República Bolivariana de Venezuela

REPÚBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA
UNIVERSIDAD NACIONAL EXPERIMENTAL “SIMÓN RODRÍGUEZ”

NÚCLEO CANOABO “DR FELIX ADAM”
INGENIERÍA EN ALIMENTOS
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA POR EL MÉTODO DE BIURET
CANOABO, OCTUBRE 2024

OBJETIVO
 Determinar fotoquímicamente la concentración de proteína de una solución
problema usando una curva patrón
INTRODUCCIÓN
La espectrofotometría permite averiguar la concentración de una sustancia
conocida por medición de la intensidad de luz (longitud de onda determinada) que es
capaz de absorber.
La espectrofotometría es una de las técnicas experimentales más utilizadas

para la detección específica de moléculas. Se caracteriza por su precisión,
sensibilidad y aplicabilidad a moléculas de distinta naturaleza (contaminantes,
biomoléculas, etc.) y estado de agregación (Sólido, líquido, gas). Los fundamentos
fisicoquímicos de la espectrofotometría son relativamente sencillos.
Las moléculas pueden absorber energía luminosa y almacenarla en forma de

energía interna. Esto permite que se inicien ciclos vitales de muchos organismos,
entre ellos el de la fotosíntesis en plantas y bacterias. La mecánica cuántica nos dice
que la luz está compuesta de fotones cada uno de los cuales tiene una energía E= h.v=
h.cvλ donde c es la velocidad de la luz y v es la frecuencia, λ su longitud de onda y
h= 6.6 10 (-34) J.s es la constante de Planck. Cuando decimos que una sustancia
química absorbe liz de longitud de onda λ, esto significa que las moléculas de esa
sustancia absorben fotones de esa longitud de onda.
El fundamento de la espectroscopia se debe a la capacidad de las moléculas

para absorber radiaciones, entre ellas las radiaciones dentro del espectro UV/visible.
Las longitudes de onda de las radiaciones que una molécula puede absorber y la
eficiencia con la que se absorben depende de la estructura atómica y de las
condiciones del medio (Ph, temperatura, fuerza iónica, constante dieléctrica), por lo
que dicha técnica constituye un valioso instrumento para la determinación y
caracterización de biomoléculas. Las moléculas pueden absorber energía luminosa y
almacenarla como energía eléctrica y se origina un salto de desde un estado
energético o fundamental. Como consecuencia la absorción constituye una serie de
identidad de la misma. Por último, la molécula en forma excitada libera la energía
absorbida hasta el estado energético fundamental.
El color formado responde a la ley de Lambert y Beer, es decir, que, a mayor

concentración de proteínas, más coloreada se torna la solución y, por lo tanto, la
absorbancia será mayor. Esto hace posible la cuantificación de las proteínas presentes
en una muestra desconocida, relacionando la absorbancia de la muestra con de
estándares de proteínas (soluciones con concentraciones conocidas) graficados en una
curva patrón de proteína. Este método detecta proteínas en un rango de 0,5 a 10
mg/Ml, lo que es suficiente para medir los valores de proteínas en algunos fluidos
biológicos como el suero y el plasma, ambos con concentraciones mayores a 6%.
MATERIALES
- 8 tubos de ensayo
- 3 pipetas de 1 ml
- 3 pipetas de 5 ml
- 2 pinzas para tubo de ensayo
- Ligas
REACTIVOS
- Solución patrón de proteína (8 mg de albumina)
- Solución NaCl al 0.9% (p/v)
- Reactivo Biuret
- Solución problema
APARATOS
- Espectrofotómetro (Longitud de onda 540-545 nm)
PROCEDIMIENTO
- Encienda el espectrofotómetro y ajuste la longitud de onda del

espectrofotómetro a 540 nm.
- Se colocan en una gradilla 8 tubos de ensayo que deben de estar limpios y
secos
- Rotular del 1 al 8
- Con las micropipetas adecuadas al volumen a medir, se adiciona a cada uno
de ellos los volúmenes de la disolución patrón de albúmina de suero bovino y
de agua destilada que se indican en la siguiente tabla
Tubo Albúmina patrón Agua (ml) Problema (ml)

(ml)
1 0 2.0
2 0.1 1.9
3 0.2 1.8
4 0.3 1.7
5 0.4 1.6
6 0.5 1.5
7 0.6 1.4
8 2.0
- A cada uno de los tubos de ensayo se añaden 2 ml de reactivo de Biuret, se

tapa con papel parafilm y se invierte dos o tres veces para mezclar.
- Se toma la gradilla con los tubos de ensayo y se introduce en el baño de agua

termostatizado a 37°C , dejándose que se desarrolle el color durante 15
minutos.
- Se enfrían los tubos de ensayo, introduciendo la gradilla en el agua a
temperatura ambiente.
- Se secan y se procede a medir en el espectrofotómetro siguiendo las normas

expresadas anteriormente.
- Se ajusta a cero de absorbancia con la solución blanco exenta de proteína

(Tubo 1)
- Se miden las absorbancias de los tubos del 1 al 8
- Se anotan las medidas de absorbancia en el cuaderno de laboratorio
- Una vez realizadas las medidas, se limpian cada uno de los tubos de ensayo
con escobilla y jabón.
- Se calcula la concentración de proteína que se ha colocado en cada uno de los

tubos de ensayo.
Como ejemplo: en el ensayo de biuret, en el tubo 3 se han colocado 0,2 ml de

solución patrón de albúmina 10mg/ml y se diluyen a un volumen de 2 ml con agua.
Por tanto, la concentración de proteína en el tubo 3 será:
(0,2 Ml * 10 mg/ml)= 2 ml= 1 mg/ml
- En papel milimetrado se representan los valores experimentales de

absorbancia obtenidos frente a la concentración de proteína estándar calculada
obtenida frente a la concentración de proteína estándar calculada de cada uno
de los tubos para cada método ensayado.
- Se ajustan los puntos obtenidos por el método de mínimos cuadrados a una
recta, incluyendo el punto 0,0
- Se representan las rectas ajustadas en el papel milimetrado
Si la absorbancia de la muestra está dentro del rango de medida del método
seleccionado, mediante la ecuación de la recta de calibrado se puede calcular la
concentración de proteína de la disolución problema.

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CANOABO, OCTUBRE 2024

La espectrofotometría es una de las técnicas experimentales más utilizadas

Las moléculas pueden absorber energía luminosa y almacenarla en forma de

El fundamento de la espectroscopia se debe a la capacidad de las moléculas

El color formado responde a la ley de Lambert y Beer, es decir, que, a mayor

- Encienda el espectrofotómetro y ajuste la longitud de onda del

Tubo Albúmina patrón Agua (ml) Problema (ml)

- A cada uno de los tubos de ensayo se añaden 2 ml de reactivo de Biuret, se

- Se toma la gradilla con los tubos de ensayo y se introduce en el baño de agua

- Se secan y se procede a medir en el espectrofotómetro siguiendo las normas

- Se ajusta a cero de absorbancia con la solución blanco exenta de proteína

- Se miden las absorbancias de los tubos del 1 al 8

- Se anotan las medidas de absorbancia en el cuaderno de laboratorio

- Se calcula la concentración de proteína que se ha colocado en cada uno de los

Como ejemplo: en el ensayo de biuret, en el tubo 3 se han colocado 0,2 ml de

(0,2 Ml * 10 mg/ml)= 2 ml= 1 mg/ml

- En papel milimetrado se representan los valores experimentales de

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