HUMANA

CA
BIO UÍMI

- F
QB II
MED -
Q

CÁTEDRA 1
UB
.

A - DPTO

SEMINARIO
ENZIMAS 1
INTRODUCCIÓN
CINÉTICA ENZIMÁTICA
PARÁMETROS CINÉTICOS

MATERIA: QUÍMICA BIOLÓGICA II

CÁTEDRA 1
DPTO. BIOQUÍMICA HUMANA
FMED - UBA
 DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA HUMANA
CÁTEDRA 1 - QUÍMICA BIOLÓGICA - CICLO LECTIVO 2024

SEMINARIO
ENZIMAS 1

INTRODUCCIÓN
Las funciones vitales de una célula implican la existencia de un gran número de procesos y
vías metabólicas que consisten en secuencias de reacciones químicas que se llevan a cabo en
presencia de catalizadores biológicos denominados enzimas. Si estas reacciones ocurrieran en
ausencia de estos catalizadores serían tan lentas que no podrían responder a las necesidades
fisiológicas de las células.
Una función tan compleja y específica como la de las enzimas sólo puede ser cumplida por
moléculas estructuralmente complejas y que son susceptibles a la acción de factores que modifican
su actividad.
La mayoría de las enzimas son proteínas con propiedades catalíticas, cuya función, además
de poder ser regulada, presenta un alto grado de especificidad. Como todo catalizador, las enzimas
aumentan notablemente la velocidad (¿cómo se define?) de las reacciones químicas y cumplen con
las siguientes condiciones:
● Son efectivas en cantidades pequeñas.
● No sufren modificaciones cualitativas ni cuantitativas al final de la reacción. Es decir, deben
quedar químicamente inalteradas.
● No afectan la posición del equilibrio de la reacción que catalizan. Es decir, en presencia
del catalizador se llega mucho más rápidamente al equilibrio, pero el mismo es igual al que se
llegaría en ausencia del catalizador.
Además de cumplir estas condiciones propias de todos los catalizadores, las enzimas
presentan una serie de características, derivadas de su naturaleza proteica, que las diferencia
netamente de los catalizadores inorgánicos:
● Son termolábiles.
● Presentan una mayor eficiencia, entendiendo por eficiencia al número de moles de sustrato
transformado por mol de catalizador, en la unidad de tiempo.
● Son altamente específicas en relación con la naturaleza de la reacción que catalizan y al
sustrato que utilizan.
● Están sujetas a una gran variedad de controles celulares.

En el siguiente gráfico se muestra la formación de producto en función del tiempo para una
reacción catalizada por una enzima o en ausencia de enzima. La cantidad de producto formado al
final de la reacción es el mismo en ambos casos, pero el tiempo que tarda en completarse la
transformación puede ser de segundos en el caso de la reacción catalizada por la enzima o de
horas, días o años en ausencia de enzima.

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Con el tiempo, en ambos casos se llega al equilibrio. El sustrato se convierte en producto y

este en sustrato a una velocidad tal que su concentración permanece constante. Por lo tanto, las
enzimas no afectan el equilibrio de una reacción, el cual solo depende de la diferencia de energía
libre entre sustratos y productos. Para que ocurra una reacción química en un sentido determinado
la variación de energía libre (ΔG) en ese sentido debe ser negativa. Pero además la reacción debe
ocurrir a una velocidad adecuada. Un valor negativo de ΔG no implica necesariamente que la
reacción ocurra en ese sentido a una velocidad significativa.
Las enzimas aumentan la velocidad con que se llega al equilibrio. ¿Cómo lo hacen? Para
contestar esa pregunta tenemos que examinar no sólo los estados energéticos inicial y final de la
reacción sino el camino mediante el cual los sustratos se convierten en productos.
En la conversión de un sustrato S a un producto P se alcanza un Estado de Transición (o
estado activado), una estructura molecular transitoria que ya no es sustrato, pero aún no es
producto. Este estado es altamente inestable y es el que tiene mayor energía libre. La diferencia
entre la energía libre del estado de transición y la del sustrato se denomina Energía de Activación.
Esta energía que debe adquirir el sistema, se libera cuando a partir del estado de transición se
forma el producto. Por lo tanto, cuando se calcula la diferencia de energía libre entre sustratos y
productos no se tiene en cuenta la energía de activación.
¿Cómo hacen las enzimas para acelerar las reacciones? Disminuyen la energía de
activación que deben adquirir las moléculas de sustrato para poder transformarse en producto, es
decir, facilitan la formación del Estado de Transición. La unión del sustrato con la enzima crea un
camino de reacción donde el nivel energético del estado de transición (complejo enzima-sustrato)
es menor que en ausencia de enzima. De esa forma, más moléculas pueden alcanzar la energía
necesaria para llegar al estado de transición.

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Una vez que los productos de la reacción se han formado se desprenden de la enzima, la
cual queda libre para comenzar un nuevo ciclo catalítico.
Otra forma de proveer la energía de activación necesaria al sistema químico es calentándolo,
lo cual aumentaría la energía de las moléculas. Sin embargo, los organismos vivos no pueden
recurrir a cambios en la temperatura para acelerar sus procesos metabólicos ya que estos
normalmente no alcanzan la magnitud necesaria para afectar las velocidades de las reacciones
químicas. Recurren a las enzimas, que actúan como catalizadores para disminuir el valor de la
energía de activación (Ea) correspondiente. Por otra parte, mediante el uso de estos catalizadores
biológicos las células pueden regular las velocidades de las reacciones individuales para lograr una
función concertada de los distintos procesos metabólicos.

Centro activo de las enzimas

Anteriormente se mencionó que una de las características más importante de las enzimas
es su alto grado de especificidad (capacidad de la enzima de seleccionar un
determinado sustrato en un conjunto de moléculas similares). Esa idea de
especificidad está relacionada con la interacción de la enzima con el
sustrato. El mecanismo de catálisis enzimática se relaciona con la estructura
terciaria tridimensional de la proteína que determina la especificidad de la
enzima por el sustrato sobre el que actúa. La unión enzima-sustrato se
produce mediante fuerzas intermoleculares de carácter débil que tienen
lugar en una zona específica de la enzima denominada centro activo. Es
una zona relativamente pequeña y restringida de la enzima que forma un
hueco en su estructura tridimensional donde puede colocarse el sustrato. De esta forma el sustrato
puede interactuar con cadenas laterales de los aminoácidos que recubren ese espacio, tanto para
su unión a la enzima como para el mecanismo catalítico de la reacción.

El centro activo de la enzima es el responsable directo de su acción catalítica y de su

especificidad, aunque el resto de la molécula (constituida por los aminoácidos estructurales) aporta
al mantenimiento de todo el conjunto.
A los grupos de las cadenas laterales de los aminoácidos del
centro activo, responsables de la unión del sustrato a la enzima se los
denomina sitios de unión. En la siguiente figura se muestra un
diagrama de la enzima fructosa-2,6-bisfosfatasa (celeste claro) y la
relación existente entre el sustrato (azul) y los aminoácidos que
conforman el centro activo de la enzima. Los grupos laterales
responsables de la actividad catalítica propiamente dicha reciben el
nombre de sitios catalíticos.

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En algunos casos esos grupos pueden corresponder a los grupos prostéticos, de los cuales
hablaremos más adelante.
Los grupos funcionales que participan del centro activo, quizás pertenecientes a
aminoácidos situados bastante lejos unos de otros en la estructura primaria de la proteína, se
aproximan y adoptan la configuración característica del mismo. Por esa causa aquellos factores que
inducen una pérdida de la estructura terciaria nativa de la enzima (por ejemplo, la desnaturalización
proteica) producen una alteración profunda del centro activo, y conducen a la pérdida de la actividad
enzimática.

Agentes auxiliares o Cofactores

Algunas enzimas para ser activas dependen solamente de su estructura proteica, mientras
que otras requieren además estructuras no proteicas, denominadas cofactores. Los cofactores
pueden ser iones metálicos (por ej. Fe2+, Mg2+, Mn2+ o Zn2+) o bien complejos orgánicos o
metaloorgánicos denominados coenzimas.
El complejo enzima-cofactor catalíticamente activo recibe el nombre de HOLOENZIMA.
Cuando se separa el cofactor, la proteína, que por sí misma es catalíticamente inactiva, se
denomina APOENZIMA. Algunas enzimas requieren una coenzima y uno o más iones metálicos
para su actividad. Un cofactor que esté fuertemente unido a la enzima (o incluso covalentemente
unido) se denomina grupo prostético. Son de difícil disociación y cuando esto ocurre, la enzima
pierde su actividad.

Recordar ● HOLOENZIMA= Apoenzima (proteína) + cofactor

● APOENZIMA: Parte proteica de una holoenzima, no tiene actividad catalítica

Cofactores
- Iones metálicos
La forma en que estos iones actúan en el proceso catalítico es más o menos compleja y no
presentan un mecanismo de acción común a todos ellos.
Cuando las enzimas requieren cationes para actuar, el requerimiento es estricto ya que en
su ausencia la actividad es prácticamente nula. También los aniones (como sulfato, fosfato, cloruro,
etc.) pueden actuar con ciertas enzimas como activadores.

- Coenzimas
Son moléculas orgánicas de estructura más o menos compleja que intervienen en las
reacciones generalmente como transportadores de algún grupo químico. Se unen muy débilmente
a la enzima, por lo tanto, son fácilmente disociables. El proceso de asociación-disociación es
siempre reversible.
Es interesante que muchos grupos prostéticos y coenzimas están estructuralmente

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relacionados con las vitaminas que pueden ser sus precursores y, como el organismo carece de la
capacidad de sintetizarlas, deben ser administradas en la dieta.

COFACTORES ENZIMAS
(iones)

Zn2+ alcohol deshidrogenasa

anhidrasa carbónica

Mg2+ hexoquinasa
glucosa-6-fosfatasa
piruvato quinasa (junto con K+)

Mn2+ arginasa
ribonucleótido reductasa

Fe2+o Fe2+ citocromos

peroxidasa
catalasa

Cu2+ tirosinasa
citocromo oxidasa

Ni2+ ureasa

Se glutation peroxidasa

K+ piruvato quinasa (junto con Mg2+)

Na+ ATPasa (junto con Na+ y Mg2+)

Coenzima o Vitamina de la que ENZIMA

grupo prostético deriva

NAD+ y NADP+ nicotinamida o vitamina B3 deshidrogenasas

FAD y FMN riboflavina o vitamina B2 deshidrogenasas

Piridoxal fosfato vitamina B6 transaminasas

glucógeno fosforilasa

Pirofosfato de tiamina o vitamina B1 -cetoglutarato deshidrogenasa

tiamina piruvato decarboxilasa

Biotina biotina piruvato carboxilasa

acetil-CoA carboxilasa

Ácido ácido fólico actúa como transportador

tetrahidrofólico intermediario de grupos con un átomo de
carbono (formilo, metenilo y metileno)

Coenzima A ácido pantoténico o transferencia de grupos acetilo pirúvico

vitamina B5 decarboxilasa

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Especificidad enzimática
Se mencionó anteriormente que una de las características distintivas que presentan las
enzimas con respecto a los catalizadores inorgánicos es su alto grado de especificidad. Esta es una
propiedad de notable significación biológica, pues hace posible la coexistencia de diversas vías
metabólicas perfectamente diferenciadas. Se entiende por especificidad enzimática a la limitación
de acción de cada enzima hacia un sustrato determinado (o un grupo de sustratos estructuralmente
relacionados) y en relación a una reacción química perfectamente definida. Así, por ejemplo, una
enzima capaz de hidrolizar las uniones glicosídicas presentes en un polisacárido como el almidón,
es incapaz de hidrolizar las uniones peptídicas de una proteína, y viceversa. Más aún, una enzima
como la α-amilasa pancreática, principal responsable de la degradación del almidón y el glucógeno
en el tracto gastrointestinal, actúa hidrolizando las uniones 1-4 glicosídicas de las mencionadas
sustancias liberando unidades del disacárido maltosa, pero es incapaz de hidrolizar la maltosa en
dos moléculas de glucosa a pesar de que la unión también es 1-4 glicosídica. Esa función es
llevada a cabo por otra enzima de origen intestinal, la maltasa.
Si bien todas las enzimas son específicas, el grado de especificidad puede variar de una
enzima a otra. Así, por ejemplo, algunas poseen especificidad absoluta, es decir que sólo pueden
ejercer su acción sobre un sustrato determinado (o un par de sustratos, si la reacción es bimolecular
es decir donde la enzima utiliza dos sustratos).
Como ejemplo podemos mencionar a la ureasa, enzima que desdobla específicamente a la
urea en amoníaco y CO2.
ureasa
NH2-CO-NH2 + H2O CO2+ 2NH3

Otro ejemplo es la enzima succinato deshidrogenasa, que oxida exclusivamente al succinato

para dar fumarato. Esta última es una flavoproteína que contiene FAD covalentemente unido que
actúa específicamente en la reacción como aceptor de hidrógeno.

succinato deshidrogenasa
succinato + enzima-FAD fumarato + enzima-FADH2

En algunos casos de reacciones bimoleculares, la enzima es altamente específica para uno

de los sustratos de la reacción y no para el otro. Por ejemplo, la enzima alcohol deshidrogenasa es
específica para la coenzima NAD+, pero no es tan específica con respecto al otro sustrato, que
puede ser un gran número de alcoholes primarios, secundarios o polialcoholes como el etilenglicol.

alcohol deshidrogenasa
alcohol + NAD+ aldehído (o cetona) + NADH + H+

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Otras enzimas presentan especificidad de reacción. Es decir, son específicas en relación

con el tipo de reacción que catalizan, pero no lo son tanto con respecto al sustrato involucrado. A
este grupo de enzimas pertenecen algunas enzimas hidrolíticas entre las cuales podemos
mencionar como ejemplo a la fosfomonoesterasa alcalina que cataliza específicamente hidrólisis de
ésteres fosfóricos de acuerdo con la reacción general, independientemente del carácter del grupo
R.
fosfomonoesterasa alcalina
R-O-PO32-+ H2O R-OH + PO4H2-

Por último, debemos mencionar aquellas enzimas que actúan con sustratos que pueden
existir en dos formas isoméricas (ya se trate de isómeros ópticos o geométricos). En esos casos la
enzima actúa preferentemente sobre uno de los isómeros y no sobre el otro.
Por ejemplo, existen dos enzimas capaces de desaminar oxidativamente a los aminoácidos
para producir los cetoácidos respectivos (aminoácido oxidasa). Una de ellas actúa específicamente
con los L aminoácidos mientras que la otra lo hace exclusivamente con los D-aminoácidos.

Expresión de las concentraciones enzimáticas

La detección de una enzima en un medio biológico involucra dos aspectos, uno cualitativo
(¿está presente la enzima en este medio?) y otro cuantitativo (¿cuánta enzima hay?). Primero se
debe poner de manifiesto la presencia de la enzima en el medio en estudio para, en caso afirmativo,
determinar la cantidad en que se halle presente. Para la detección de la enzima se utiliza la reacción
que ésta cataliza. Para ello se determina la generación del producto de la reacción cuando se
agrega el medio biológico que contiene la enzima sobre el/los sustratos/s específico/s.
En cuanto al segundo aspecto, es muy difícil determinar la cantidad de una enzima en un
medio biológico (en miligramos o micromoles de enzima) ya que, por lo general, estos medios
contienen una mezcla compleja de proteínas además de la enzima en estudio, que además se
encuentra en muy baja concentración. Por lo tanto, se recurre a la determinación de la actividad
enzimática mediante la medición de la velocidad de la reacción catalizada por la enzima en
condiciones óptimas. Se entiende por velocidad de una reacción química a la cantidad de
producto que se forma a partir de su sustrato en la unidad de tiempo (velocidad = ΔP / Δt). En
condiciones adecuadas de medición, la velocidad de una reacción enzimática es directamente

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proporcional a la cantidad de enzima presente en el medio biológico (al menos en un rango

determinado).

V5

velocidad de reacción
V4

V3

V2

V1

0
0 E1 E2 E3 E4 E5

cantidad de enzima

Variación de la velocidad de la reacción con el tiempo

En la práctica, cuando se quiere medir la velocidad de una reacción se agregan en un tubo
de ensayo la solución que contiene la enzima y la solución que contiene el sustrato, y se incuba la
mezcla a una temperatura adecuada. De esta manera, el sustrato puede unirse a la enzima y formar
el complejo ES que dará luego origen al producto. Así, es posible medir la cantidad de producto que
se va formando en intervalos de tiempo sucesivos.
Si representamos en un gráfico la cantidad de
Producto

P AB
V0 = Pendiente a t0 = a t0 =
[P]

producto [P] formado en función del tiempo (t), vemos que t 0B

inicialmente (a tiempos cortos) la [P] varía en forma lineal

con el tiempo, es decir, se observa una recta. A medida
que avanza la reacción la formación de producto ya no es A

lineal con el tiempo debido a que se va modificando el

sistema de reacción. Por ejemplo, se pueden producir
cambios en el pH, al aumentar la [P] la reacción inversa
(P→S) puede adquirir una velocidad considerable, pueden
0 B t Tiempo
aparecer subproductos, etc.

Por lo tanto, dado que la velocidad de una reacción enzimática puede variar a medida que
avanza la reacción, se utiliza la velocidad inicial.

Es decir, la velocidad de una reacción, que es la PENDIENTE DE LA TANGENTE A LA

CURVA de [P] en función del tiempo, se determina A TIEMPO CERO (t0), y se la denomina
VELOCIDAD INICIAL (V0).

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V0 depende de la cantidad de sustrato y de enzima presentes. Porque …

a) para una dada cantidad de enzima: a mayor número de moléculas de sustrato más
rápidamente se formará el complejo ES y por lo tanto más rápido se formarán moléculas de
producto.
b) para una dada concentración de sustrato: cuantas más moléculas de enzima haya en el
medio, mayor será la cantidad de moléculas de ES formadas y, en consecuencia, mayor será la
formación de producto.
Es posible referirse a la cantidad de una enzima en términos de su actividad, expresada en
unidades enzimáticas. Una unidad enzimática es la cantidad de enzima que cataliza una reacción
con determinada velocidad de reacción en condiciones óptimas. Esa velocidad de reacción se
puede determinar como la cantidad de sustrato que reaccionó en cierto tiempo. Para evitar
ambigüedades en la utilización de unidades, se ha definido por convención una unidad que puede
ser aplicada a todas (o casi todas) las enzimas, y que permite comparar las actividades de enzimas
diferentes.
La definición recomendada es la siguiente: Una unidad internacional (UI) de cualquier
enzima es la cantidad de enzima que cataliza la transformación de un micromol (μmol) de sustrato
por minuto bajo condiciones definidas.
1 UI es la cantidad de enzima que cataliza la
transformación de 1 μmol de sustrato / min

Es decir, que si una muestra de enzima contiene 100 UI significa que contiene una cantidad
de enzima tal que cataliza la transformación de 100 x 1 micromoles de sustrato por minuto.
Existe otra unidad denominada Katal que se define como la cantidad de enzima que cataliza
la transformación de un mol de sustrato en producto en un segundo.
1 Katal es la cantidad de enzima que cataliza la
transformación de 1 mol de sustrato / seg

¿A cuántas UI equivale 1 Katal?

La actividad enzimática también se puede expresar como actividad específica. Ésta se

refiere a la actividad de una enzima por miligramo (mg) de proteína, y se suele expresar como la
cantidad de enzima que cataliza la transformación de 1 μmol de sustrato/ minuto/ mg de proteína o
directamente como el número de UI/mg de proteína. La actividad específica da una idea de la pureza
de la enzima en una muestra. Este parámetro es una medida de la proporción de enzima con
respecto a todas las proteínas de una muestra. Durante la purificación de una enzima, el valor de
la actividad específica va aumentando a medida que se van eliminando otras proteínas
contaminantes.
Actividad específica = UI /mg

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En cuanto a las mencionadas condiciones “óptimas” de medida, debe establecerse la

temperatura a la cual se define la unidad, además del pH del medio de reacción, la concentración
del o de los sustratos y también de los cofactores. Es necesario establecer estrictamente las
condiciones de medida, debido al hecho de que todos los factores mencionados inciden en forma
notable sobre la actividad enzimática tal como se verá a continuación.

Efecto de la temperatura
Cuando se estudia la variación de la actividad de una enzima en función de la temperatura
y los resultados se representan en un sistema de coordenadas cartesianas, se obtienen gráficos
del tipo observado en la figura.

Este tipo de curva es la resultante de dos factores fundamentales. En primer lugar, las
reacciones químicas, catalizadas o no, aumentan su velocidad al aumentar la temperatura. Pero en
el caso particular de las reacciones catalizadas por enzimas ese aumento tiene un límite.
Dada su naturaleza proteica, las enzimas comienzan a desnaturalizarse por encima de cierta
temperatura (que depende de cada enzima), convirtiendo ese proceso de inactivación térmica en
un factor más importante que el del incremento de la energía de los reactantes sobre la velocidad
de la reacción. Por esa razón todas las enzimas exhiben una temperatura, o un rango de
temperaturas, en el cual la velocidad de la reacción catalizada es máxima, a la que se denomina
temperatura óptima. Para las enzimas de animales de sangre caliente la temperatura óptima está
por lo general comprendida entre 25º y 37ºC. Esta temperatura es lo suficientemente alta como para
que exista una actividad enzimática significativa, y lo suficientemente baja como para evitar la
desnaturalización térmica de la mayoría de estas proteínas.

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Efecto del pH
En general, las enzimas son activas sólo en un rango de pH más o menos restringido y, en
la mayoría de los casos, cada enzima presenta un pH óptimo definido, es decir un pH para el cual
la actividad enzimática es máxima. A partir de ese punto, hacia un lado y hacia el otro en la escala
de pH, la actividad disminuye. La curva de actividad enzimática en función del pH adopta, en
general, una forma característica de campana tal como se muestra en los ejemplos de la figura.

Tanto el rango del pH dentro del cual es activa una enzima, como su pH óptimo son
características de cada enzima y se relacionan con las condiciones fisiológicas en las cuales actúa.
Así, por ejemplo, la pepsina, enzima proteolítica del jugo digestivo que actúa en el estómago,
tiene un pH óptimo de 1,5 a 2,5, mientras que la tripsina, enzima también proteolítica, pero de origen
pancreático y que actúa a nivel de la luz intestinal, tiene un pH óptimo de 9 a 11.
Cabe destacar que no todas las enzimas presentan una curva de pH de tipo campana. Por
ejemplo, la amilasa salival es capaz de mantener la actividad en un amplio rango de valores de pH.
Esta adaptación garantiza su funcionamiento independientemente del valor del pH del alimento
ingerido. La colinesterasa, enzima que en el tejido nervioso hidroliza a la acetilcolina, mediador del
impulso nervioso, no presenta la rama descendente de la curva de pH.
La dependencia de la actividad enzimática con el pH puede atribuirse a una serie más o
menos compleja de factores entre los cuales podemos mencionar a los siguientes:
1. Ionización directa de los aminoácidos presentes en el centro activo.
2. Cambios en los sustratos, lo que puede afectar la formación del complejo enzima sustrato.
3. Modificación de los grupos de las cadenas laterales de los aminoácidos de la proteína.
Esto puede traer aparejada una modificación de su estructura espacial de tal manera que facilite o
dificulte su unión con el sustrato.

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Fuerza iónica
La fuerza iónica de una solución es una medida de la concentración de iones en la solución.
Al ser especies cargadas, se producen interacciones electrostáticas entre ellas, las cuales
comprenden las fuerzas de atracción entre iones con cargas opuestas, las fuerzas de repulsión
entre los iones con igual carga y la agitación térmica que producen los iones en sus movimientos
de atracción o en los de repulsión. Tanto la solubilidad como la estabilidad de las enzimas depende
de la fuerza iónica del medio en el que se encuentran. Además, como ya mencionamos
anteriormente, algunos cationes son necesarios en el centro activo de determinadas enzimas para
su normal funcionamiento.

Efecto de la concentración de sustrato sobre la velocidad de una reacción enzimática

Este es uno de los factores más importantes que determinan la velocidad de las reacciones
enzimáticas. En la mayoría de los casos, cuando se representa la velocidad inicial (V0) de una
reacción enzimática en función de la concentración de sustrato [S], manteniendo constantes la
concentración de enzima, el pH, la temperatura y la fuerza iónica, se obtiene una curva hiperbólica
tal como se indica en la siguiente figura.
En dicha curva puede observarse que para valores muy pequeños de concentración del
sustrato [S], la velocidad inicial de la reacción (V0) es directamente proporcional a [S]. Es decir, al
duplicarse o triplicarse la concentración del sustrato se duplica o triplica respectivamente la
velocidad de la reacción.

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Vo Vmáx Velocidad máxima

Velocidad
inicial

Vmáx
2

Km [S] Concentración
de sustrato inicial

Al seguir aumentando [S], la V0 deja de ser directamente proporcional a [S] y el incremento

de V0 se hace cada vez menor hasta que se llega a un valor máximo en el que se mantiene constante
por más que se aumente [S]. Se dice que la enzima está saturada por su sustrato y la velocidad
alcanzada en ese momento se denomina velocidad máxima de la reacción (Vmáx) para esa cantidad
de enzima. La Vmáx sólo puede ser aumentada aumentando la concentración de la enzima.
Basándose en este fenómeno, Michaelis y Menten enunciaron en 1913 una teoría general de la
acción enzimática que fue la base del desarrollo posterior de la cinética enzimática moderna. En
esa teoría se adoptó la sugerencia de Henri de 1902, de que la enzima forma primero un complejo
con su sustrato, el cual se desdobla subsecuentemente en la enzima libre y los productos de la
reacción. Esquemáticamente el mecanismo de la reacción podría representarse en la siguiente
forma:
E + S  E-S → E + P
Donde E, representa a la enzima; S, al sustrato; E-S, al complejo enzima-sustrato; y P, al
producto o los productos.
Mediante un desarrollo matemático, Michaelis y Menten dedujeron una ecuación que
relaciona cuantitativamente la velocidad inicial de la reacción (V0) con la concentración de sustrato
[S] y que concuerda perfectamente con los datos experimentales.
La ecuación, conocida con el nombre de Michaelis-Menten es la siguiente:

𝒗𝒎á𝒙 . [𝑺]
𝒗𝟎 =
𝑲𝒎 + [𝑺]
Donde:
Vmáx es la velocidad máxima a la que ya hemos hecho referencia y que sólo varía con la
concentración de la enzima.
Km es una constante denominada constante de Michaelis, que depende de la reacción (es
independiente de la concentración de enzima). Un ligero análisis de la ecuación de Michaelis-
Menten nos permitirá comprobar cómo la misma se adapta a la curva experimental observada.

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[S] < Km [S] = Km [S] > Km

𝑽𝒎á𝒙 . [𝑺] 𝑽𝒎á𝒙 . 𝑲𝒎 𝑽𝒎á𝒙 𝑽𝟎 = 𝑽𝒎á𝒙

𝑽𝟎 = 𝑽𝟎 = =
𝑲𝒎 𝑲𝒎 + 𝑲𝒎 𝟐

Si analizamos la zona de la curva para la cual la concentración de sustrato [S] es muy

pequeña con respecto al valor de Km, el valor de Km + [S] del denominador se hará aproximadamente
igual a Km. En este caso la V0 será directamente proporcional a [S] y esa parte de la curva será una
recta cuya pendiente será Vmáx/Km.
Para concentraciones de [S] muy grandes con respecto a Km, el denominador Km + [S] será
aproximadamente igual a [S]. Así V0 será igual a la Vmáx. En esas condiciones, toda la enzima
presente estará formando el complejo enzima-sustrato: se dice que el sustrato está en condiciones
saturantes o que la enzima está saturada.
Veamos ahora qué velocidad se obtiene cuando se toma un valor de [S] igual al valor de la
constante Km. Para ello se reemplaza [S] por Km en la ecuación de Michaelis-Menten, resultando en
que V0 = Vmáx/2. Es decir que ahora le podemos asignar a Km un significado experimental inmediato:
es la concentración del sustrato para la cual la velocidad de la reacción es la mitad de la
velocidad máxima. Tiene una importancia fisiológica muy grande ya que cuando una enzima tiene
un valor muy pequeño de Km para un dado sustrato significa que con una concentración muy baja
del sustrato se puede alcanzar la saturación de la enzima (la Vmáx).
Desde otro punto de vista, se considera a Km como una medida indirecta e inversa de la
afinidad de la enzima por el sustrato. Es decir, cuanto menor es el valor de Km mayor será la afinidad
de la enzima por el sustrato y viceversa, a un valor muy grande de Km corresponderá una afinidad
muy pobre de la enzima por el sustrato.
El conocimiento de los valores de Km es muy útil, por ejemplo, en los casos de enzimas que
tienen una especificidad no muy estricta, es decir que pueden actuar sobre más de un sustrato. Nos
permite saber hacia cuál de estos sustratos tendrá mayor afinidad y actuará preferentemente. Por
ejemplo, la hexoquinasa de cerebro, que cataliza la fosforilación de varias hexosas (con ATP como
co-sustrato) para producir sus ésteres 6-fosfato correspondientes, tiene distinta afinidad por cada
una de ellas según se desprende del análisis de los valores de las Km respectivas, indicadas a
continuación:

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Hexosa Km (M)

Glucosa 8 x 10-6

Manosa 5 x 10-6

Fructosa 1,6 x 10-3

Galactosa 1 x 10-1

¿Por cuál de estas hexosas tendrá mayor afinidad la hexoquinasa? Respuesta: Su afinidad
por glucosa y manosa es muchísimo mayor que por fructosa y galactosa. También puede darse el
caso de dos enzimas distintas que catalizan una reacción similar como, por ejemplo, la ya
mencionada hexoquinasa cerebral y la glucoquinasa hepática. Ambas enzimas catalizan la
formación de glucosa-6-fosfato a partir de glucosa.

Mientras que la hexoquinasa tiene un Km hacia la glucosa de 1x10-4 M, el de la glucoquinasa

(hepática) es 1x10-2 M, es decir aproximadamente 100 veces mayor. Si se tiene en cuenta que la
glucemia normal (concentración de glucosa en sangre) está entre 3,8 y 6,1 mM, y considerando que
la concentración de glucosa intracelular refleja los valores sanguíneos, se puede deducir que, en
condiciones normales, la hexoquinasa cerebral (Km= 0,1 mM) estará cerca de estar saturada por su
sustrato y por lo tanto actuando cerca de su velocidad máxima. En cambio, la actividad de la
glucoquinasa hepática (Km= 10 mM) sólo será significativa cuando la glucemia sea mayor que la
normal, como cuando hay una ingesta considerable de glúcidos.
Los casos mencionados ejemplifican además otra característica de las enzimas con
respecto a la Km y es que enzimas similares, pero de distintos órganos pueden diferenciarse en la
afinidad hacia el mismo sustrato como ocurre con las hexoquinasas de cerebro e hígado ya
mencionadas. Esas enzimas que catalizan la misma reacción y pertenecen a la misma especie,
pero se distinguen en algún parámetro cinético o estructural, se denominan isoenzimas.
La determinación de la Vmáx de una enzima puede aportar en la evaluación de su importancia
fisiológica ya que, juntamente con el conocimiento del Km (o de los Km si la reacción involucra más
de un sustrato), nos permitirá determinar cuán eficientemente está funcionando esta enzima en los
tejidos de un organismo vivo.

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Al conjunto de Km y Vmáx de cada enzima se los denomina parámetros cinéticos de dicha

enzima. Establecida su importancia, veamos ahora cómo pueden determinarse fácilmente por un
método gráfico.
Como ya se indicó, los gráficos de V0 en función de [S] para las enzimas que siguen la
cinética de Michaelis-Menten son de tipo hiperbólico, lo que dificulta la determinación de los
parámetros cinéticos. Sin embargo, estos parámetros pueden determinarse si se grafican los datos
en un gráfico de Lineweaver-Burk (o gráfico de dobles inversas), donde se muestra la dependencia
de 1/V0 en función de 1/[S], como veremos a continuación.
Para ello hallemos primero la inversa de la ecuación de Michaelis-Menten.

𝑽𝒎á𝒙 . [𝑺]
𝑽𝟎 =
𝑲𝒎 + [𝑺]

𝟏 𝑲𝒎 + [𝑺] 𝑲𝒎 [𝑺]
= = =
𝑽𝟎 𝑽𝒎á𝒙 . [𝑺] 𝑽𝒎á𝒙 . [𝑺] 𝑽𝒎á𝒙 . [𝑺]

𝟏 𝑲𝒎 𝟏 𝟏
= . +
𝑽𝟎 𝑽𝒎á𝒙 [𝑺] 𝑽𝒎á𝒙

Esta ecuación, o ecuación de Lineweaver-Burk, corresponde a la ecuación de una recta

del tipo y = a x + b, en la cual
y = 1 / V0 (eje de las ordenadas)
x = 1 / [S] (eje de las abscisas)
a = Km / Vmáx (pendiente de la recta)
b = 1 / Vmáx (ordenada al origen)
Conociendo los valores de V0 para distintas concentraciones de sustrato y representando
gráficamente 1/V0 en función de 1/[S], se obtendrá una recta tal como se indica en la siguiente
figura.

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Es fácil demostrar que la intersección de la recta con el eje de las ordenadas será igual a
1/Vmáx y que la intersección de la recta con el eje de las abscisas corresponderá a (-1/Km), por lo
tanto, una vez trazada la recta podremos obtener directamente del gráfico los valores que nos
permitirán calcular Km y Vmáx.
Cuando se trata de reacciones enzimáticas con dos o más sustratos es necesario determinar
los Km para cada uno de ellos. Para esto se agregan los otros sustratos en exceso (concentraciones
saturantes) y se varía tan sólo la concentración de aquel cuya Km se quiere determinar.

Tener en cuenta que:

- En la práctica, la determinación de los parámetros cinéticos (Km y Vmáx) a partir de la curva
de saturación de sustrato (curva de Michaelis-Menten o de V0 en función de [S]) no es muy precisa,
debido a que la aproximación a Vmáx es asintótica. En cambio, a partir del gráfico de Lineweaver
Burk (curva de dobles recíprocos o de 1/V0 en función de 1/[S]), al ser una recta, se pueden obtener
valores precisos de Km y Vmáx a partir de pocos puntos experimentales.
- Para obtener los valores de Km y Vmáx para una determinada cantidad de enzima se debe
determinar la V0 para diferentes concentraciones de sustrato [S]. Para esto en un tubo de ensayo
se mezclan el medio con la enzima y la solución que contiene el sustrato, y se incuba la mezcla a
una temperatura adecuada. Se va midiendo la cantidad de producto formado a diferentes tiempos
y se grafica [P] en función del tiempo. Se repite este procedimiento en diferentes tubos, donde lo
único que se variará es la [S] inicial. Se grafican los resultados y se calculan las V0 para cada [S].

[S]1 < [S]2 < [S]3 < [S]4

[P]
V0 4
V0 3

V0 2
V0 1

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Con estos datos experimentales puede realizarse directamente la gráfica de Michaelis

Menten, para aproximar un valor de la Vmáx, calcular la Vmáx/2 y extrapolar en las abscisas para
obtener Km.
V0
Vmáx
V0 4 [S] V0
[S]1 V0 1
Vmáx V0 3
2 [S]2 V0 2
V0 2
[S]3 V0 3
V0 1 [S]4 V0 4

[S]1 [S]2 [S]3 [S]4 [S]

Km

Si se desean determinar de manera precisa los parámetros cinéticos, se deben calcular las
inversas de V0 y [S] y hacer el gráfico de Lineweaver-Burk. Donde la recta corta al eje de las
ordenadas 1/V0 será igual a 1/Vmáx y la intersección con el eje de abscisas será (1/[S] = - 1/Km). A
partir de estos datos se calcularán Km y Vmáx.

1/V0
1/[S] 1/V0
1/V0 1
1/[S]1 1/V0 1
1/V0 2
1/[S]2 1/V0 2
1/Vmáx 1/V0 3 1/[S]3 1/V0 3
1/V0 4
1/[S]4 1/V0 4

-1/Km 1/[S]4 1/[S]3 1/[S]2 1/[S]1 1/[S]

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Curiosidades
MAUDE LEONORA MENTEN
Maud Menten nació en Port Lambton, Ontario, Canadá, el 20 de marzo
de 1879. Se graduó en la universidad de Toronto en 1913 siendo una de las
primeras mujeres canadienses doctoradas en medicina. Dos años más tarde,
ella y Leonor Michaelis publicaron un artículo que describe la relación entre el
índice de una reacción enzimática y la concentración del sustrato de la enzima.
La ecuación de Michaelis-Menten dio a los científicos una forma de analizar
matemáticamente sus observaciones y descripciones de reacciones enzimáticas. Menten realizó
una carrera brillante como patóloga en la Universidad de Pittsburgh a partir de 1918, publicando
extensamente en temas médicos y bioquímicos. Sus muchos logros incluyeron descubrimientos
importantes referentes al azúcar de la sangre, la hemoglobina y a las funciones del riñón. Publicó
en 1944 un método que podría ser el primer uso de la electroforesis en la separación de las
proteínas. Entre 1951 y 1954 condujo investigaciones en cáncer en la Columbia Británica. Maud
Menten fue una mujer con una diversidad de intereses, como idiomas, música y bellas artes. Realizó
exposiciones de pintura con otros artistas de Pittsburgh. Volvió a Ontario seis años antes de su
muerte, que ocurrió el 20 de julio de 1960 en Leamington.

LEONOR MICHAELIS
Fue un bioquímico y médico famoso nacido en Alemania el 16 de
enero de 1875. Estudió Medicina en Friburgo de Brisgovia, donde se graduó
en 1897. Luego se mudó a Berlín, donde recibió su doctorado. Michaelis
trabajó como asistente de Paul Ehrlich (1898-1899), Moritz Litten (1899-
1902) y Ernst Viktor von Leyden (1902-1906). Desde 1906 fue director del
laboratorio de bacteriología en el Hospital de la Charité en Berlín,
convirtiéndose en profesor extraordinario en la Universidad de Berlín en
1908. En 1922 se trasladó a la Facultad de Medicina de la Universidad de Nagoya (Japón) como
profesor de bioquímica, en 1926 a la Universidad Johns Hopkins en Baltimore, Maryland como
profesor residente en Investigación Médica, y en 1929, al Instituto Rockefeller de Investigación
Médica de Nueva York. Se retiró en 1941. Además de su papel en la formulación de la ecuación
Michaelis-Menten (1913) formuló la tinción vital de la mitocondria con verde Jano y el cuerpo de
Michaelis-Gutmann en infecciones del tracto urinario (1902), y encontró que el ácido tioglicólico
podía disolver la queratina. Murió el 8 de octubre de 1849 en Nueva York.

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