LAPORAN PRAKTIKUM ANALISIS OBAT

PERCOBAAN 4

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

Tanggal Praktikum : Senin, 7 Oktober 2019

Tanggal pengumpulan : Senin, 14 Oktober 2019

Disusun oleh: Kelompok 3

Yunus Aji Lumintang 11617002

Alia Datu Rahmatika 11617016

Jesicca Dwiyanti 11617025

Alya Farah Fauziah 11617030

Saka C. Tanaya 11617039

Natasia 11617041

Nama/NIM Asisten : Tasya Oesricha/ 20719013

LABORATORIUM KIMIA ANALITIK

PROGRAM FARMASI KLINIK DAN KOMUNITAS

SEKOLAH FARMASI

INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG

2019
1. TUJUAN PRAKTIKUM
a. Menentukan kadar kafein dalam suatu sampel menggunakan instrumen HPLC
b. Menentukan kadar asetosal dalam suatu sampel menggunakan HPLC

2. CARA KERJA
Dibuat larutan stok kafein dan parasetamol terlebih dahulu dengan melarutkannya
dalam pelarut HPLC. Setelah itu dibuat lima larutan standar yang mengandung kafein dan
parasetamol. Larutan dilarutkan dengan pelarut HPLC (metanol dan aquabidest 1:1). Dengan
menggunakan HPLC pada panjang gelombang 272 nm larutan kafein murni, parasetamol
murni, dan larutan standar berbagai konsentrasi serta sampel diinjeksikan ke dalam sistem
HPLC ditunggu selama enam menit untuk didapatkan kromatogram. Kemudian dibuat kurva
kalibrasi antara konsentrasi dengan area puncak dari kafein serta parasetamol.

3. PEMBAHASAN
Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran secara fisika didasarkan atas
perbedaan distribusi dari fase diam (padat atau cair) dan fase gerak (cair atau gas). Diketahui
bahwa terdapat dua komponen penting dalam kromatografi, yaitu fase diam dan fase gerak.
Adapun menurut IUPAC kromatografi adalah metode yang digunakan untuk memisahkan
komponen dalam sampel, dimana komponen tersebut didistribusikan diantara dua fase yaitu
fase diam dan fase gerak. Kromatografi diklasifikasikan berdasarkan prinsip pemisahan, fasa
yang terlibat, dan sistem geometrinya. Berikut merupakan tabel penggolongan kromatografi.
Tabel 3.1. Penggolongan Kromatografi (Sumber : http://kedaisains.blogspot.com)

a. Berdasarkan Prinsip Pemisahan

Klasifikasi jenis kromatografi berdasarkan prinsip pemisahannya adalah sebagai
berikut.
1) Kromatografi Adsorpsi : pemisahan didasarkan pada perbedaan sifat afinitas
adsorpsi dari komponen sampel pada permukaan padatan aktif.
2) Kromatografi Partisi : pemisahan berdasarkan perbedaan kelarutan antara komponen
sampel pada fase diamnya (kromatografi gas), atau berdasarkan perbedaan kelarutan
komponen dalam fase gerak dengan fase diamnya (kromatografi cair).
3) Kromatografi Pertukaran ion : pemisahan ion berdasarkan gaya elektrostatiknya
membentuk grup fungsional yang bermuatan pada fase diam. Kromatografi
pertukaran ion menggunakan resin sebagai padatan fase diam yang berguna untuk
mengikat anion atau kation.
4) Kromatografi Eksklusi Ukuran : pemisahan berdasarkan volume hidrodinamik dari
molekul atau partikel.
5) Kromatografi Afinitas : pemisahan berdasarkan nteraksi spesifik antara satu jenis
molekul zat terlarut dengan jenis molekul lain yang termobilisasi dalam fase diam.
b. Berdasarkan Fasa yang Terlibat
Pemisahan tipe kromatografi berdasarkan fasa yang terlibat, baik fasa diam
maupun fasa gerak yang digunakan ditunjukkan pada tabel berikut.
Tabel 3.2. Kromatografi Berdasarkan Fasa yang Terlibat

c. Berdasarkan Sistem Geometri

Klasifikasi jenis kromatografi berdasarkan sistem geometrinya dapat dibagi
menjadi kromatografi kolom dan kromatografi planar.
1) Kromatografi kolom : pada kromatografi ini, fase diamnya terdeposisi pada pipa
yang berbentuk kolom. Pada kromatografi kolom, komponen yang akan dipisahkan
bergerak bersama fase gerak melalui kolom tersebut dan kemudian setiap komponen
akan terpisahkan.
2) Kromatografi planar : pada kromatografi lapis tipis ini komponen yang akan
dipisahkan bergerak bersama fase gerak dalam sebuah bidang datar. Senyawa yang
bergerak terlihat seperti noda (spot) yang dapat dikenali. Posisi noda menunjukkan
identitas suatu komponen atau senyawa, sedangkan besar atau intensitas noda
menunjukkan konsentrasinya.
Pada praktikum ini, dilakukan salah satu jenis metode kromatografi yaitu metode HPLC.
Prinsip HPLC adalah distribusi analit antara fasa diam dan fasa gerak. Struktur kimia analit
akan mempengaruhi pergerakan molekul ketika melewati fasa diam. Interaksi intermolekul
yang spesifik antara sampel dan fasa diam akan mempengaruhi waktu dalam kolom. Ketika
molekul sampel memiliki interaksi yang kuat dengan fasa diam, waktu yang dibutuhkan untuk
melalui kolom akan semakin lama, dan berlaku sebaliknya. Interaksi ini terkait dengan
kepolaran atau perbedaan afinitas relatif dari sampel dan fasa diamnya. HPLC terbagi menjadi
beberapa tipe, yaitu: fase normal, fase balik, size-exclusion, dan ion-exchange. HPLC fase
normal yang dimaksud adalah menggunakan fasa diam yang relatif lebih polar daripada fasa
geraknya. Sebaliknya, pada fase balik, fasa diam bersifat lebih non polar dari fasa geraknya.
HPLC tipe inilah yang dilakukan pada praktikum.
Instrumentasi HPLC terdiri dari pelarut, pompa, injektor sampel, kolom, fasa diam,
fasa gerak, detektor, dan pengumpul data.

Gambar 3.1. Instrumentasi HPLC (Sumber: laboratoryinfo.com)

a. Pelarut : pelarut dalam HPLC biasanya merupakan campuran komponen cairan polar dan
non-polar yang konsentrasinya masing-masing bervariasi tergantung pada komposisi
sampel. Contohnya pada praktikum ini, digunakan pelarut metanol pro HPLC.
b. Pompa : pompa pada HPLC diperlukan untuk membuat fasa gerak melalui kolom dan
sistem pendeteksi dengan mengandalkan prinsip tekanan dan bukan gaya gravitasi.
Bergantung dari sejumlah faktor,yaitu: dimensi kolom, ukuran partikel fasa diam, laju
 aliran dan komposisi fasa gerak, tekanan operasi dapat dihasilkan hingga 42000 kPa
(sekitar 6000 psi).
c. Injektor sampel : injektor ini dapat berupa injeksi tunggal atau injeksi sistem otomatis.
Injektor untuk HPLC harus memungkinkan injeksi sampel cairan dengan range 0.1-100
mL.
d. Kolom: kolom biasanya dibuat dari besi tahan karat dengan rentang panjang 50-300 mm
dan diameter internal antara 2-5 mm. Kolom terisi dengan fase diam dengan ukuran
partikel 3-10 µm. Suhu fasa gerak dan kolom harus dijaga konstan selama analisis. Pada
praktikum ini, digunakan kolom C-18. Kecepatan aliran yang digunakan 0.8 mL
e. Fasa diam: contohnya: silica gel, silika terikat, C-18, dll. Pada praktikum ini digunakan
C-18 yang bersifat lebih nonpolar dari pelarut HPLC, sehingga percobaan dilakukan
dengan metode fase balik.
f. Fasa gerak : contohnya: etanol, metanol, kloroform, eter, dll. Pada praktikum ini,
digunakan fasa gerak campuran antara metanol pro HPLC dan aquabidest dengan
perbandingan 40:60.
g. Detektor : berada di akhir kolom yang mendeteksi analit yang telah berelusi dari kolom
kromatografi. Detektor ini bisa bermacam-macam, diantaranya: spektrofotometri IR, UV,
spektrofotometri massa, detektor elektrokimia, dll. Pada praktikum ini digunakan
spektrofotometri UV dengan λ=272 nm.
h. Pengumpul data : didapatkan kromatogram yang merupakan hasil yang akan diolah
dengan interpretasi seperti yang akan dijelaskan di halaman berikutnya.
HPLC ini sendiri memiliki kelebihan dan kekurangan. Kelebihannya adalah metode ini
bersifat spesifik. Kekurangannya adalah mahalnya alat dan digunakan banyak pelarut.Dari
HPLC kita akan mendapat output yakni puncak-puncak yang sering disebut dengan
kromatogram. Kromatogram terdiri dari dua sumbu, pada sumbu x merupakan waktu retensi
dan sumbu y merupakan intesitas. Waktu retensi adalah waktu yang diperlukan suatu senyawa
untuk bergerak dari kolom menuju detektor. Waktu retensi diukur berdasarkan waktu
senyawa mencapai puncak maksimal. Waktu retensi dari sebuah senyawa akan berbeda
bergantung dengan kepolaran. Apabila sifat kepolaran semakin tinggi, maka akan
menurunkan waktu retensi atau kontak antara analit dengan fase diam.
Pada praktikum ini menggunakan KCKT dengan detektor UV sehingga terdapat intesitas.
Intesitas menunjukkan daya serap dari suatu senyawa pada UV. Apabila luas kurva (peak)
rendah menandakan bahwa senyawa tersebut mengabsorbsi cahaya lebih sedikit pada panjang
gelombang yang ditentukan meskipun jumlah yang diberikan sama. Hasil percobaan yang
diberikan peak dari PCT lebih rendah dibandingkan kafein dikarenakan pada panjang
gelombang 272 nm kafein memiliki daya absorbansi lebih tinggi. Panjang gelombang
maksimal dari kafein adalah 272,5 nm sedangkan panjang gelombang paracetamol adalah 249
nm.
Pada praktikum seringkali terjadi kesalahan baik dari praktikan ataupun dari alat.
Maka dari itu perlu dilakukan validasi .Validasi metode analisis merupakan proses yang
dilakukan untuk meyakinkan bahwa karakteristik dari satu metode dapat digunakan untuk
aplikasi klinis. Tujuan dari validasi metode analisis adalah menjamin metode yang dilakukan
dapat memberikan hasil pengukuran yang baik. Setelah melakukan validase metode analisis,
dilakukan verifikasi untuk memastikan bahwa laboratorium dapat menjalankan metode
dengan hasil yang valid (presisi dan akurat). Verifikasi metode analisis merupakan proses
konfirmasi kembali untuk menunjukkan metode sesuai dakam memenuhi kebutuhan
laboratorium. Verifikasi dilakukan dikarenakan setiap laboratorium memiliki perbedaan
personel dan alat untuk menerapkan sebuah metode.
Validasi metode analisis adalah bentuk penilaian terhadap suatu parameter berdasarkan
percobaan untuk membuktikan bahwa parameter yang diuji memenuhi persyaratan. Berikut
merupakan parameter dari validasi metode analisis:
1) Akurasi merupakan parameter yang menunjukkan kedekatan antara hasil pengamatan
dengan nilai yang sebenarnya. Akurasi dapat dihitung dari % recovery.
2) Presisi merupakan ukuran perbedaan suatu hasil percobaan pada pengukuran berulang.
Penentuan dapat dilakukan dengan menghitung standar deviasi.
3) Spesifisitas adalah kemampuan metode untuk mengukur zat tertentu dengan pasti.
4) Selektivitas adalah kemampuan metode untuk mengukur suatu zat tanpa terpengaruh zat
lain yang bersifat mengganggu.
5) Linearitas berhubungan dengan kemampuan suatu metode yang secara langsung atau
dengan transformasi dapat memberikan respon yang proporsional terhadap suatu uji.
6) LoD adalah batas minimal zat untuk dapat dideteksi oleh suatu metode, sementara LoQ
adalah batas minimal zat agar dapat ditentukan jumlahnya oleh suatu metode.
7) Ketangguhan merupakan kemampuan reproducibility dari suatu metode dengan prosedur
yang sama namun dilakukan dalam kondisi yang berbeda (seperti waktu pengerjaan,
analis yang berbeda, lab yang berbeda), ketangguhan dapat dihitung dengan ANOVA.
8) Kekuatan adalah kemampuan metode untuk bertahan terhadap perubahan prosedur yang
dilakukan sedikit demi sedikit dengan pengamatan akurasi dan presisi hasil uji.
Sebelum instrumen pengukuran digunakan, perlu dilakukan kalibrasi. Kalibrasi
merupakan proses pengaturan dan pemeriksaan akurasi instrumen dengan suatu standar ukur.
Fase gerak merupakan pembawa analit yang dapat bersifat inert maupun berinteraksi
dengan analit tersebut. Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang
dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Zat cair
yang akan digunakan sebagai fasa gerak HPLC harus memenuhi beberapa persyaratan
berikut: zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan
dianalisis, zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yang dapat
mengganggu interpretasi kromatogram, zat cair harus jernih untuk menghindarkan
penyumbatan pada kolom, zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan
tidak beracun, zat cair tidak kental, dan sesuai dengan detektor.
Pada praktikum ini digunakan fase gerak metanol dan aquabidest dikarenakan keduanya
bersifat polar dan dapat melarutkan parasetamol. Hal ini sejalan dengan syarat fase gerak
yang menyatakan bahwa fase gerak harus dapat melarutkan cuplikan (parasetamol).
Parasetamol dan kafein umumnya terdapat bersama-sama dalam satu tablet obat yang
memiliki sifat kepolaran berbeda. Gugus kromofor yang dimilikinya menyebabkan dapat
menyerap sinar UV.
Parasetamol memiliki rumus empiris C8H9NO2 dengan struktur parasetamol dapat
dilihat pada gambar berikut :

Gambar 3.2 Struktur Parasetamol

Kafein dengan rumus empiris C8H10N4O2 dengan struktur kafein dapat dilihat pada
gambar berikut :

Gambar 3.3 Struktur Kafein

Kepolaran dapat dilihat dari struktur senyawanya dimana parasetamol hanya memiliki
satu ikatan CH3 sementara kafein 3 ikatan CH3. Oleh karenanya, senyawa-senyawa kafein
akan menghabiskan dalam kolom lebih lama dan mempunyai waktu retensi yang besar.
Sementara, molekul parasetamol dalam campuran akan menghabiskan waktunya untuk
bergerak bersama dengan pelarut sehingga akan keluar terlebih dahulu dan mempunyai waktu
retensi yang kecil.
Pada uji KCKT, pertama dilakukan adalah preparasi dua larutan stok yaitu kafein
100 ppm dan parasetamol 100 ppm. Preparasi dilakukan dengan melarutkan kafein dan
 parasetamol murni ke dalam labu volumetric 25 ml. Selanjutnya, adalah preparasi larutan
standar. Larutan standar dibuat dengan konsentrasi 10, 20, 30, 40 dan 50 ppm. Selanjutnya,
larutan stok diinjeksikan terlebih dahulu diikuti dengan larutan standar dari konsentrasi
terkecil hingga konsentrasi terbesar dan terakhir diikuti dengan larutan sampel sebanyak dua
kali sebelum penggantian larutan yang akan diinjeksikan, syringe perlu dibilas 3 kali agar
tidak terkontaminasi larutan lainnya sehingga hasilnya lebih akurat. Setelah diambil
sampelnya menggunakan syringe, perlu dihilangkan gelembung udara dalam syringe agar
tidak memasukkan gas ke dalam HPLC hal ini dikarenakan gas akan berkumpul dengan
komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis..
Sebelum diinjeksikan tekan untuk menginjeksikan larutan lalu tunggu hingga tertampil
waiting for injection setelah itu syringe dimasukkan dan loop dibuka dan larutan diinjeksikan.
Selanjutnya loop ditutup dan syringe ditarik. Tunggu selama 6 menit, lalu catat kromatogram
dan luas peak yang menyatakan konsentrasi komponen dalam campuran.
Pada uji HPLC dilakukan uji menentukan konsentrasi parasetamol dan kafein dari
sampel yang disediakan. Didapatkan hasil berupa peak area dari kafein dan paratamol yang
setelah itu masing-masing dilakukan regresi agar mendapatkan persamaan linear. Persamaan
linear kafein adalah y = 42434,09x + 21816,3 dengan nilai r kuadrat sebesar 0,999738 dan
persamaan linear parasetamol adalah y = 19029,6x + 3920,6 dengan nilai r kuadrat sebesar
0,97016. Lalu setelah dilakukan perhitungan nilai konsentrasi sebenarnya dari kafein sebesar
24,856 ppm dari konsentrasi teoritis sebesar 25 ppm yang menghasilkan galat hanya sebesar
0,5734% dan konsentrasi sebenarnya dari parasetamol sebesar 23,5704 ppm dari konsentrasi
teoritis sebesar 25 ppm yang menghasilkann galat hanya sebesar 5,72%. Dengan galat yang
cukup kecil, menandakan senyawa kafein dan parasetamol yang diujikan murni dan tidak ada
kesalahan prosedur yang telah dilakukan.

4. KESIMPULAN
a. Kadar kafein sampel yang didapatkan adalah 24,856 ppm dengan galat 0,5734%.
b. Kadar parasetamol sampel yang didapatkan adalah 23,5704 ppm dengan galat 5,72%.

5. DAFTAR PUSTAKA
Clark, Jim. 2007. High Percormance Liquid Chromatography diakses dari
https://www.chemguide.co.uk/analysis/chromatography/hplc.html pada Sabtu 12
Oktober pukul 00.50 WIB.
Editorial Team. 2019. High Performance Liquid Chromatography (HPLC): Principle, Types,
Instrumentation and Applications. Diakses dari laboratoryinfo.com pada hari Sabtu,
12 Oktober pukul 22.00 WIB.
Harmita. 2011. “Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara Pehitungannya”. Majalah
Ilmu Kefarmasian (1) : 117 - 135,
Johnson, .E.L. dan R. Stevenson. 1991. Dasar Kromatografi Cair. Terjemahan dari Basic
Liquid Chromatography, oleh Padmawinata K. ITB: Bandung. Hal 3-9.
Kedaisains. 2017. Kromatografi, jenis-jenis dan cara kerja kromatografi, diakses dari
http://kedaisains.blogspot.com/2017/05/cara-kerja-kromatografi.html pada hari Sabtu, 12
Oktober 2019 pukul 17.35 WIB.
Tim Dosen Kimia Analitik. 2013. Petunjuk Praktikum Kimia Instrumen. Bandung: LKI
Universitas Pendidikan Indonesia. Hlm. 19-22.
United States Pharmacopeial Convention. 2007. United States Pharmacopeia Edisi 30. United
States Pharmacopeial Convention, Inc. Hlm 17-20.
Wahyuni, Iin. 2013. Validasi dan Verifikasi Metode Analisis Bakteri Asam Laktat Pada
Produk Susu. Bogor : Fakultas Teknologi Pertanian Institut Pertanian Bogor. Hlm 13-21.
Widjaja, Marselia. 2011. Validasi Metode Penetapan Kadar Kurkumin Dalam Sediaaan Cair
Obat Jerbal Tersandar Merk Kiranti Secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase
Terbalik. Jogjakarta : Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. Hlm 15-16.