador plano pequeño en la ranura del
lado derecho del receptáculo para abrirlo. La parte superior e inferior del
receptáculo deben tener fusibles activos en sus ubicaciones internas
para que funcionen. El fusible fundido generalmente se puede identificar
al observar el cable dentro del tubo de vidrio. Use sólo fusibles T630mA
o L250V para reemplazar los fusibles.
EN CASO DE ACCIDENTE
Generalmente los equios no presentan ningún riesgo de accidente. Pero
si existe peligro de sobrecalentamiento:
Entonces sera necesrio
1. Avisar al personal que pueda estar presente en el laboratorio y
evacuar inmediatamente este en caso de peligro de incendio.
2. Notifique al encargado del mantenimiento del equipo, ya que será
responsable del mal funcionamiento o falla actual del dispositivo.
En caso de descarga eléctrica (muy improbable ya que está protegido
de que suceda)
BENEFICIOS DE LA NUCLEOFECCIÓN
● Alta eficiencia de conversión hasta 90% para ADN plasmídico y
99% para oligonucleótidos (tipo de siRNA).
● Excelente conservación del estado fisiológico y viabilidad de las
células transfectadas
● Análisis de los resultados del transgén a las pocas horas de la
transferencia del gen.
● Tecnología fácil de usar, con más de 650 protocolos específicos
de células que se han probado con éxito anteriormente.
Escalabilidad flexible de diferentes módulos y plataformas
NucleofectorTM, incluidas opciones de transporte de bajo, medio y
alto rendimiento y fácil cambio entre estos dispositivos.
● Transforma una amplia gama de sustratos, incluidos: ADN, ARNm,
miARN, siARN, péptido o proteína.
● Indicado para una variedad de aplicaciones, como la eliminación
de genes terapéuticos RNAi o CRISPR y la inducción de células
madre pluripotentes inducidas o CART, entre otras. La tecnología
NucleofectorTM se utiliza actualmente en muchas áreas de
investigación, incluida la genómica funcional y estructural, el
descubrimiento de fármacos y la terapia celular y génica
● La administración de células difíciles de transmitir, incluidas:
células primarias, células madre, organoides, neuronas, células o
células de adhesión .
● Minimice el riesgo de contaminación cruzada mediante el manejo
de cubetas (NucleocuvetteTM), estériles y desechables.
● Excelente soporte técnico y de aplicaciones de un equipo
científico altamente calificado y experimentado.
● Escalabilidad flexible de diferentes módulos y plataformas
NucleofectorTM, incluidas opciones de transmisión de bajo, medio
y alto rendimiento y fácil cambio entre estos dispositivos.
TÉCNICA CRISPR-CAS9
Busca cambiar o editar partes del código genético de una célula. esta
técnica utiliza una molécula de ARN con una secuencia especial para
guiar a la enzima cas9 hacia una secuencia deseada del ADN para
después cortar la líneas de ADN en esa área y quitarlas para después
colocar nuevo y diferente ADN.
Estructura
Consta de dos elementos: un ARN de la secuencia CRISPR,
denominado "crRNA", y la endonucleasa Cas. La secuencia CRISPR
consta de la secuencia líder o secuencia promotora y varias secuencias
espaciadoras (25 a 50 nucleótidos) rodeadas de elementos repetidos,
generalmente palindrómicos (aproximadamente 32 nucleótidos). El
crRNA es responsable de dirigir Cas a su secuencia complementaria,
donde Cas corta la secuencia patógena. tenemos la secuencia conocida
como adyacente al proto espaciador PAM que incorpora nucleótidos
adyacentes al PAM como elemento espaciador junto al promotor en
CRISPR, creando así una memoria inmunológica
Un ejemplo en laboratorio:
Edición de células humanas mediante la técnica de edición crisper
cas
1. Para comenzar es necesario pasar la proteínas cas 9 por un
proceso de purificación y de esta manera obtener una proteína
limpia de impurezas. un ejemplo de purificacion de proteinas es la
cromatografía la cual busca la separación para la caracterización
de mezclas complejas cuyo objetivo es separar diferentes
componentes, esto es aplicable en todas las ciencias; Según el
principio de retención selectiva, su objetivo es separar los
diferentes componentes de la mezcla, permitiendo la identificación
y cuantificación de dichos componentes.
2. La proteína será almacenada en el congelador para el
experimento de edición de genes.
3. Se obtendrán cultivos de células humanas a partir del
almacenamiento en nitrógeno líquido el cual alcanza hasta los
-200° C.
4. se levantara las células en placas para electroporar las con cargas
eléctricas y así de esta manera acceder dentro de de la célula y
acceder al núcleo para su edición
5. después se preparan los medios de cultivo los cultivos celulares
para calentarlos a 37° grados
6. las células serán suspendidas en medios para después ser
incubadas y promover el crecimiento
Procedimiento:
1. Se busca un donante sano seropositivo
2. Se recolecta PBMC
3. Generación de VST específicos de multivirus
4. Expansión de VST específicos de multivirus (NR3C1 CRISPR KO
a gran escala de VST específicos de multivirus)
5. Uso de nucleofactor 4D
6. Expansión de NR3C1 KO de VST específicos
7. Congelación y generación de biobanco de VST específicos de
multivirus NR3C1 KO
8. Descongelación e infusión a paciente inmunosuprimido con
infección viral
DISCUSIÓN
Específicamente el sistema CRISPR Cas9 , tipo II, utilizando la proteína
cas9 como su componente principal. Por su facilidad de acceso, bajo
coste económico y técnico, ha supuesto una revolución casi sin
precedentes en la edición del genoma. Como se explicó anteriormente,
el mecanismo de acción de CRISPR Cas9 en bacterias crea una
especie de "catálogo" de ADN viral después de su primer encuentro
con, generando así secuencias almacenadas, que se denomina ARN
guía, reconoce el ADN invasor. Es en esta etapa que las proteínas
Cas9, funcionan cortándolas y eliminándolas. Por lo tanto, es un sistema
inmunológico adaptativo. El estudio detallado de este mecanismo ha
planteado la posibilidad de que lo use en otros sistemas celulares para
guiar específicamente a la nucleasa Cas9 a otras secuencias. Dado que
la secuencia objetivo escindida por Cas9 está determinada por la
secuencia de ARN guía, es suficiente sintetizar una nueva molécula del
ARN guía para redirigir la nucleasa Cas9 a cualquier secuencia. Esto
convierte al sistema CRISPRCas9 en una técnica de edición del
genoma extremadamente accesible para toda la comunidad científica.
CONCLUSIÓN
BIBLIOGRAFÍAS
Piñon, M. P. (2017). Descripción del sistema CRISPR-Cas y diseño de sgRNAs.