Mecanismos de Defensa Antiviral y Bacteriófagos

Instituto de Estudio Superiores
del Estado de Chiapas

Licenciatura en Químico Farmacéutico Biólogo
MECANISMOS DE DEFENSA
ANTIVIRAL
M. en C. Jonathan Rodríguez Santiago
MECANISMOS DE DEFENSA ANTIVIRAL
Todas las superficies del cuerpo de los mamíferos, donde pueden ingresar los patógenos
están protegidas por capas defensivas proporcionadas por el pelaje, la piel y el moco, o
están protegidas por ambientes ácidos.
Una vez que se cruzan estas barreras y las células se infectan, se activan las defensas
celulares intrínsecas, incluidas las respuestas autónomas de las células, como la
producción de interferón, la autofagia o la apoptosis.
Debido a que el virus puede reproducirse más rápido de lo que una célula infectada
puede controlarlo, también se induce la respuesta inmune "profesional", comenzando
con la respuesta innata temprana.
Finalmente, las células específicas de virus de la respuesta adaptativa llegan al sitio de la

infección, atacando las células infectadas y las partículas de virus extracelulares para su
destrucción o eliminación.
Inmunidad innata
El sistema inmune innato reconoce estructuras moleculares producidas por

microorganismos patógenos.
Frecuentemente los componentes microbianos que estimulan la inmunidad

innata son compartidos por distintos microorganismos y se denominan patrones
moleculares asociados a patógenos (PAMPs)
El sistema inmune innato también reconoce moléculas endógenas que producen

o liberan células dañadas o que «están muriendo», estas moléculas se
denominan patrones moleculares asociados a daño (DAMPs)
El sistema inmune innato usa receptores celulares y moléculas solubles que

reconocen PAMPs y DAMPS
MECANISMOS DE DEFENSA ANTIVIRAL. Inmunidad innata
Los receptores celulares para reconocimiento de patrones (PAMPs y DAMPs) se expresan en
la superficie celular, en vesículas fagocíticas o en el
citosol de varios tipos celulares, entre ellas:
macrófagos, neutrófilos, células dendríticas, células
epiteliales, etc.
Inmunidad innata
Cuando los receptores de reconocimiento

de patrones se unen a PAMPs y DAMPs,
activan la transducción de señales que
promueven las funciones antimicrobianas y
proinflamatorias
Los principales receptores de

reconocimiento de patrones asociados a
infecciones virales son los receptores tipo
RIG (RLR) RIG-5 y MDA5 y los receptores
tipo Toll (TLR) 3, 7, 8 y 9
Inmunidad innata
Los principales mecanismos de la inmunidad innata contra los virus son la inhibición
de la infección por los interferones del tipo I y la muerte de las células infectadas
por los linfocitos NK
Los interferones de tipo I (IFN I) son una gran familia de citosinas con una estructura
que median la respuesta inmunitaria innata temprana en las infecciones virales
Los IFN I más importantes contra virus son IFN-α e IFN-β.
El IFN-α es producido principalmente por células dendríticas, monocitos y

macrófagos, mientras el IFN-β es producido por muchos tipos celulares
Los estímulos más potentes para la producción de IFN I son los ácidos nucleicos
virales
MECANISMOS DE DEFENSA
ANTIVIRAL
Inmunidad innata
Inmunidad innata
EL ESTADO ANTIVIRAL
Los interferones de tipo I inducen señales (através de receptores para IFN I) que
activan la transcripción de varios genes que confieren a las células resistencia frente a
infecciones vírales, a esto se le llama estado antiviral.
Las funciones de las proteínas codificadas por los genes inducidos por el interferón de
tipo I son:
 Bloquear la transcripción y traducción viral

 Degradar el RNA viral
La acción antiviral del IFN I es principalmente parácrina y autócrina

Inmunidad innata
Además….
 Los IFN I provocan secuestro de linfocitos en los ganglios linfáticos, lo que

maximiza sus oportunidades de encontrarse con antígenos
 Los IFN I aumentan la citotoxicidad de los NK y CTL CD8+
 Los IFN I promueven la diferenciación de linfocitos T vírgenes al subgrupo Th1

(linfocitos T helper activadores de macrófagos)
 Los IFN I aumentan la expresión de moléculas de clase I del MHC para

aumentar la probabilidad de reconocimiento de células infectadas por CTL
CD8+
MECANISMOS DE
DEFENSA ANTIVIRAL
Inmunidad innata
Los linfocitos NK matan otras células
infectadas por diversos virus y son un
mecanismo importante de inmunidad
contra los virus al principio de la
infección (antes de las respuestas
adaptativas)
La expresión de moléculas de clase I

del MHC se suspende a menudo en
las células infectadas por virus, como
un mecanismo de escape de los CTL
Sin embargo, esto posibilita que los

linfocitos NK maten a las células
infectadas, ya que la ausencia de clase
I libera a los linfocitos NK de un
estado normal de inhibición
Inmunidad adaptativa
La inmunidad adaptativa vs. infecciones
virales está mediada por
• Anticuerpos que bloquean la unión y

entrada viral
• CTL que eliminan la infección matando

a las células infectadas
Los anticuerpos son eficaces contra los
virus solo durante el estadio
extracelular:
• Antes de que infecten a las células

• Cuando se liberen de las células
infectadas
Los anticuerpos antivirales se unen a

antígenos de la envoltura o cápside y
funcionan como neutralizantes.
Los anticuerpos IgA secretados son importantes para neutralizar los virus
dentro de las vías respiratoria e intestinal
La vacunación oral contra el virus de la poliomielitis actúa induciendo una

inmunidad de mucosas.
La activación del complemento también puede intervenir en la inmunidad

antiviral promoviendo la fagocitosis
La resistencia frente a un virus particular, inducida por infección o vacunación,

es a menudo específica para un tipo serológico viral
La exposición a un tipo serológico de virus de la gripe no confiere resistencia

frente a otros serotipos del virus
Los anticuerpos neutralizantes bloquean la infección viral de la célula y la

propagación de una célula a otra pero, una vez que el virus entra en las células
y comienza a replicarse en su interior, es inaccesible a los anticuerpos
Por lo tanto la inmunidad humoral (por infección previa o vacunación) es capaz

de proteger a los hospederos, pero no puede erradicar por sí misma la
infección ya establecida
La eliminación de virus
intracelulares está mediada por
CTL, que matan a las células
infectadas
La principal función de los CTL

es vigilar contra infecciones
virales
La mayoría de los CTL específicos contra virus reconocen péptidos citosólicos,
habitualmente sintetizados dentro de la célula, presentados por moléculas de
MHC I
Las células tisulares infectadas por virus pueden ser fagocitadas por células dendríticas que
procesa los antígenos virales y los presenta a CTL (presentación cruzada)
Los CTL proliferan de forma masiva durante la infección viral
Los CTL efectores pueden matar a cualquier célula nucleada infectada

Los efectos antivirales de los CTL se deben a la muerte de las células infectadas
Las células infectadas pueden producir algunas proteínas víricas que son invariantes, de
manera que la defensa mediada por CTL continúa siendo eficaz contra virus que son
capaces de alterar sus antígenos de superficie
Evasión (modulación) inmunitaria
• Mutación
• Deriva antigénica
• El VIH es capaz de sufrir una

tremenda variación antigénica
debido a una elevada
frecuencia de errores en la
retrotranscripción
Algunos virus inhiben la presentación de antígenos proteínicos citosólicos
asociados a la MHC I
Algunos virus producen moléculas que inhiben la respuesta inmunitaria
Los poxvirus codifican moléculas que serán secretadas por las células infectadas
que se unen a varias citosinas.
Estas moléculas actúan como antagonistas de las citosinas
La identificación de estas moléculas plantea la interesante posibilidad de que los

virus hayan adquirido genes que codifican inhibidores endógenos de las
respuestas inmunitarias durante su paso a través de los anfitriones humanos y
hayan así evolucionado hasta infectar y colonizar a los humanos.
Algunas infecciones virales
crónicas se asocian al fracaso de
las respuestas de los CTL
Transmisión de señales mediante

receptores inhibidores de linfocitos
T, que normalmente funcionan
para mantener la tolerancia del
linfocito T a antígenos propios.
Este proceso se conoce como

agotamiento
Los virus pueden haber

evolucionado para explotar los
mecanismos normales de la
regulación inmune
Se ha descrito en VIH y virus de la

hepatitis
El virus puede infectar y matar o inactivar a
linfocitos T inmunocompetentes
VIH sobrevive infectando y eliminando

linfocitos T CD4+, que son inductores clave de
las respuestas inmunológicas contra antígenos
proteicos
Instituto de Estudio Superiores
del Estado de Chiapas
Licenciatura en Químico Farmacéutico Biólogo
Bacteriófagos
Presenta: M. en C. Jonathan Rodríguez Santiago
BACTERIÓFAGOS
ESTRUCTURA
La estructura de algunos virus es

extremadamente compleja, con un
virión consistente en varias partes cada
una con su propia forma y simetría.
Son denominados virus complejos
Los virus más complejos de todos son

los bacteriófagos que tienen cabeza y
cola y que infectan bacterias como a
Escherichia coli.
BACTERIÓFAGOS
CLASIFICACIÓN
La mayoría de los fagos aislados

(>95%) descubiertos hasta la fecha
tienen genomas de ADN de doble
cadena lineal (dsDNA)
empaquetados en una cápside
proteica con cola
Otros grupos de fagos pueden tener

cápsides sin cola con genoma de
dsDNA o cápsides sin cola con
ssDNA o genomas de RNA
BACTERIÓFAGOS
Las etapas más tempranas en el ciclo de vida de cualquier bacteriófago son:
• Unión a la superficie de su célula hospedadora
• Penetración a través de la capa o capas externas de la célula

hospedadora
• Entrada del genoma vírico dentro de la célula.

BACTERIÓFAGOS
UNIÓN
BACTERIÓFAGOS
PENETRACIÓN
La unión de un virus a su célula

hospedadora causa cambios en la
superficie del virus y en la de la
célula que llevan a la penetración.
Los bacteriófagos dejan la cápside

fuera de la célula y solo el genoma
vírico alcanza el citoplasma.
Sin embargo, para la replicación de

algunos virus, junto con el genoma
vírico deben entrar en la célula
hospedadora proteínas víricas
específicas
BACTERIÓFAGOS
CICLO LÍTICO
Una vez dentro de la bacteria, el

fago toma el control de la célula
bacteriana.
Los genes de fago se expresan, y

el genoma del fago se replica y
finalmente se empaqueta en
partículas de fago
autoensambladas.
Al final del ciclo de la infección, las

partículas de fagos de la progenie
emergen de la célula en un
proceso que generalmente
involucra la lisis celular por
proteínas de fagos.
BACTERIÓFAGOS
CICLO LISOGÉNICO
Algunos virus bacterianos de DNA

bicatenario también pueden
infectar y establecer una relación
genética estable de larga duración
con el hospedador.
Estos virus reciben el nombre de

virus atemperados.
Los virus atemperados pueden

entrar en un estado llamado
lisogenia.
BACTERIÓFAGOS
CICLO LISOGÉNICO
En este estado la mayoría de sus

genes no se transcriben; en vez de
hacerlo, el genoma del virus se
replica en sincronía con el
cromosoma del hospedador y pasa
a las células hijas durante la
división celular.
El estado lisogénico puede conferir

a la célula bacteriana hospedadora
nuevas propiedades genéticas, una
condición llamada conversión
lisogénica.
Una célula que alberga un virus

atemperado se denomina lisógena
BACTERIÓFAGOS
CICLO LISOGÉNICO
Durante la lisogenia, el genoma del

virus atemperado
• Se integra en el cromosoma
bacteriano
• Se encuentra en el citoplasma
en forma de plásmido
En cualquier caso, el DNA vírico, es

llamado ahora profago, y se replica
junto a la célula huésped siempre
que no se expresen los genes para
activar su ruta virulenta
BACTERIÓFAGOS
CICLO LISOGÉNICO
El estado lisogénico se mantiene

gracias a una proteína represora
codificada por el fago.
Normalmente niveles bajos de

transcripción de genes represores y
su consiguiente traducción
mantienen el represor a niveles
bajos en la célula.
BACTERIÓFAGOS
CICLO LISOGÉNICO
Si se inactiva el represor del fago o

si su síntesis es detenida por algún
motivo, el profago será inducido a
entrar en la fase lítica.
Si la inducción ocurre cuando el

DNA vírico está incorporado en el
cromosoma bacteriano, el DNA
vírico se escinde y los genes del
fago son transcritos y traducidos.
Se producen entonces nuevos

viriones y se lisa la célula
hospedadora
BACTERIÓFAGOS
IDENTIFICACIÓN Y AISLAMIENTO DE BACTERIÓFAGOS
IDENTIFICACIÓN DE PROFAGOS
INDUCCIÓN DE PROFAGOS
EXTRACCIÓN DE
BÚSQUEDA DE OBSERVACIÓN POR
DNA DE FAGOS
CEPAS PERMISIVAS MICROSCOPÍA
ELECTRÓNICA
ANÁLISIS DIFERENCIAL
PROPAGACIÓN DEL FAGO POR PCR
SECUENCIACIÓN
GENÓMICA
ANÁLISIS DE LA
SECUENCIA
BACTERIÓFAGOS
IDENTIFICACIÓN DE PROFAGOS
BACTERIÓFAGOS
INDUCCIÓN CON MITOMICINA C
Inducción de profagos.
1. Inocular una colonia en 50 ml de LB liquido, incubar a 37 °C a 200 rpm.
2. Dejar crecer hasta que el cultivo alcance una DO600= 0.3 (para E. coli y K.
pneumoniae esta DO la alcanza aprox. a las 1.5 hrs).
3. Agregar la Mitomicina al cultivo para tener una concentración final de 1 ug/ml.
4. Continuar incubando el cultivo durante 4-6 hrs. Cuando hay inducción del
profago la DO del cultivo disminuye significativamente.
5. Centrifugar el cultivo a 10K rpm durante 10 minutos.
6. Filtrar el sobrenadante con membranas de 0.45 uM.
7. Almacenar a 4°C
BACTERIÓFAGOS
BACTERIÓFAGOS
Precipitación de partículas virales.
1. Disolver 7g de PEG-6000 en 50 ml de sobrenadante.
2. Después de disolver el PEG agregar 3g de NaCl.
3. Dejar incubando a 4C durante 8 o 12 hrs.
4. Centrifugar a 10K rpm durante 10 min, a 4C.
5. Decantar para eliminar completamente el líquido

BACTERIÓFAGOS
Extracción de ADN de fagos.
1. Resuspender el precipitado en 500 ul de Buffer de DNAsa (con 10 ul de DNAsa

I y 10 ul de RNAsa).
2. Incubar durante 1h a 37C.
3. Agregar 1 ml de buffer M2
4. Incubar a 70C durante 1h.
5. Agregar 3 ml de buffer PB (del Miniprep Kit).
6. Pasar todo el lisado por una columna del Miniprep Kit.

BACTERIÓFAGOS
Extracción de ADN de fagos.
7. Agregar a la columna 700 ul de buffer PB y centrifugar a 13K rpm.
8. Agregar 700 ul de buffer PE del Miniprep Kit, y centrifugar durante 1m.
9. Centrifugar a 13k rpm durante 10 min para eliminar completamente el buffer PE.
10. Pasar la columna a un tubo limpio de 1.5 ml.
11. Agregar 50 o 100 ul de buffer EB del Miniprep Kit y dejar incubando a temperatura
ambiente durante 10 min.
12. Centrifugar durante 5 min a 13k rpm.
13. Evaluar la calidad del DNA en gel de agarosa (cargar 1 o 3 ul)

BACTERIÓFAGOS
ANALISIS DIFERENCIAL POR PCR
Amplificación por PCR.
72°C
Extensión
BACTERIÓFAGOS
Visualización por electroforesis.

BACTERIÓFAGOS
BACTERIÓFAGOS. Secuenciación de la extracción por
Illumina MiSeq
Illumina MiSeq
Illumina MiSeq
BACTERIÓFAGOS
BÚSQUEDA DE BACTERIAS PERMISIVAS
• Se examina permisividad en hasta 48 cepas por placa de 96 pocillos
• Se realiza cinética de crecimiento por 24 hrs en presencia y ausencia de fagos
• Se realiza la pequeña escala (200 ul de suspensión bacteriana por pocillo)
• En lugar de mitomicina C, se utiliza el sobrenadante de la inducción anterior
• Una vez identificada una cepa permisiva, se repite la infección a gran escala para
propagar el fago
BACTERIÓFAGOS.
200 ul de suspensión bacteriana OD600 0.3 + 1 ul de sobrenadante

BACTERIÓFAGOS.
200 ul de suspensión bacteriana OD600 0.3

BACTERIÓFAGOS.
SPOT TEST
BACTERIÓFAGOS.
SPOT TEST
En el spot test es posible recuperar bacterias lisogénicas en las zonas de lisis.
El análisis posterior por PCR y secuenciación de las bacterias recuperadas confirma si se

trata de bacterias lisogénicas o no
BACTERIÓFAGOS.
MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA
BACTERIÓFAGOS.
BACTERIÓFAGOS.
BACTERIÓFAGOS.
BACTERIÓFAGOS.
BACTERIÓFAGOS.

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Instituto de Estudio Superiores

del Estado de Chiapas

Finalmente, las células específicas de virus de la respuesta adaptativa llegan al sitio de la

El sistema inmune innato reconoce estructuras moleculares producidas por

Frecuentemente los componentes microbianos que estimulan la inmunidad

El sistema inmune innato también reconoce moléculas endógenas que producen

El sistema inmune innato usa receptores celulares y moléculas solubles que

Cuando los receptores de reconocimiento

Los principales receptores de

Los IFN I más importantes contra virus son IFN-α e IFN-β.

El IFN-α es producido principalmente por células dendríticas, monocitos y

 Bloquear la transcripción y traducción viral

La acción antiviral del IFN I es principalmente parácrina y autócrina

 Los IFN I provocan secuestro de linfocitos en los ganglios linfáticos, lo que

 Los IFN I aumentan la citotoxicidad de los NK y CTL CD8+

 Los IFN I promueven la diferenciación de linfocitos T vírgenes al subgrupo Th1

 Los IFN I aumentan la expresión de moléculas de clase I del MHC para

La expresión de moléculas de clase I

Sin embargo, esto posibilita que los

• Anticuerpos que bloquean la unión y

• CTL que eliminan la infección matando

• Antes de que infecten a las células

Los anticuerpos antivirales se unen a

La vacunación oral contra el virus de la poliomielitis actúa induciendo una

La activación del complemento también puede intervenir en la inmunidad

La resistencia frente a un virus particular, inducida por infección o vacunación,

La exposición a un tipo serológico de virus de la gripe no confiere resistencia

Los anticuerpos neutralizantes bloquean la infección viral de la célula y la

Por lo tanto la inmunidad humoral (por infección previa o vacunación) es capaz

La principal función de los CTL

Los CTL proliferan de forma masiva durante la infección viral

Los CTL efectores pueden matar a cualquier célula nucleada infectada

• El VIH es capaz de sufrir una

Estas moléculas actúan como antagonistas de las citosinas

La identificación de estas moléculas plantea la interesante posibilidad de que los

Transmisión de señales mediante

Este proceso se conoce como

Los virus pueden haber

Se ha descrito en VIH y virus de la

VIH sobrevive infectando y eliminando

La estructura de algunos virus es

Son denominados virus complejos

Los virus más complejos de todos son

La mayoría de los fagos aislados

Otros grupos de fagos pueden tener

Las etapas más tempranas en el ciclo de vida de cualquier bacteriófago son:

• Unión a la superficie de su célula hospedadora

• Penetración a través de la capa o capas externas de la célula

• Entrada del genoma vírico dentro de la célula.

La unión de un virus a su célula

Los bacteriófagos dejan la cápside

Sin embargo, para la replicación de

Una vez dentro de la bacteria, el

Los genes de fago se expresan, y

Al final del ciclo de la infección, las

Algunos virus bacterianos de DNA

Estos virus reciben el nombre de

Los virus atemperados pueden

En este estado la mayoría de sus