253T20180306 TC PDF

UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN ANTONIO ABAD
DEL CUSCO
FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS
ESCUELA PROFESIONAL DE ZOOTECNIA
“IDENTIFICACIÓN DEL GENOTIPO DEL VIRUS DE LA DIARREA VIRAL

BOVINA (VDVB) EN VACAS DE LA PAMPA DE ANTA – CUSCO”
Tesis presentada por la Bachiller en

Ciencias Agrarias:
MILAGROS CENTENO FLORES,
Para optar al título profesional de
INGENIERO ZOOTECNISTA
ASESORES:
M.V.Z. EDGAR ALBERTO VALDEZ

GUTIÉRREZ
ING. ZOOT. FIORELA KATTERINE

FERNÁNDEZ BUSTINZA
“PATROCINADOR: Proyecto “Evaluación de la Eficiencia Reproductiva en

Vacas de la Pampa de Anta VIA CANON - UNSAAC”
K´AYRA - 2018
i
DEDICATORIA
A dios por haberme brindado salud y felicidad, para poder alcanzar a una de las
más grandes metas trazadas en mi vida.
Con todo mi amor y respeto a mis padres por siempre haberme brindado
felicidad, por el amor que me dan y sobre todo por el apoyo incondicional para
poder alcanzar uno de mis mayores sueños, por las palabras de aliento, llamadas
de atención, los consejos y nunca haberme dejado sola, por haber hecho de mí
una persona de bien.
PAPÁ LEONCIO Y MAMÁ DEMETRIA.
A mis hermanos quienes son mis compañeros de locuras y alegrías, quienes
siempre me motivaron a continuar a pesar de los obstáculos, por la confianza
que depositaron en mí.
WILSON, FREDY, CINTHYA, WILMAR
A mis amigos, compañeros incondicionales quienes siempre me apoyaron,
estuvieron conmigo en los buenos y malos momentos, por siempre haberme
impulsado a seguir, por no dejar que me rinda, por haberme permitido entrar a
sus vidas y dejarme vivir tantos bellos momentos, por tantas locuras, anécdotas
que vivimos.
ALEXANDRA, MARGOT, JENNY, CRISTIAN
A mis amigas, compañeras del laboratorio por haberme permitido entrar a este
hermoso mundo de la sanidad, por los consejos, por las aventuras vividas, por
la comprensión y confianza depositaron en mí.
FIORELA, YAMILET
ii
AGRADECIMIENTO
A la Universidad Nacional San Antonio Abad del Cusco que hizo realidad mis
sueños y aspiraciones.
A la facultad de Ciencias Agrarias por haberme brindado la oportunidad de
formar parte de esta hermosa familia académica y así pudiendo lograr una
profesión digna.
A todos mis docentes de la escuela profesional de zootecnia por compartir sus
valiosos conocimientos en sus enseñanzas durante mi formación académica.
Mi especial reconocimiento al proyecto de investigación “Evaluación de la
Eficiencia Reproductiva en Vacas de la Pampa de Anta VIA CANON – UNSAAC”,
por el financiamiento brindado para la ejecución de este proyecto de
investigación.
Mi especial gratitud a mi asesor el M.V.Z. Edgar Alberto Valdez Gutiérrez, quien
con su comprensión, su apoyo incondicional, confianza que me brindo,
conocimientos compartidos y sobre todo por el asesoramiento en la ejecución
del presente trabajo de investigación.
Mi especial gratitud a mi asesora Ing. Zoot. Fiorela Katterine Fernández Bustinza,
por el apoyo incondicional, por los conocimientos compartidos y sobre todo por
el asesoramiento en la ejecución del presente trabajo de investigación.
A todos mis amigos y compañeros con los que compartí tantos bellos momentos
durante mi formación académica, gracias a cada uno, por ayudarme a crecer
como persona y por la amistad que me brindaron.
iii
ÍNDICE DE CONTENIDO
Página
INTRODUCCIÓN ............................................................................................... 1
PROBLEMA OBJETO DE INVESTIGACIÓN .................................................... 3
CAPITULO I ....................................................................................................... 5
OBJETIVOS Y JUSTIFICACIÓN ....................................................................... 5
1.1. OBJETIVOS ............................................................................................. 5
1.1.1. Objetivo general ................................................................................. 5
1.1.2. Objetivo especifico ............................................................................. 5
1.2. JUSTIFICACIÓN ...................................................................................... 6
CAPITULO II ...................................................................................................... 7
MARCO TEORICO ............................................................................................ 7
2.1. ANTECEDENTES DE LA INVESTIGACIÓN ............................................ 7
2.2. BASES TEORICAS ................................................................................ 10
2.2.1. Diarrea Viral Bovina (DVB). ............................................................. 10
2.2.2. Agente etiológico ............................................................................. 10
2.2.2.1. Taxonomía y estructura ................................................................ 10
2.2.3. Clasificación ..................................................................................... 11
2.2.3.1. Genotipo y biotipos ....................................................................... 11
2.2.4. Patogénesis ..................................................................................... 14
2.2.4.2. Complejo respiratorio .................................................................... 15
2.2.4.3. Complejo diarrea neonatal bovina ................................................ 15
2.2.4.4. Infección subclínica ...................................................................... 16
2.2.4.10. Síndrome Hemorrágico ................................................................. 18
iv
2.2.5. Respuesta inmune ........................................................................... 18
2.2.6. Diagnostico ...................................................................................... 18
2.2.7. Epidemiologia .................................................................................. 19
2.2.8. Prevención y control ........................................................................ 22
2.3 BASES CONCEPTUALES ..................................................................... 24
2.3.1. Prueba de PCR en tiempo real (TR - PCR) ..................................... 24
2.3.1.1. Definición ......................................................................................... 24
2.3.1.2. RT - PCR.......................................................................................... 25
2.3.1.2.1. PCR de un paso frente a dos pasos en tiempo real ...................... 25
2.3.1.2.2. Controles para PCR ...................................................................... 25
2.3.1.3. VENTAJAS DE LA PRUEBA DE PCR – TR .................................... 26
2.3.1.4. DESVENTAJAS DE LA PRUEBA DE PCR - TR .............................. 26
CAPITULO III ................................................................................................... 27
MATERIALES Y METODOS ........................................................................... 27
3.1. ÁMBITO DE ESTUDIO .......................................................................... 27
3.1.1. Ubicación política ............................................................................. 27
3.1.2. Ubicación geográfica ....................................................................... 27
3.1.3. Clima ................................................................................................... 29
3.2. MATERIALES DE ESTUDIO ..................................................................... 29
3.2.1. Población y muestra ............................................................................ 29
3.2.1.1. Muestra ............................................................................................ 29
3.2.1.1.1 De las muestras ............................................................................. 29
3.2.2. Equipos e instrumentos para el procesamiento de muestras .............. 30
3.2.3. Materiales para el procesamiento de muestras................................... 30
3.2.4. Reactivos para el analisis del genotipo de la VDVB en el laboratorio . 31
v
3.3. METODOLOGÍA ........................................................................................ 33
3.3.1. Metodología de laboratorio.................................................................. 34
3.3.1.1. Metodología de TR - PCR para la identificación del virus de la diarrea
viral bovina .................................................................................................... 34
3.3.1.1.1. Principios de la prueba .................................................................. 34
3.3.3.1.2. Extracción del material genético. .................................................. 34
3.3.3.1.2.1. Preparación de las muestras y reactivos.................................... 34
3.3.3.1.2.2. Procedimiento para la extracción del material genético ............. 35
3.3.3.1.3. Detección TR – PCR de un solo paso, para la identificación del
virus de la diarrea viral bovina ...................................................................... 38
3.3.3.1.3.1. Preparación de las muestras y reactivos.................................... 38
3.3.3.1.3.1.1 Reconstitución de los componentes del kit .............................. 38
3.3.3.1.3.2. Procedimiento para la identificación del genotipo del virus de la
diarrea viral bovina por el método de TR-PCR de un solo paso ................... 39
3.3.3.1.3.2.1. Amplificación TR – PCR de un solo paso, para la identificación
del virus de la diarrea viral bovina ................................................................. 41
3.3.3.1.4. Validación de la prueba. ................................................................ 45
3.3.3.1.5. Interpretación de resultados .......................................................... 45
CAPITULO IV................................................................................................... 46
RESULTADOS Y DISCUSIONES.................................................................... 46
4.1 GENOTIPIFICACIÓN DEL VIRUS DE LA DIARREA VIRAL BOVINA

(VDVB) ............................................................................................................. 46
5.1 CONCLUSIONES ....................................................................................... 67
5.2 RECOMENDACIONES. ............................................................................. 68
BIBLIOGRAFIA ............................................................................................... 69
vi
ÍNDICE DE TABLAS
Página
TABLA 1: Resumen de antecedentes para la identificación del genotipo del

virus de la diarrea viral bovina (VDVB). .............................................................. 9
TABLA 02: Distribución de muestras para cada distrito de vacunos

persistentemente infectados (pi) al virus de la diarrea viral bovina (VDVB). .... 30
TABLA 03: Cantidad de reactivo por reacción para la solución de lisis unión. 35
TABLA 04: Cantidad de reactivo por reacción para la solución de perlas

magnéticas. ...................................................................................................... 35
TABLA 05: Combinación de reactivos por reacción. ....................................... 36
TABLA 06: Cantidad de agua libre de nucleasas para la reconstitución de

los componentes del kit .................................................................................... 39
TABLA 07: Cantidad de buffer de preparación de plantilla para la

reconstitución de los componentes del kit ........................................................ 39
TABLA 08: Cantidad de reactivos para la preparación del master mix. .......... 39
TABLA 09: Tiempos y temperaturas para la amplificación del pcr en tiempo

real. .................................................................................................................. 41
TABLA 10: Criterios para la ejecución valida de pcr – tiempo real. ................. 45
TABLA 11: Interpretación de los resultados de las pruebas de muestra

individual. ......................................................................................................... 45
TABLA 12: Valor del Ct (ciclo umbral) de las muestras, control positivo,
control negativo para el genotipo 1 de la diarrea viral bonina (VDBV-1). ......... 46
TABLA 13: Valor del Ct (ciclo umbral) de las muestras, control positivo,
control negativo para el genotipo 2 de la diarrea viral bonina (VDVB-2). ......... 47
TABLA 14: Resultado para la genotipificación de la diarrea viral bovina

(VDVB-1, VDVB-2) en los distritos de Ancahuasi, Anta, Cachimayo, Zurite y
huarocondo. ..................................................................................................... 48
vii
ÍNDICE DE FIGURAS
Página
FIGURA 01: Morfología y estructura del virus de la diarrea viral bovina

(VDVB) ………………………………………………………………………………..12
FIGURA 02: Mapa de la provincia de Anta ………………………………………28
FIGURA 03: Ubicación de los distritos de la provincia de anta (Ancahuasi,

Anta, Cachimayo, Huarocondo y Zurite) ……….…………………………………28
ÍNDICE DE GRAFICOS
Página
GRAFICO 01: Resultado del genotipo 1 del Virus de la Diarrea Viral Bovina
(VDVB-1) de la muestra 130 del distrito Zurite ................................................. 51
(VDVB-1) de la muestra 215 del distrito de Zurite ............................................ 52
(VDVB-1) de la muestra 122 del distrito de Zurite ............................................ 53
(VDVB-1) de la muestra 16 del distrito de Huarocondo .................................... 54
(VDVB-1) de la muestra 43 del distrito de Cachimayo ..................................... 55
(VDVB-1) de la muestra 5 del distrito de Cachimayo ....................................... 56
GRAFICO 07: resultado del genotipo 1 del Virus de la Diarrea Viral Bovina
(VDVB-1) de la muestra 112 del distrito de Cachimayo ................................... 57
(VDVB-1) de la muestra 37 del distrito de Anta ................................................ 58
(VDVB-1) de la muestra 16 del distrito de Anta ................................................ 59
viii
(VDVB-1) de la muestra 281 del distrito de Ancahuasi .................................... 60
(VDVB-1) de la muestra 216 distrito Ancahuasi ............................................... 61
(VDVB-1) de la muestra 130 del distrito Ancahuasi ......................................... 62
(VDVB-1) de la muestra 16 del distrito de Ancahuasi ...................................... 63
(VDVB-1) de la muestra 16 del distrito de ancahuasi ....................................... 64
(VDVB-2), de la muestra 130; 215; 122 del distrito de Zurite, 16 del distrito de
Huarocondo y 43; 5; 112 del distrito de Cachimayo ......................................... 65
(VDVB-2), de las muestras 37; 4 del distrito de Anta, las muestras 281; 216;
130; 28; 248 del distrito Ancahuasi ............................................................... 66
ÍNDICE DE ANEXOS
Página
ANEXO 01: Ambiente de reacción de la cadena de la polimerasa en tiempo

real (RT- PCR) ……………………………………………………………………….77
ANEXO 02: Materiales para la extracción del material genético y detección

del genotipo VDVB…………………………………………………………..……… 78
ANEXO 03: Reactivos para la extracción de material genético…………...……79
ANEXO 04: Reactivos para la identificación del genotipo del virus de la

diarrea viral bovina (VDVB…….......………………………………………………..79
ANEXO 05: Registro de vacunos persistentemente infectados (PI) de los

distritos de Anta, Ancahuasi, Huarocondo, Cachimayo y Zurite………………..80
ix
GLOSARIO
x VDVB : Virus de la Diarrea Viral Bovina
x VDVB-1 : Virus de la Diarrea Viral Bovina biotipo 1
x VDVB-2 : Virus de la Diarrea Viral Bovina biotipo 2
x CP : Citopatico
x Ct : Ciclo umbral
x DNA : Acido desoxirribonucleico
x ELISA : Ensayo por Inmunoabsorción Ligada a la Enzima
x LU : Lisis unión
x EM : Enfermedad de las Mucosas
x MEM : Minimun Essential Médium
x NCP : No Citopatico
x OFR : Marca abierta de lectura
x PI : Persistentemente Infectado
x PM : Perlas Magnéticas
x PCR : Reacción en Cadena de la Polimerasa
x RNA : Ácido ribonucleico
x
RESUMEN
El presente estudio tuvo como objetivo identificar al genotipo del Virus de
la Diarrea Viral Bovina (VDVB), en vacas de la Pampa de Anta de la Región
Cusco, se trabajó con 14 muestras de animales persistentemente infectados (PI)
detectado por el método ELISA. La identificación del genotipo se realizó en el
laboratorio “Desarrollo y Validación de pruebas Serológicas y Moleculares para
la Investigación y Diagnóstico de Enfermedades Infecciosas de la Escuela
Profesional de Zootecnia, Área de Sanidad Animal UNSAAC” mediante el
método de RT-PCR (Reacción en cadena de la Polimerasa en tiempo real). Los
resultados nos indican que en las 14 muestras evaluadas está presente la cepa
del genotipo 1 del Virus de la Diarrea Viral Bovina (VDVB-1) y está ausente la
cepa del genotipo 2 del Virus de la Diarrea Viral Bovina (VDVB-2) en la población
de vacunos de la pampa de Anta. La presencia del genotipo 1 (VDVB-1) se
debería a que dicho genotipo es el más difundido en poblaciones bovinas de
muchos países como es el caso de EEUU de donde el Perú importo bovinos sin
restricción respecto al Virus de la Diarrea Viral Bovina, la ausencia o baja
prevalencia del genotipo 2 (VDVB-2) puede deberse a una baja prevalencia o
bajo número de cepas analizadas (14 muestras) a comparación con el número
de cepas analizadas en otras estudios donde sí se detectó ambos genotipos.
xi
INTRODUCCIÓN
El Perú cuenta con 5´156,0 cabezas de ganado bovino, donde la
población de ganado bovino se concentra en la sierra con 3´774, 3 cabezas de
ganado bovino que representa el 73,2% del total, la Región del Cusco posee una
población de 407,267 cabezas de ganado vacuno, siendo una de las regiones
con porcentajes más altos en la explotación ganadera. Del cual la provincia de
Anta posee una población de 53,177 cabezas de bovino de acuerdo a los
resultados del (IV Censo Nacional Agropecuario, 2012), las comunidades de
Anta están caracterizados por la crianza del ganado bovino puesto que es una
actividad importante que realizan las familias y es una fuente de ingreso
económico permanente.
La enfermedad de la DVB, fue introducida al país en la década del 60 con
la importación de vacas de países donde la enfermedad era endémica (Rivera.,
1993). Posteriores estudios epidemiológicos demuestran que DVB está
ampliamente difundida en la población bovina, especialmente en las principales
cuencas lecheras como: Cajamarca, Lima y Arequipa (Rivera., 2001)
ocasionando abortos y afecciones respiratorias como parte del complejo
respiratorio bovino. (Zanabria et al., 2000).
El virus de la diarrea vira bovina (VDVB), ha sido clasificado en dos
biotipos, (citopático y no citopático) según su comportamiento en células de
cultivo, y en dos genotipos (I y II) de acuerdo con su secuencia genética. El
genotipo I, está asociado con la enfermedad clásica de la DVB en sus diferentes
presentaciones clínicas, mientras que el genotipo II, está relacionado a cuadros
agudos severos y hemorrágicos digestivos en adultos (Rivera., 1993).
1
El genotipo 2 del Virus de la Diarrea Viral Bovina (VDVB-2), está presente
en Norte América; también, se ha detectado en países de América Latina como
Brasil (Wageck et al., 1998), Argentina (Jones et al., 2001) y Chile (Pizarro et
al., 2006). Aun, cuando el genotipo 1 del Virus de la Diarrea Viral Bovina (VDVB-
1) es más frecuentemente detectado en comparación con VDVB-2. El VDVB ha
sido aislado de brotes agudos de DVB o síndrome hemorrágico en EEUU y
Canadá a fines de la década del 80 (Corapi et al., 1990)(Pellerin et al., 1994)
(Carman et al., 1998), sin embargo, no todas las cepas del VDVB-2 aisladas han
sido asociadas con el síndrome hemorrágico, debid a que fueron aisladas de
terneros PI nacidas de vacas vacunadas con VDVB-1 (Ridpath et al., 1994,
2000).
La enfermedad se puede presentar en distintas formas, que van desde
una subclínica a clínica hiperaguda o aguda hasta una crónica, acompañada por
inmunodepresión que incrementa la susceptibilidad a patógenos secundarios. En
su forma aguda, produce abortos, muertes perinatales, nacimientos prematuros
y un amplio rango de malformaciones (Duffel et al., 1986). En su forma crónica
da lugar al nacimiento de animales persistentemente infectados (PI) e
inmunotolerantes al virus los cuales resultan de gran relevancia epidemiológica
y son los responsables de la perpetuación del virus en la población bovina
(Edwards et al., 1987).
Es por ello que en el presente trabajo de investigación se identificó al
genotipo del Virus de la Diarrea Viral Bovina (VDVB) que está presente en el
ganado bovino de la pampa de Anta, por medio de la amplificación de Reacción
de la Cadena de la Polimerasa en Tiempo Real (PCR-TR).
2
PROBLEMA OBJETO DE INVESTIGACIÓN
Las enfermedades entéricas, respiratorias y reproductivas constituyen las
principales patologías, que limitan los procesos productivos y reproductivos de
los bovinos. Entre los agentes virales que tienen especial implicación en la
ocurrencia patologías como enfermedades entéricas se encuentra el virus de la
Diarrea Viral Bovina (VDVB) (Rivera., 1993).
El VDVB en el tracto reproductivo produce infertilidad temporal, muerte
embrionaria, abortos, malformaciones congénitas y crías nacidas débiles o con
infección persistente dependiendo del tiempo de gestación. Los animales PI
posibilitan la generación de los dos genotipos virales (VDVB-1) y (VDVB-2).
El VDVB-1, produce inmunosupresión, problemas entéricos, neumonías,
abortos, los cuales son, silenciosos, produce malformaciones, alarga los entre
partos, también el nacimiento de animales Persistentemente Infectados (PI) que
son la principal fuente de contagio.
El VDVB-2, produce el síndrome hemorrágico siendo mortal por ser el virus
más agresivo (Araínga., 2010).
Los animales PI infectados con el VDVB-1 o VDVB-2 pueden llegar a
desarrollar una enfermedad de carácter mortal denominado enfermedad de las
mucosas y el síndrome hemorrágico. Lo que genera, menor cantidad de crías en
los hatos, con lo cual se tendría una menor cantidad de vacas en producción,
teniendo un impacto económico generando así, la pérdida de interés en la
producción animal (Paton., 1995).
Es así, en la provincia de Anta del departamento de Cusco se viene
observando algunos problemas reproductivos, como bajo porcentaje de vacas
3
preñadas, algunos abortos, baja producción láctea cuyas causas son de
sintomatología compatible DVB que afecta al ganado vacuno con la consiguiente
pérdida de animales y desmedro de la economía de la provincia mencionada.
En este contexto, el proyecto tiene como objeto identificar el genotipo del
Virus de la Diarrea Viral Bovina que está presente en la vacas de la pampa de
Anta de la Región del Cusco.
4
CAPITULO I
OBJETIVOS Y JUSTIFICACIÓN
1.1. OBJETIVOS
1.1.1. Objetivo general
Identificar el genotipo del virus de la Diarrea Viral Bovina (VDVB), en vacas de la
Pampa de Anta de la Región Cusco, por el método de RT-PCR.
1.1.2. Objetivo especifico
x Identificar el genotipo del virus de la Diarrea Viral Bovina (VDVB) por el
método de RT-PCR de vacas persistentemente infectado en los distritos
de Ancahuasi, Anta, Cachimayo, Huarocondo y Zurite de la Pampa de
5
1.2. JUSTIFICACIÓN
La ganadería en la Provincia de Anta, es importante para el poblador
debido a que es una fuente de ingreso económico primordial para las familias;
por lo tanto, cualquier problema sanitario que afecta a los vacunos es de suma
importancia y deben tomarse medidas de solución inmediata.
Los vacunos persistentemente infectados (PI) son los grandes
diseminadores de la enfermedad que llegan a contagiar a más del 90% de los
vacunos cuando comparten el pastoreo y más del 95% cuando están
estabulados.
Hay una tendencia mundial para erradicar al Virus de la Diarrea Viral
Bovina (VDVB); por tanto, los estudios epidemiológicos y la disponibilidad de
herramientas diagnósticas modernas podrían servir de base para la elaboración
de un programa nacional de control-erradicación del VDVB en el Perú por ende
en la provincia de Anta, que al inicio podría ser de tipo voluntario como está
ocurriendo en dos hatos de Arequipa.
Con esto pretendemos identificar al genotipo del virus de la Diarrea Viral
Bovina (BVDV) mediante el método del TR – PCR por ser una prueba de mayor
sensibilidad y por no tener antecedentes de la genotipificación del virus en la
región del Cusco, para así poder brindar una información evidente sobre la
existencia de este virus y además este trabajo de investigación contribuirá a
controlar la enfermedad.
6
CAPITULO II
MARCO TEORICO
2.1. ANTECEDENTES DE LA INVESTIGACIÓN
En los establos lecheros de Arequipa, Cajamarca, Junín, La Libertad,
Lima y Puno Se seleccionaron 55 muestras de bazo, timo, riñón, pulmón de fetos
bovinos abortados y muestras de sangre, suero o plasma de bovinos con
sospecha de infección aguda o PI. Las 55 muestras resultaron positivas al VDVB
por el método de inmunoflorescencia (IF) o ELISA de captura. Las muestras
positivas fueron procesadas por la técnica RT-PCR en tiempo real, para
determinar el genotipo viral. Se aislaron 41 cepas del VDVB, El 85.4%
correspondieron al fenotipo no citopático y 14.6% al citopático. Donde se indicó
que 14 de 55 muestras fueron positivas al genotipo VDVB-1, siendo el 25% del
total de muestras evaluadas y ninguna al genotipo VDVB-2 (Araínga et al.,
2010).
Se aisló 25 muestras Persistentemente Infectados (PI) siendo 15
muestras originarias del Perú y 10 muestras originarias de Chile para la
caracterización genética. Todos los sueros fueron identificados como positivos
por ELISA de antígeno de la Diarrea Viral Bovina (DVB) y se confirmaron como
positivos por el metodo TR-PCR, las muestras también fueron amplificadas y
secuenciadas donde mostro que las 25 cepas pertenecen al genotipo 1 y ninguna
cepa pertenece al genotipo 2 (Stahl et al., 2009).
En San Cristóbal de la provincia de Santa Fe (Argentina), se evaluaron 5
animales, las muestras de estos animales se aisló por cultivo celular por el
método de neutralización viral, se analizaron por PCR en tiempo real para
7
evaluar la presencia del VDVB genotipo II en la cuenca lechera santafesina. Los
cultivos celulares infectados mostraron efecto citopatico (ECP) compatible con el
producido por la Diarrea Viral Bovina (DVB) (vacuolación intensa, alteración y
lisis celular). En los análisis realizados revelaron 90-98% de homología con las
cepas de referencia tipo I, no encontrándose cambios asociados a las cepas tipo
II (Gollán et al., 2006).
En seis establecimientos de la provincia de Buenos Aires (Argentina), se
diagnosticaron casos de Diarrea Viral Bovina durante los meses de Febrero y
Octubre de 2013, para los 6 casos (A, B, C, D, E, F) se realizó una detallada
anamnesis, obteniendo datos del establecimiento, del rodeo, del manejo general
y del curso de la enfermedad. Se efectuó la necropsia de al menos un animal en
cada caso, se registraron las lesiones y se obtuvieron muestras en esterilidad de
bazo en formol viral de diversos órganos para el estudio para aislamiento viral,
histopatológico e imunohistoquímico, muestras congeladas y sangre
heparinizada para PCR. En el caso B se aislaron cepas NCP pertenecientes al
genotipo II con un porcentaje de identidad del 88% con respecto a la cepa de
referencia N93, siendo este caso una presentación atípica del VDVB. En los
casos D y E se aislaron cepas del biotipo CP, lo cual permite confirmar en el caso
E el cuadro de Enfermedad de las Mucosas. En el caso D, el aislamiento de
cepas CP en 2 neonatos es un hallazgo poco frecuente que podría asociarse a
la presencia de madres PI (Morrell et al., 2014).
8
Tabla 1: Resumen de antecedentes para la identificación del genotipo del Virus
de la Diarrea Viral Bovina (VDVB)
N° de
Autor, año y
muestras Muestra Prueba TIPO 1 TIPO 2
lugar
– casos
(Araínga., 2010)
PERÚ (Arequipa,
Cajamarca, 55 25%
Suero RT-PCR 0
Junín, La muestras 14 muestras
Libertad, Lima,
Puno)
(Stahl et al., 2009) 25

Suero RT-PCR 25 muestras 0
PERU, CHILE muestras
(Gollán., 2006)
ARGENTINA 5 muestras Suero RT-PCR 90-98% 0
(Santa Fe)
(Morrell., 2014)
ARGENTINA 6 casos Suero RT-PCR 2 muestras 1 muestra
(Buenos Aires)
9
2.2. BASES TEORICAS
2.2.1. Diarrea Viral Bovina (DVB).
La diarrea viral bovina es una enfermedad contagiosa de origen en los
rumiantes. Esta enfermedad de considerable importancia en el ganado vacuno
es causada por el virus de la diarrea viral bovina (VDVB) y está estrechamente
relacionada con la peste porcina clásica y los virus de la enfermedad de la
frontera ovina (Brownlie et al., 1998)
2.2.2. Agente etiológico
2.2.2.1. Taxonomía y estructura
El virus VDVB pertenece al género pestivirus de la familia Flaviviridae (Los
pestivirus han sido clasificados de la familia Togaviridae de la familia Flaviviridae
por la quinta reunión del comité Internacional de taxonomía viral). Dentro de este
género se encuentra el virus de la enfermedad de las fronteras de bovinos y la
peste porcina clásica (PPC) los cuales son antigénicamente y genéticamente
relacionados (Alvarez et al., 2002).
Los pestivirus pueden cruzar la barrera placentaria de hospederos
diferentes, invadir el feto y generar una infección persistente que continúa
durante la vida postnatal, clínicamente inaparente, excretando el virus e
infectando a otras especies (Alvarez et al., 2002). La VDVB también infecta
ganado de pezuña hendida como cerdos y ovinos (Jubb., 1993).
Estos son virus envueltos, esféricos y miden entre 40 a 60 mm de
diámetro, se componen de una cadena simple de ARN, de polaridad positiva,
compactado por una cápside proteica y rodeado por una membrana fosfolípidos;
y nucleocápside no helicoidal de simetría icosahédrica. El ácido nucleico es
infeccioso en ausencia de las proteínas del virión, ya que el RNA viral es la vez
10
RNA mensajero. En 1988 Collet encontró que el RNA tiene un solo OFR (open
Reading frame o marco abierto de lectura), y que la secuencia de nucleótidos
codifica para 3988 aminoácidos, lo cual representa 449 kda de proteína viral. El
genoma posee proteínas estructurales y no estructurales; las proteínas
estructurales son p20, p14 (C) gp25 (E1). En estudios realizados por Renard en
1987, con la cepa Osloss, produjo un DNA complementario (cDNA) al RNA viral
y expresado y caracterizado que el RNA nos es poliadenilado y que sus
condiciones bioquímicas lo sitúan más cerca de la familia Flaviviridae que la
Familia Togaviridae (Paton., 1995).
2.2.3. Clasificación
La clasificación del VDVB es difícil, debido a su variabilidad genética y
antigénica y a su estrecha relación con otros miembros del género Pestivirus
(virus de la peste porcina clásica y virus de la enfermedad de la frontera del
ovino). Los hospedadores en que eran aislados los Pestivirus fueron las bases
iniciales para su subdivisión. Así, los Pestivirus que eran aislados del cerdo,
ovino y bovino se los clasificaba como virus de la peste porcina clásica, virus de
la enfermedad de la frontera y VDVB, respectivamente. Sin embargo, este criterio
de clasificación es poco fiable debido a que los Pestivirus cruzan fácilmente la
barrera de especie.
2.2.3.1. Genotipo y biotipos
Hay más de 200 cepas diferentes de VDVB, comprendidas dentro de dos
genotipos: VDVB-1 y VDVB-2. El análisis de la región codificante para la
autoproteasa viral Npro permite la distinción entre genotipos (Becher et al.,
1997). Los genotipos están subdivididos en subgenotipos o subgrupos: VDVB-
11
1a – l y VDVB-2a/b (Walz et al., 2010), dependiendo de sus características
genéticas.
Figura 01: Morfología y estructura del Virus de la Diarrea Viral Bovina (VDVB)
Fuente:(http://homepage.usask.ca/~vim458/virology/studpages2007/Ashle
yB/bvdvvirus.html, 2007)
En la figura 01 que en la parte A. Los Pestivirus tienen una cadena simple
positiva de ARN (ss (+) ARN). La cápside tiene una estructura icosaédrica, que
consiste de una sola proteína de cápside, en la parte C. La cual está limitada por
una envoltura, codificada por 3 proteínas de membrana (Erns, E1 y E2), y en la
parte B. VDVB tiene un diámetro de 40-60 nm y se cataloga entre los virus de
menor tamaño.
El genotipo del VDVB se refiere a diferencias en el genoma viral. El VDVB
se ha dividido tradicionalmente en 2 genotipos:
El VDVB tipo 1 es el responsable de procesos leves con sintomatología
inaparente, caracterizados por un ligero aumento de la temperatura corporal y la
12
presencia de lesiones moderadas restringidas al aparato digestivo y a órganos
del sistema linfoide. Asimismo, en vacas gestantes este genotipo puede inducir
abortos y otras patologías reproductivas. Los aislados de tipo 1 se emplean con
frecuencia en el desarrollo de vacunas y métodos de diagnóstico (Pedrera et al.,
2008).
Los aislados del VDVB tipo 2 están asociados con enfermedades agudas
severas, caracterizadas en ocasiones por presentar un cuadro hemorrágico
agudo, conocido como síndrome hemorrágico, causa la muerte de los animales,
no siendo en general más virulentas que las de tipo 1 (Pedrera et al., 2008).
Los biotipos de VDVB se han clasificado en biotipos citopático (CP) y no
citopático (NCP), de acuerdo a su efecto citolítico en células en cultivo (Moennig
& Plagemann, 1992). Sin embargo, en publicaciones más recientes, se ha
propuesto que el VDVB puede ser segregado en tres biotipos en función de su
actividad en células linfoides cultivadas (Ridpath et al., 2006). Estos tres biotipos
serían:
1. VDVB citopático, que causaría lisis en células epiteliales cultivadas,
2. VDVB no citopático, que no muestra efectos obvios sobre la viabilidad de
cualquiera de las células epiteliales o linfoides cultivadas y,
3. VDVB linfocitopático, sin efecto en las células epiteliales pero capaz de
causar lisis en células linfoides en cultivo.
El biotipo linfocitopático propuesto se correlaciona con la virulencia en las
infecciones agudas. La muerte celular causada por el biotipo linfocitopático no
se asocia con cambios en el procesamiento de la proteína viral de NS2-3.
13
Las cepas CP provienen de las cepas NCP por diferentes mutaciones
tales como inserción de secuencias celulares, duplicaciones de genes,
deleciones, cambios nucleotídicos simples, entre otros; que inducen al clivaje de
la proteína NS2-3 para dar origen a las proteínas NS2 y NS3, siendo esta última
proteína el marcador molecular de las cepas CP. El caso contrario, mutación de
CP a NCP, fue reportado en sólo una ocasión (Nakamura et al., 1997), pero este
hallazgo sigue siendo controversial.
El VDVB tipo 1 NCP se aísla comúnmente de infecciones agudas
producidas en campo y se le atribuye la mayor parte del daño causado a los
rebaños (Pellerin et al., 1994). Este biotipo es el responsable de infecciones
persistentes, mientras que el VDVB tipo 1 y 2 CP es considerado como el
causante de la Enfermedad de las Mucosas (EM) en combinación con un VDVB
NCP persistente del mismo genotipo.
Mientras que el biotipo se basa en diferencias de rasgos expresados como
la citopatologia en cultivo celular.
2.2.4. Patogénesis
Después del contacto con las membranas mucosas de la boca o nariz, la
replicación ocurre en las células epiteliales con una predilección por las tonsilas
palatinas (Jubb., 1993). El virus presenta tropismo por células mitóticamente
activas como: linfocitos, fagocitos mononucleares y células epiteliales (Paton.,
1995).
La diseminación ocurre a través del virus libre en el suero o leucocitos
infectados con el virus, particularmente linfocitos, monocitos, linfoblastos
circulantes y células precursoras de macrófago (Baker., 1995).
14
El VDVB puede dar origen a diversas manifestaciones clínicas y lesiones
como resultado de la interacción de factores tales como: cepa y biotipo viral,
edad y estado inmune del hospedador, factores estresantes y otros patógenos
concurrentes, además manifestaciones clínicas que van desde infecciones
subclínicas a una grave, una forma altamente mortífera denominada enfermedad
de las mucosas (EM) (Baker., 1995). El grado de viremia inducida durante la
infección por VDVB se asocia con la gravedad de la enfermedad clínica. Los
aislamientos del VDVB que inducen un alto grado de viremia pueden ser capaz
de inducir signos clínicos de la enfermedad (Jubb., 1993).
Dentro de las principales características, producto de una infección con el
BVDV, se puede mencionar:
2.2.4.1. Inmunodepresión
El VDVB produce leucopenia y altera las funciones de los leucocitos,
incrementando la patogenicidad de microorganismos coinfectantes. Además
posee una fuerte afinidad por el tejido linforeticular, ocasionando necrosis y
atrofia de dichos tejidos (Baker et al., 1995).
2.2.4.2. Complejo respiratorio
El VDVB con lleva a una inmunodepresión sistémica y pulmonar,
aumentando la patogenicidad de los demás agentes respiratorios, además, se
ha demostrado que ciertas cepas de la diarrea viral bovina actúan como agentes
primarios de neumonías (Brownlie et al., 1998).
2.2.4.3. Complejo diarrea neonatal bovina
Cuando fracasa la transferencia pasiva de anticuerpos, el virus participa
en el complejo diarrea neonatal de los terneros. Infecciones concurrentes con
15
enteropatógenos resultan en manifestaciones clínicas más severas, debido al
efecto inmunodepresivo del VDVB o simplemente a una sumatoria de efectos
(Kelling., 1996).
2.2.4.4. Infección subclínica
La mayor parte de las infecciones son subclínicas o de carácter moderado,
ocasionalmente se presenta fiebre, descarga oculonasal, leucopenia transitoria,
elevada morbilidad y baja mortalidad (Kelling., 1996). En este tipo de infecciones,
se desarrollan anticuerpos neutralizantes 14 a 28 días postinfección y
consecuentemente la protección contra reinfecciones por cepas homólogas del
virus probablemente de por vida (Fredriksen., 1999).
2.2.4.5. Infección aguda
La forma aguda se presenta en animales seronegativos, en especial
animales entre 6 y 24 meses de edad, y es causada, en su mayoría, por virus no
citopatogénico (Baker., 1995), además de ser de severidad variable, en bovinos
seronegativos e inmunocompetentes (Kelling et al., 1996).
2.2.4.6. Trastornos reproductivos
El mayor impacto económico de la infección con el VDVB es el ocasionado
por los trastornos reproductivos (Dubovi., 1994) (Moennig., 1995).
Es posible detectar el antígeno viral en los macrófagos y células del
estroma ovárico, entre los días 6 a 60 post infección (Grooms., 1998), y en
células foliculares y ovocitos en distintos estados de maduración (Fray., 1998).
Las infecciones de hembras susceptibles próximas al momento del
apareamiento ocasionan muerte embrionaria y repeticiones de servicio hasta
que desarrollen respuesta inmune (Grahn., 1984).
16
2.2.4.7. Infección de hembras gestantes
El VDVB en hembras gestantes susceptibles, produce infecciones
subclínicas, sin embargo existe una alta probabilidad de una propagación
transplacentaria del virus hacia el feto. Esto conlleva a que el feto, a tal infección,
presente una variedad de respuestas, incluyendo el aborto o el nacimiento de
terneros débiles y pequeños con o sin malformaciones congénitas, además de
terneros clínicamente normales. El principal determinante del resultado de la
infección de la DVB en vacas preñadas, es la edad del feto expuesto al desafío
viral, además de ser importante el estado inmunológico de la madre (Murray.,
1991).
2.2.4.8. Infecciones persistentes
La infección fetal con VDVB puede resultar en el nacimiento de terneros
inmunotolerantes al VDVB con una infección persistente inaparente. Los
animales PI resultan por la infección fetal con VDVB biotipo NCP durante el
primer trimestre de gestación dado que el sistema inmune fetal no reconoce el
VDVB como agente infeccioso o foráneo (Fray., 1998) (Glew., 2001).
2.2.4.9. Infección de las mucosas
La EM se genera cuando animales PI con una cepa NCP son súper
infectados con una cepa CP homóloga, de origen exógeno o generado de
cambios genéticos o recombinación de ARN de las cepas NCP residentes,
siendo posible el aislamiento de ambos biotipos antigénicamente similares. Es
decir el biotipo CP surge de mutaciones del biotipo NCP, aunque no se descartan
fuentes externas. Esta enfermedad, esporádica y fatal, se caracteriza por
presentar severa leucopenia, diarrea profusa, erosiones y ulceraciones en el
sistema digestivo (Baker., 1995) (Kelling., 1996).
17
2.2.4.10. Síndrome Hemorrágico
Este síndrome se genera de la infección de los animales PI por el genotipo 2 del
VDVB, en USA y Canada, se han reportado como severos, en estos casos se
observa diarrea con sangre, epistaxis, congestión en conjuntiva y mucosas,
hemorragias petequiales y equimóticas en mucosas, los animales muestran
pirexia, leucopenia, linfopenia y neutropenia. Este síndrome ha sido asociado
con infecciones por cepas NCP del genotipo II (Ridpath et al, 2000).
2.2.5. Respuesta inmune
Una característica de importancia de la infección con VDVB es la aparente
afinidad del virus por el sistema inmune (Lambot., 1998) y la inmunosupresión
es una de sus principales atributos (Tizard., 2002)
El VDVB parece inducir respuestas mediadas por células T y B, existiendo
una distinción entre respuestas humorales y mediadas por células, lo que sugiere
la existencia de subpoblaciones de linfocitos T cooperadores Th1 y Th2 en la
regulación de las respuestas inmunes específicas dirigidas contra el VDVB
(Lambot., 1997). Esto puede deberse a la afección de la función de células
presentadoras de antígeno, llevando a una reducción en la habilidad para
estimular respuestas de las células T (Glew., 2001).
2.2.6. Diagnostico
Al igual que la mayoría de microorganismos. Los virus pueden ser
detectados de forma directa o indirecta. Las pruebas directas, son las que
evidencian al virus o algunos de los antígenos virales; mientras que las pruebas
indirectas, son las que se utilizan con más frecuencia y básicamente demuestran
un contacto del huésped con el agente viral mediante la determinación de
18
anticuerpos específicos contra el virus. El objetivo principal del diagnóstico es la
detección y remoción de bovinos PI, principal fuente de infección y reservorio del
virus. Estas pruebas son las siguientes:
1. Aislamiento viral en cultivo celular
2. Detección de antígenos virales
a. Inmunofluorescencia
b. Inmunoperoxidasa
c. ELISA captura de antígenos
3. Detección de anticuerpos
a. Neutralización viral (VN)
b. Inmunoabsorvancia Ligada a Enzimas (ELISA)
4. Detección del ácido nucleico viral
5. RT-PCR
2.2.7. Epidemiologia
2.2.7.1. Prevalencia
El VDVB se encuentra ampliamente distribuido en el mundo entero; sin
embargo, la considerable variación de las prevalencias, tanto de animales
seropositivos como de animales portadores o PI, se deberían a las diferencias
entre los sistemas de manejo y al tamaño de los hatos de cada localización
(Lindberg., 1999). Aquellos lugares donde las explotaciones presentan altas
densidades poblacionales, suelen presentar las mayores prevalencias (Houe.,
1999).
En el Perú, estudios realizados por investigadores de la FMV-UNMSM ha
determinado una amplia distribución del VDVB en las cuencas lecheras, con
prevalencias superiores al 70% (Contreras., 2000) (Rivera., 2003). Reportaron
19
un prevalencia del 72.4% en el Valle del Mantaro, mientras que (Jayashi, 2005)
encontraron 80.2% en un establo de crianza intensiva de la provincia de
Arequipa. Otros estudios encontraron 73.7% en la Provincia de Canchis, Cusco
(Álvarez, 2001) y 85.3% en Parinacochas, Ayacucho (Rivera., 2001)
2.2.7.2. Fuentes de infección
Los animales PI son considerados las principales fuentes de infección y
diseminación del VDVB. Esto se debe a que estos animales eliminan
constantemente y abundantemente el virus durante toda su vida a través de sus
secreciones y excreciones (descarga nasal, saliva, lagrimas, leche, orina, heces
y semen), al grado al que en solo 3 o 4 meses pueden infectar al 90% del ganado
en contacto con ellos (Houe., 1999) (Houe., 1995). Las infecciones agudas son
también una fuente de infección aunque de menor importancia, debido al corto
periodo de duración de la misma (unos 6 días), como a la menor cantidad de
virus excretado (Houe., 1995) (Lindberg., 1999).
2.2.7.3. Formas de transmisión
2.2.7.3.1. Transmisión horizontal
La principal vía de transmisión horizontal es la directa. Esto ocurre por
contacto generalmente oro-nasal, de un animal susceptible con otro infectado, a
través de secreciones y excreciones como saliva, orina, heces, descarga
oculonasal, secreciones vaginales, fetos abortados y placentas (Tremblay.,
1996)También puede ocurrir por el semen de toros que se encuentren en la fase
aguda de la infección o que sean PI, tanto por monta natural como por
inseminación artificial (Baker., 1995) (Vanroose et al., 1998).
20
La vía indirecta ocurre a través de la ropa de personal involucrado en el
manejo de los animales o instrumentos de uso veterinario contaminado y por
algunas moscas picadoras. Además, experimentalmente se demostró que el
VDVB puede transmitirse incluso por vía a erógena desde un bovino PI hacia
uno susceptible en un plazo aproximado de una semana (Mars et al., 1999).
2.2.7.3.2. Transmisión vertical
La transmisión vertical ocurre de una generación a otra. Se incluye la
transmisión del feto a través de semen infectado de toros con infección aguda o
persistentemente infectado (PI). Las hembras seronegativas pueden
inseminadas con semen infectada pudiendo infectarse, sin embargo la
producción del feto PI raramente ocurre por esta ruta; en caso de ocurrir la
producción de una cría de PI. Mientras en las hembras preñadas, el biotipo NCP
se puede diseminar verticalmente a través de la placenta; si el feto es infectado
por este biotipo antes de adquirir competencia inmunológica (antes del día 125
de gestación aproximadamente), desarrollara una infección persistente (IP);
estos terneros pueden actuar como fuente de infección. Pese a la elevada tasa
de mortalidad de los PI en su primer año de vida, muchos alcanzan la madurez
sexual y se reproducen (Los toros PI, infectan a las hembras durante la monta
directa y la inseminación artificial). Hembras PI siempre dan terneros PI. La
transmisión vertical siempre ocurre luego de la transferencia embrionaria si el
receptor es PI, o la vaca donante es PI y no se realiza el correcto lavado del
embrión (Houe., 1995).
Cuando se infecta una vaca preñada no inmune con virus BVDV se
produce una enfermedad subclínica y el virus rápidamente atraviesa la placenta.
21
2.2.8. Prevención y control
2.2.8.1. Vacunas
Una complicación para el desarrollo de las vacunas contra el virus BVDV
es la diversidad antigénica. La tendencia es identificada la mayor cantidad de
variantes antigénicas e incluirlos en la vacuna. Las evaluaciones realizadas a las
vacunas existentes dieron resultados muy variados, tanto para la infección post
natal como para la infección pre natal. Entre las vacunas se tiene:
2.2.8.1.1. Vacunas a virus modificado
La vacuna de virus modificado contra la diarrea viral bovina (DVB) está
asociado a una gran variedad de efectos adversos, tales como la inducción de la
enfermedad de las mucosas (EM), infección fetal e inmunosupresión, pueden
potenciar infecciones recurrentes, resultando en un incremento en la incidencia
de enfermedades respiratorias (Potgieter., 1995)
Existen más 140 vacunas en USA, todas satisfacen requerimientos como
pureza, potencia y seguridad; garantizando una respuesta inmune. Libres de
agentes extraños. La vacuna a virus vivo modificado, usualmente contiene un
solo biotipo de DVB citopatógeno. Los biotipos citopáticos usados usualmente
son virus de la Diarrea Viral Bovina (DVB) – NADL, DVB- Singer, DVB- G24V
(Bolin., 1995).
2.2.8.1.2. Vacunas inactiva
Las ventajas del uso de ese tipo de vacunas está relacionada a las
desventajas del uso de las vacunas de virus vivo modificado, sin embargo las
desventajas de este tipo de vacuna y esto a su vez retrasa el tiempo necesario
22
para que se establezca una inmunidad protectora, a su vez, la duración de
inmunidad inducida es corta (Bolin., 1995).
2.2.8.2. Medidas de bioseguridad
El conocimiento detallado de la epidemiología del virus (DVB) y del
comportamiento de las pruebas diagnósticos en uso son esenciales para la
identificación de animales virémicos (Animales PI y animales con infección
aguda), que son la fuente más importante de diseminación viral en hatos
afectados.
Un programa de prevención, control o erradicación de una enfermedad
puede ser adoptada a distintas estrategias que van a variar de acuerdo a la
situación inicial de la explotación pero apoyadas en tres pilares fundamentadas
que son: Las medidas de bioseguridad, identificación y remoción de los animales
PI y vacunación contra DVB en el hato (Lambot., 1998).
x Bioseguridad la implementación de medidas de bioseguridad están dirigidas
a evitar el ingreso de virus de la diarrea viral bovina (DVB), así como su
difusión dentro del hato, a través del control estricto de todo los animales que
se incorporan los cuales deben ser seronegativos a virus, antes del después
de cuarentena estricta, evitar el contacto directo con otros hatos, evitar el
servicio con semen sin certificación de ser libre de la enfermedad.
x Identificación y eliminación de animales PI, estrategia indispensable por la
importancia epidemiológica de estas animales.
x Inmunización con vacunas de virus muertos o modificado, con el objetivo de
prevenir la infección congénita así como. Para evitar las infecciones
posnatales (Grahn., 1984).
23
2.3 BASES CONCEPTUALES
2.3.1. Prueba de PCR en tiempo real (TR - PCR)
PCR son las siglas por las que se conoce (Reacción en cadena de la
polimerasa), cuyas iniciales en inglés son PCR ("polymerase chain reaction").
2.3.1.1. Definición
La técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) fue creado
por Kary Mullis en 1983 (Mullis., 1990). La gran utilidad de esta técnica se
difundió a principios de los ochenta por toda la comunidad científica. Los nuevos
equipos y las avanzadas técnicas de secuenciación, así como los programas de
computación para la manipulación de datos que se fueron sucediendo,
permitieron el desarrollo de mejores ensayos de PCR(Spanakis., 1993).
La Reacción en Cadena de la Polimerasa en tiempo real, también
conocida como Real Time PCR (RT-PCR) muestra la capacidad de monitorear
el progreso de la reacción de PCR a medida que esta ocurre. Los datos son
colectados a lo largo del proceso de PCR y no al final como se realizaba antes.
Este método revolucionó la forma en que se usaba la técnica de PCR para
cuantificación de ADN y ARN. El RT-PCR usa moléculas de un reportero
fluorescente para monitorear la amplificación de productos durante cada ciclo de
reacción. Su simplicidad, especificidad y sensibilidad junto con su potencial como
técnica en aplicaciones futuras y la evolución hacia nuevos conocimientos de la
química, además de la confiabilidad en la instrumentación y protocolos
mejorados, han hecho del RT-PCT una tecnología altamente competitiva para la
detección de ADN y ARN (Weller et al., 2000).
24
2.3.1.2. RT - PCR
La PCR de transcripción inversa o RT-PCR, permite el uso de RNA como
molde. Un paso adicional permite la detección y amplificación del RNA. El RNA
se transcribe de forma inversa en DNA complementario (cDNA) utilizando una
transcriptasa inversa. La calidad y pureza del RNA molde es esencial para el
éxito de la RT-PCR. El primer paso de la RT-PCR es la síntesis de un híbrido
DNA / RNA. La eficiencia de la reacción de la primera cadena puede afectar al
proceso de amplificación. A partir de aquí, se utiliza el procedimiento de PCR
convencional para amplificar el cDNA. La posibilidad de revertir el RNA en cDNA
por RT-PCR tiene muchas ventajas (Genesig).
2.3.1.2.1. PCR de un paso frente a dos pasos en tiempo real
Al detectar / cuantificar la presencia de un objetivo con un genoma de ARN
se recomienda el uso de un protocolo RT-PCR de un solo paso. Un paso RT-
PCR combina la transcripción inversa y la reacción de PCR en tiempo real en un
simple de tubo cerrado. Esto ahorra un tiempo de banco significativo pero
también reduce los errores. La sensibilidad de un protocolo de un paso protocolo
también mayor que un paso doble porque la muestra biológica completa está
disponible sin dilución (Genesig).
2.3.1.2.2. Controles para PCR
Control Interno: Se define como una secuencia de ADN o ADNc que es
co-amplificado con el ADN blanco y se usa principalmente para aumentar la
confiabilidad de los ensayos, ya que permite la detección de falsos negativos.
Es decir determina un ensayo fallido o inhibición de la reacción. El control interno
más usado para la PCR-RT es un plásmido que contiene secuencias de
organismos distantes filogenéticamente. Estos plásmidos pueden ser
25
adicionados a la mezcla de PCR o directamente a la muestra clínica (de esta
forma se verificaría si la extracción de ADN a partir de la muestra se llevó a cabo
correctamente). La longitud del templado del control interno debe ser mayor a la
longitud del templado de ADN blanco para asegurar que la competencia de la
reacción tienda más hacia el último
Control positivo o externo: No permite verificar la reacción
individualmente ya que la reacción se da en un tubo diferente; no revela la
ineficiencia en la extracción de ADN o ARN.
Control negativo: se puede utilizar otro organismo no relacionado con el
organismo en estudio, o también se puede utilizar agua o buffer en lugar de ADN
templete.
2.3.1.3. VENTAJAS DE LA PRUEBA DE PCR – TR
9 Simplicidad y rapidez.
9 Especificidad.
9 Sensibilidad.
2.3.1.4. DESVENTAJAS DE LA PRUEBA DE PCR - TR
9 Costo de micro placas.
9 Costo de equipo automático.
9 Costo del kit.
26
CAPITULO III
MATERIALES Y METODOS
3.1. ÁMBITO DE ESTUDIO
El presente trabajo de investigación se realizó en la Provincia de Anta en
los distritos de Ancahuasi, Anta, Zurite, Huarocondo y Cachimayo de la región
del Cusco. El procesamiento de las muestras en el laboratorio de “Desarrollo y
Validación de Pruebas Serológicas y Moleculares para la investigación y
Diagnóstico de Enfermedades Infecciosas de la Escuela Profesional de
Zootecnia, Área de Sanidad Animal-UNSAAC”, en el periodo de Junio a Agosto
del 2018.
3.1.1. Ubicación política
x Región : Cusco
x Departamento : Cusco
x Provincia : Anta
x Distritos : Ancahuasi, Anta, Cachimayo, Huarocondo y Zurite
3.1.2. Ubicación geográfica
x Latitud Sur : 13°27’20”
x Longitud oeste : 72°15’21”
x Altitud máxima : 3405 m.s.n.m
x Superficie : 52.32 km²
Fuente: (SENAMHI, 2010).
27
Figura 02: Mapa de la provincia de Anta
Figura 03: Ubicación de los distritos de la provincia de Anta (Ancahuasi, Anta,
Cachimayo, Huarocondo y Zurite)
Fuente: Instituto Geográfico Nacional (IGN).
28
3.1.3. Clima
El clima de la zona es del tipo tropical de altura, caracterizado por un
contraste muy fuerte entre una estación de lluvia y una estación de seca: hay
presencia lluvia entre los meses de Noviembre a Marzo que termina en Abril y
una estación seca entre los meses de Noviembre a Marzo, con heladas
nocturnas desde fines de Mayo hasta principios de Agosto. La precipitación anual
esta entre 650 mm de Diciembre a Marzo y 150 mm entre Abril y Noviembre en
las principales zonas de vida (3600 m.s.n.m). El déficit hídrico permanece nueve
meses de Abril a Diciembre (SENAMHI, 2010).
3.2. MATERIALES DE ESTUDIO
3.2.1. Población y muestra
Vacunos de las razas Holstein, Brow swiss e Hibridos, de los Disritos,
Ancahuasi, Anta, Cachimayo, Huarocondo y Zurite.
3.2.1.1. Muestra
Se analizó muestras de vacunos persistentemente infectados (PI) que
fueron detectados por la prueba de ELISA captura de antígenos.
3.2.1.1.1 De las muestras
Las muestras estuvieron constituidas por suero sanguíneo de 14 vacunos
persistentemente infectados (PI).
29
Tabla 02. Distribución de muestras para cada Distrito de vacunos
persistentemente infectados (PI) al Virus de la Diarrea Viral Bovina (VDVB)
Animales
Distrito > 6
1-2 años 2.5-3 años 3.5-4 años PI
meses
Ancahuasi 1 1 3 0 5
Anta 0 0 1 1 2
Cachimayo 0 3 0 0 3
Zurite 3 0 0 0 3
Huarocondo 0 0 0 1 1
Total 14
3.2.2. Equipos e instrumentos para el procesamiento de muestras
x Micro Centrifuga (AL220VAC).
x Cabina de flujo laminar (Kossodo), (BIOBASE).
x Equipo de PCR (Applied Biosystems).
x Vortex (VORTEX 2 GENIE).
x Micropipetas de (1 - 20 μl; 20 – 200 μl y 100 - 1000 μl).
x Rack Magnético (BioLabs).
3.2.3. Materiales para el procesamiento de muestras
x Tips desechables y estériles.
x Viales criogénicas de 2.5 ml y 5 ml.
x Barbijos.
30
x Gorros.
x Lentes.
x Guantes de látex.
x Mandiles descartable.
x Cronometro.
x Multi portador de tubo para el vortex.
x Tubos de reacción rápida (8 tubos/tira).
x Tapa de tubos de reacción rápida.
3.2.4. Reactivos para el analisis del genotipo de la VDVB en el laboratorio
x Kit de TR-PCR para Virus de la Diarrea Viral Bovina (VDVB)
9 Polyprotein (VDVB 1) primer/probe mix
9 Polyprotein (VDVB 2) primer/probe mix
9 Polyprotein (VDVB 1) positive control template
9 Polyprotein (VDVB 2) positive control template
9 VDVB 1 and VDVB 2 RT primer mix
9 RNAse/DNAse free water
9 Template prepration buffer
31
x Kit extractor de RNA
9 MagMAX™ CORE Lysis Solution
9 MagMAX™ CORE Binding Solution
9 MagMAX™ CORE Wash Solution 1
9 MagMAX™ CORE Wash Solution 2
9 MagMAX™ CORE Elution Buffer
9 MagMAX™ CORE Magnetic Beads
9 MagMAX™ CORE Proteinase K
x Suero sanguíneo 200 μl de cada muestra
32
3.3. METODOLOGÍA
FLUJOGRAMA DE TRABAJO
Identificación de las muestras persistentemente infectadas

(PI) analizadas por ELISA.
Extracción del material genético de las muestras para el

análisis en el PCR
Procesamiento del material genético con los reactivos para

la identificación del genotipo de la diarrea viral bovina
(DVB) por el método del PCR-TR
Procesamiento de resultados
Positivo al genotipo del Positivo al genotipo del

virus de la diarrea viral virus de la diarrea viral
bovina tipo 1 bovina tipo 2
Conclusiones
33
3.3.1. Metodología de laboratorio
3.3.1.1. Metodología de TR - PCR para la identificación del virus de la
diarrea viral bovina
3.3.1.1.1. Principios de la prueba
El kit Primerdesign denesig para los genomas del virus de la diarrea viral
bovina (VDVB) diseñado para el virus de la diarrea viral bovina (VDVB) diseñado
para la cuantificación in vitro de los genomas del VDVB. El kit está diseñado para
tener el perfil de detección lo más amplio posible, mientras permanece específico
para el genoma de VDVB.
Los primers y las secuencias de sonda en este kit tienen 100% de
homología con un amplio rango de secuencias de VDVB basado en un análisis
bioinformática completo.
El kit contiene dos conjuntos de cebadores y sondas. Cada uno de los
cebadores del gen de la poliproteína y los conjuntos de sondas están diseñados
para detectar el virus de la diarrea viral bovina 1 y la diarrea viral bovina Virus 2
(Genesig).
3.3.3.1.2. Extracción del material genético.
3.3.3.1.2.1. Preparación de las muestras y reactivos.
x Esterilizar la cabina de flujo laminar para evitar la contaminación de las
muestras.
x Solución de lisis unión.
Realizar los cálculos para la cantidad de muestras a trabajar, siempre
incluir el 10% de excedente para compensar la imprecisión del pipeteo.
34
Tabla 03: Cantidad de reactivo por reacción para la solución de lisis unión
Componente Por reacción Por reacción (+10%)

MagMAX™ CORE Lysis
350 μL 385 μL
Solution
MagMAX™ CORE Binding

350 μL 385 μL
Solution
x Solución de perlas magnéticas.
Realizar los cálculos para la cantidad de muestras a trabajar, siempre
incluir el 10% de excedente para compensar la imprecisión del pipeteo.
Tabla 04: Cantidad de reactivo por reacción para la solución de perlas
magnéticas
Componente Por reacción Por reacción (+10%)

MagMAX™ CORE Magnetic
20 μL 22 μL
Beads
MagMAX™ CORE Proteinase K 10 μL 11 μL
x Descongelar las muestras de suero sanguíneo y homogenizar.
3.3.3.1.2.2. Procedimiento para la extracción del material genético
1. En un vial criogénica marcar LU (solución de lisis unión), mezclar 385 μL
de MagMAX™ CORE Lysis Solution y 385 μL de MagMAX™ CORE
Binding Solution.
2. En un vial criogénico marcar PM (solución de perlas magnéticas), mezclar
22 μL de MagMAX™ CORE Magnetic Beads y 11 μL de MagMAX™
CORE Proteinase K.
35
3. Unión de ácidos nucleicos a las perlas magnéticas.
a. Para una reacción combinar en el siguiente orden:
Tabla 05: Combinación de reactivos por reacción
Combinar Componente Cantidad
1 PM (solución de perlas magnéticas) 30 μL
2 Suero 200 μL
Antes del paso 3: mezclar mediante pipeteo y dejar incubar 2 minutos
a T° Ambiente
3 LU (solución de lisis unión) 700 μL
b. Usar un vortex, agitar a una velocidad moderada por 3 minutos.
c. Usar un rack magnético, capturar las perlas. El tiempo de captura
es de 1 a 3 minutos.
d. Cuidadosamente aspirar y descartar todo el sobrenadante sin
remover la perlas.
e. Retirar los tubos del rack magnético.
4. Lavado de las perlas con MagMAX™ CORE Wash Solution 1.
a. Adicionar 500 μL de MagMAX™ CORE Wash Solution 1 a cada
tubo.
b. Usando un vortex, agitar a una velocidad moderada por 1 minuto.
c. Usar un rack magnético para capturar las perlas. El tiempo de
captura es de aproximadamente 1 minuto. Cuando la muestra se
torne transparente, las perlas habrán sido capturadas.
36
d. Cuidadosamente aspirar y descartar todo el sobrenadante sin
remover las perlas.
5. Lavado de las perlas con MagMAX™ CORE Wash Solution 2.
a. Adicionar 500 μL de MagMAX™ CORE Wash Solution 2 a cada
tubo.
b. Usar un vortex, agitar a una velocidad moderada por 1 minuto.
c. Usar un rack magnético para capturar las perlas. El tiempo de
captura es de aproximadamente 1 minuto, cuando la muestra se
torne transparente, las perlas habrán sido capturadas.
d. Cuidadosamente aspire y descarte todo el sobrenadante sin
remover las perlas.
6. Secado de las perlas.
a. Dejar el tubo abierto a temperatura ambiente durante 2 minutos
para que el alcohol restante de MagMAX™ CORE Wash Solution
2 se evapore.
b. Inspeccionar el tubo y si hay solución residual, quitar lo más posible

con una pipeta de punta fina, dejar el tubo abierto en el rack
magnético por otro minuto.
7. Elución de ácidos nucleicos.
37
a. Dejar el tubo abierto a temperatura ambiente durante 2 minutos
para permitir que el alcohol restante de MagMAX™ CORE Wash
Solution 2 se evapore.
b. Adicionar 90 μL de MagMAX™ CORE Elution Buffer pre calentado
a 65°C a cada tubo.
c. Usar un vortex, agite vigorosamente durante 3 minutos, la muestra
debe tornarse marrón, indicando la completa suspensión de las
perlas.
d. Usar un rack magnético capture las perla, la captura de tardar
aproximadamente 2 minutos.
e. Tener cuidado de no remover las perlas, transferir 90 μL de
sobrenadante a un vial criogénico limpio. No desechar el
sobrenadante; los ácidos nucleicos purificados están en el
sobrenadante.
3.3.3.1.3. Detección TR – PCR de un solo paso, para la identificación del
virus de la diarrea viral bovina
3.3.3.1.3.1. Preparación de las muestras y reactivos
x Esterilizar la cabina de flujo laminar de trabajo durante 15 minutos.
3.3.3.1.3.1.1 Reconstitución de los componentes del kit
x Girar cada tubo en una centrifuga antes de abrirlo. Esto asegura que la
mezcla liofilizada de la imprimación y la sonda se encuentre en la base
del tubo y no se derrame al abrir el tubo.
x Reconstituir los componentes del kit con agua libre de nucleasas.
38
Tabla 06: Cantidad de agua libre de nucleasas para la reconstitución de los
componentes del kit
Resuspender componentes en agua Volumen

Polyprotein (BVDV 1) primer/probe mix 165 μL
Polyprotein (BVDV 2) primer/probe mix 165 μL
BVDV 1 and BVDV 2 RT primer mix 165 μL
x Reconstituir los componentes del control positivo con el tampón de
preparación de plantillas.
Tabla 07: Cantidad de buffer de preparación de plantilla para la reconstitución
de los componentes del kit
Resuspender componentes en buffer de preparación de

Volumen
plantilla
Polyprotein (BVDV 1) positive control template 500 μL
Polyprotein (BVDV 2) positive control template 500 μL
x Agitar en un vortex cada tubo.
3.3.3.1.3.2. Procedimiento para la identificación del genotipo del virus de la
diarrea viral bovina por el método de TR-PCR de un solo paso
Los pasos del pipeteo deben realizarse en hielo.
1. Para cada muestra de ARN preparar una mezcla de reacción de acuerdo
con la siguiente tabla (se incluyó lo suficiente para los controles).
39
Tabla 08: Cantidad de reactivos para la preparación del master mix.
Componente Volumen
Oasig™ OneStep or precisión™ OneStep 2x Qrt-pcr 10 μL

MaterMix
BVDV2 or BVDV2 primer/probe mix 1 μL
RNAse/DNAse free water 4 μL
Volumen final 15 μL
2. Pipetear 15 μL de esta mezcla (master mix) en cada pocillo de acuerdo
con su configuración de placa experimental de PCR en tiempo real.
3. Pipetear 5 μL de plantilla de RNA sin diluir en cada pocillo de acuerdo con
la configuración de su placa experimental. Para el pocillo de control
negativo usar 5 μL de agua libre de RNAsa / DNAsa. El volumen final será
20 ul.
4. Pipetear 5 μL de control positivo tipo 1 y control negativo en el pocillo de
acuerdo a la configuración de placa experimental.
5. Pipetear 5 μL de control positivo tipo 2 y control negativo en el pocillo de
acuerdo a la configuración de placa experimental.
Se trabajó por separado los dos genotipos de la diarrea viral bovina (BVDV),
para una mejor comprensión.
40
3.3.3.1.3.2.1. Amplificación TR – PCR de un solo paso, para la identificación
del virus de la diarrea viral bovina
Tabla 09: Tiempos y temperaturas para la amplificación del PCR en tiempo real.
Paso Tiempo Temperatura
Transcripción inversa 10 minutos 42°C
Activación enzimática 2 minutos 95°C
Desnaturalización 10 segundos 95°C

50 CICLOS
Recopilación de datos 60 segundos 60°C
41
Flujograma de la metodología de la extracción del material genético
PASO 01: Esterilizar la PASO 02: Realizar la PASO 03: Realizar la

cabina, los materiales y mezcla de la solución mezcla de la solución
marcar los viales Perlas Magneticas Lisis unión (LU),
criogenios con el (PM), (A.11μL (A. 385 μL Lysis
numero de muestra. Proteinase K, B. 22 μL solution; B. 385 μL
Magnetic
Magnettic beads).
bea
ads). Binding solution).
s
solutio
on).
A A B
B
PASO 06: Con el rack PASO 05: Usando el PASO 04: Combinar
magnético capturar las vortex agitar a una 30 μL de PM, 200 μL
PM, durante 1 a 3 velocidad moderada e sue
de o y 700
suero 00 μ
μL de
minutos, descartar el durante
urante 3 minutos. LU.
U.
sobrenadante sin
remover las PM y sin
retirar los viales
criogénicos del rack
magnético.
PASO 08: Usando PASO 09: Con el rack

el vortex agitar a magnético capturar las PM,
una velocidad durante 1 a 3 minutos, se
moderada durante descartar el sobrenadante
PASO 07: Adicionar
sin remover las PM ni
500 μL de Wash 1 minutos.
retirar los viales
Solution
Solution 1 a cada tubo.
on
o criogénicos del rack
magnético.
agnético.
PASO 12: Con el rack PASO 11: Usando PASO 10:

magnético se capturo las un vortex se agitó Adicionar 500
PM, durante 1 a 3 minutos, a una velocidad μL de Wash
se descartó el sobrenadante moderada durante Solution 2 a
sin remover ni retirar los 1 minutos. cada tubo.
cada tubo
o.
viales criogénicos del rack
magnético.
agnético.
42
PASO 13: Dejar abierto los PASO 15: Usando el
viales criogénicos por 2 PASO 14: vortex agitar a una
minutos para que el alcohol Adicionar 90 μL de velocidad moderada
restante de wash solution 2 on Buff
Elution fer.
Buffer. durante 3 minutos.
se evapore.
PASO 17: Con cuidado transferir PASO 16: Con el rack

90 μL de sobrenadante a un vial magnético capturar las
criogénico. perla magnéticas, durante
2 minutos.
Se extrajó el material genético (RNA) de 14

muestras suero.
uest as de sue o
42
Flujograma para reconstitución de los componentes del kit para la
identificación del genotipo del virus de la diarrea viral bovina por el método
de PCR Tiempo real
x Reconstitución de VDVB-1 primer/probe mix y VDVB-2 primer/probe mix
PASO 01: Agregar 165 μL de PASO 02: Para PASO 03:

agua libre de RNAsa/DNAsa garantizar la Centrifugar.
a cada tubo de VDVB-1 resuspensión
primer/probe mix y VDVB-2 completa agitar en
primer/probe
mer/probe mix. el vortex.
x Reconstitución de BVDV-1 positive control template, BVDV-2 positive control
template
PASO 01: Agregar 500 μL de PASO 2: Para PASO 03:

baffer de preparación de garantizar la Centrifugar.
plantilla a cada tubo de resuspensión
BVDV-1 positive control completa agitar en el
template, BVDV-2 positive vortex.
control
o t o tetemplate.
p ate
43
Flujograma de la metodología para la identificación del genotipo del virus
de la diarrea viral bovina por el método de PCR Tiempo real
PASO 01: Esterilizar la PASO 02: Configurar el equipo del

cabina para la -PCR
RT-PCR
preparación de las
mezclas
ezclas (master mix).
PASO 4: Combinar 15 μL de master PASO 03: Combinar 15 μL de master

mix en cada tubo de reacción rápida, mix en cada tubo de reacción rápida, 5
5 μL de control positivo tipo 2 en el μL de control positivo tipo 1 en el tubo
tubo de reacción rápida para el control de reacción rápida para el control
positivo, 5 μL de agua libre de positivo, 5 μL de agua libre de
RNAsa/DNAsa en el tubo de reacción RNAsa/DNAsa en el tubo de reacción
rápida del control negativo, 5 μL de
rápida del control negativo, 5 μL de
RNA sin diluir en cada tubo de
RNA sin diluir en cada tubo de reacción
reacción rápida de acuerdo con la
configuración de la placa rápida de acuerdo con la configuración
experimental
erimental de RT-PCR. de
e la placa experimental de RT-PC
RT-PCR.
PASO 05: Sellar los PASO 06: Agitar en PASO 07: Ubicar cada
tubos de reacción el vortex los pocillos pocillo de acuerdo con la
rápida con sus a una velocidad configuración de la placa
respectivas tapas, para moderada para experimental y se dio
evitar la contaminación garantizar la inicio a la amplificación en
homogeneidad de RT-PCR.
de las muestras.
las mezclas.
44
3.3.3.1.4. Validación de la prueba.
Para la validación de la prueba el valor del Ct (Ciclo umbral) del control
positivo tiene que ser menor de 30 y la extracción del control no presentara señal.
Tabla 10: Criterios para la ejecución valida de PCR – tiempo real
Tipos de reacción Valor de Ct para RNA

de VDVB
Control positivo <30
Extracción del control 40 (sin señal)
3.3.3.1.5. Interpretación de resultados
Se considera como positivo a las muestras cuyo valor de Ct (ciclo umbral)
sean menores de 38, como negativo a las muestras que no presentaron señal
por ende no tienen Ct y es sospechoso cuando el valor del Ct se encuentra entre
≥38 y <40 dichas muestras tendran que volver a ser evaluadas.
Tabla 11: Interpretación de los resultados de las pruebas de muestra individual
Valor Ct para el RNA

Interpretación
de BVDV
Muestra positiva para
<38
VDVB
Muestra negativa para
VDVB
Consulte solucion de
problemas si el valor de
40 sin señal
CT para xeno™ RNA
control es 38 en una
muestra negativa para
VDVB
≥38 y <40 Resultado sospechoso.
45
CAPITULO IV
RESULTADOS Y DISCUSIONES
4.1 GENOTIPIFICACIÓN DEL VIRUS DE LA DIARREA VIRAL BOVINA (VDVB)
Tabla 12: Valor del Ct (Ciclo umbral) de las muestras, control positivo, control
negativo para el genotipo 1 del Virus de la Diarrea Viral Bovina (VDBV-1)
N° Ct Ct Ct
Muestra/Distrito VDVB-1 Control positivo Control negativo
130 Zurite 24.8 27.7
215 Zurite 24.7 27.7
122 Zurite 23.2 27.7
16 Huarocondo 24.4 28.3
43 Cachimayo 24.5 28.3
5 Cachimayo 22.2 28.3
112 Cachimayo 18.0 23.6
SIN SEÑAL
37 Anta 18.1 23.6
4 Anta 18.1 23.6
281 Ancahuasi 18.2 23.6
216 Ancahuasi 24.3 28.2
130 Ancahuasi 24.4 28.2
28 Ancahuasi 24.3 28.2
348 Ancahuasi 18.1 23.6
En la tabla 12 se observa las muestras 130 Zurite, 215 Zurite, 122 Zurite,
16 Huarocondo, 43 Cachimayo, 5 Cachimayo, 112 Cachimayo, 37 Anta, 4 Anta,
281 Ancahuasi, 216 Ancahuasi, 130 Ancahuasi, 28 Ancahuasi, 348 Ancahuasi,
cuyo Ct (Ciclo umbral) del VDVB-1 son 24.8, 24.7, 23.2, 24.4, 24.5, 22.2, 18,
18.1, 18.1, 18.2, 24.3, 24.4, 24.3, 18.1 respectivamente, el Ct del control positivo
27.7, 27.7, 27.7, 28.3, 28.3, 28.3, 23.6, 23.6, 23.6, 23.6, 28.2, 28.2, 28.2, 23.6
respectivamente, el Ct del control negativo no presenta señal.

46
Tabla 13: Valor del Ct (Ciclo umbral) de las muestras, control positivo, control
negativo para el genotipo 2 del Virus de la Diarrea Viral Bovina (VDVB-2)
Ct Ct Ct
N° Muestra-Distrito
BVDV-2 Control positivo Control negativo
130 Zurite
215 Zurite
122 Zurite
16 Huarocondo 28.2
43 Cachimayo
5 Cachimayo
112 Cachimayo
SIN SEÑAL SIN SEÑAL
37 Anta
4 Anta
281 Ancahuasi
216 Ancahuasi 28.4
130 Ancahuasi
28 Ancahuasi
348 Ancahuasi
En la tabla 13 se observa las muestras 130 Zurite, 215 Zurite, 122 Zurite,
16 Huarocondo, 43 Cachimayo, 5 Cachimayo, 112 Cachimayo, 37 Anta, 4 Anta,
281 Ancahuasi, 216 Ancahuasi, 130 Ancahuasi, 28 Ancahuasi, 348 Ancahuasi,
cuyo Ct (Ciclo umbral) VDVB-2 no presentan señal, el Ct del control positivo en
los distritos de Zurite, Huarocondo y Cachimayo es 28.2 y en los distritos de Anta
y Ancahuasi es de 28.4, Ct del control negativo no presenta señal.
47
Tabla 14: Resultado para la genotipificación del Virus de la Diarrea Viral Bovina
(VDVB-1, VDVB-2) en los distritos de Ancahuasi, Anta, Cachimayo, Zurite y
Huarocondo
N° Positivo Positivo
Ditrito muestras BVDV-1 BVDV-2
Ancahuasi 5 5 0
Anta 2 2 0
Cachimayo 3 3 0
Zurite 3 3 0
Huarocondo 1 1 0
TOTAL 14 14 0
En la tabla 14 se observa un total de 14 muestras de vacunos evaluados,
donde 5 son muestras del Distrito de Ancahuasi, 2 son muestras del distrito de
Anta, 3 son muestras del Distrito de Cachimayo, 3 muestras del Distrito de Zurite
y 1 es muestra del Distrito de Huarocondo, las 14 muestras evaluadas son
positivos al genotipo 1 de la Diarrea Viral Bovina (VDVB-1) y ninguna muestra
evaluada es positivo al genotipo 2 del Virus de la Diarrea Viral Bovina (VDVB-2).
Los resultados obtenidos en el presente trabajo son: De las 14 muestras
evaluadas de los Distritos de Ancahuasi, Anta, Cachimayo, Zurite y Huarocondo.
Las 14 muestras son positivos al genotipo 1 del Virus de la Diarrea Viral Bovina
(VDVB-1) y ninguno al genotipo 2 del Virus de la Diarrea Viral Bovina (VDVB -2).
Este resultado es similar con el trabajo realizado por (Araínga et al., 2010)
en Arequipa, Cajamarca, Junin, La Libertad, Lima y Puno, que evaluó 55
muestras de animales sospechosos, fueron procesadas mediante la prueba
TR - PCR usando primers específicos para cada genotipo viral, indico que 14 de
48
55 muestras fueron positivas al genotipo VDVB-1, siendo el 25% del total de
muestras evaluadas y ninguna al genotipo VDVB-2, los resultados son similares
al presente trabajo al no encontrarse positivos al genotipo 2 (VDVB-2); la
presencia del genotipo 1 (VDVB-1) se debería a que dicho genotipo es el más
difundido en poblaciones bovinas de muchos países como es el caso de EEUU
de donde el Perú importo bovinos sin restricción respecto al Virus de la Diarrea
Viral Bovina, la ausencia o baja prevalencia del genotipo VDVB-2 puede deberse
a una baja prevalencia o bajo número de cepas analizadas (14 muestras) a
comparación con el número de cepas analizadas en otras estudios donde sí se
detectó ambos genotipos.
Por otro lado (Stahl et al., 2009) aisló 25 muestras Persistentemente
Infectados (PI) siendo 15 muestras originarias del Perú y 10 muestras originarias
de Chile, fue procesada por el método TR-PCR donde se muestra que las 25
cepas pertenecen al genotipo 1 y ninguna cepa pertenece al genotipo 2, los
resultados son iguales a los obtenidos en el presente trabajo al no encontrar
positivos al genotipo 2, la ausencia del genotipo 2 puede deberse a que en el
Perú la vacuna empleada es a virus inactivado y la vacunación no es una práctica
común (Wageck et al., 1998)(Flores et al., 2000).
También (Gollán et al., 2006) en San Cristóbal de la provincia de Santa
Fe (Argentina) en la cuenca lechera santafesina, las muestras fueron
procesadas por Aislamiento Viral (AV), Neutralizacion Viral (NV),
inmunoflorescencia directa (IFD), técnicas histológicas y mediante la prueba de
TR - PCR, ha reportado variabilidad entre las cepas del VDVB, que se manifiesta
por la existencia de los biotipo CP y NCP y los tipo virales 1 y 2, los análisis
realizados revelan un 90-98% de homología con las cepas de genotipo 1, no
49
encontrándose cepas genotipo 2, los resultados son iguales a los obtenidos en
el presente trabajo no encontrando positivos al genotipo 2, esto puede deberse
al bajo número de muestras evaluadas y también a la degradación del RNA viral
debido a factores como tiempo de permanencia e inadecuada conservación de
las muestras sobre todo en los primeros años de colección.
También (Morrell et al., 2014) en seis establecimientos de la provincia de
Buenos Aires (Argentina), las muestras fueron procesadas mediante el método
de RT - PCR, donde en un caso se aisló la cepa NCP perteneciente al genotipo
II y en dos casos se aisló la cepa CP el cual permite el cuadro de Enfermedades
de las Mucosas, los resultados son diferentes a los obtenidos en el presente
trabajo ya que dicho autor encontró la presencia del genotipo1 y genotipo 2, lo
cual puede deberse a que las muestras evaluadas fueron colectadas y
procesadas en el momento, también a que en Argentina la vacunación es una
práctica constante.
En los resultados de la genotipificación, se considera como positivo a la
honda de la muestra que se levanta junto a la honda del control positivo y la
honda de control negativo se debe mostrar de forma lineal, la validación de los
resultados se realiza con el valor del Ct (Ciclo umbral).
La amplificación de las muestras fue procesada de forma individual
usando diferentes controles positivos.
50
Grafico 01: Resultado del genotipo 1 del Virus de la Diarrea Viral Bovina
(VDVB-1) de la muestra 130 del distrito Zurite
0.2
CONTROL POSITIVO (genotipo 1)(27.7) CONTROL NEGATIVO 130 ZURITE(24.8)
En el gráfico 1 se muestra la amplificación del genotipo 1 de la muestra
130 del distrito de Zurite, siendo su Ct (Ciclo umbral) 24.8, teniendo el Ct del
control positivo 27.7 resultando la muestra positivo al genotipo 1.
51
(VDVB-1) de la muestra 215 del distrito de Zurite
0.2
control positivo 27.7; resultando la muestra positivo al genotipo 1.
52
(VDVB-1) de la muestra 122 del distrito de Zurite
0.2
53
(VDVB-1) de la muestra 16 del distrito de Huarocondo
0.2
CONTROL POSITIVO (genotipo 1)(28.3) CONTROL NEGATIVO 16 HUAROCONDO(24.4)
16 del distrito de Huarocondo, siendo su Ct (Ciclo umbral) 24.4, teniendo el Ct
del control positivo 28.3; resultando la muestra positivo al genotipo 1.
54
(VDVB-1) de la muestra 43 del distrito de Cachimayo
0.2
CONTROL POSITIVO (genotipo 1)(28.3) CONTROL NEGATIVO 43 CACHIMAYO(24.5)
43 del distrito de Cachimayo, siendo su Ct (Ciclo umbral) 24.5, teniendo el Ct del
55
0.2
En el gráfico 6 se muestra la amplificación del genotipo 1 de la muestra 5
del distrito de Cachimayo, siendo su Ct (Ciclo umbral) 22.2, teniendo el Ct del
56
0.2
112 del distrito de Cachimayo, siendo su Ct (Ciclo umbral) 18.0, teniendo el Ct
57
(VDVB-1) de la muestra 37 del distrito de Anta
0.2
CONTROL POSITIVO (genotipo 1)(18.1) CONTROL NEGATIVO 37 ANTA(23.6)
En el gráfico 8 se muestra la amplificación del genotipo 1 de la muestras
37 del distrito de Anta, siendo su Ct (Ciclo umbral) 23.6, teniendo el Ct del control
positivo 18.1; resultando la muestra positivo al genotipo 1.
58
(VDVB-1), de la muestra 16 del distrito de Anta
0.2
CONTROL POSITIVO (genotipo 1)(23.6) CONTROL NEGATIVO 4 ANTA(18.1)
En el gráfico 9 se muestra la amplificación del genotipo 1 del distrito de
Anta de la muestra 4, siendo su Ct (Ciclo umbral) 18.1, teniendo el Ct del control
positivo 23.6; resultando la muestra positivo al genotipo 1.
59
(VDVB-1) de la muestra 281 del distrito de Ancahuasi
0.2
CONTROL POSITIVO (genotipo 1)(18.2) CONTROL NEGATIVO 281 ANCAHUASI(23.6)
281 del distrito de Ancahuasi, siendo su Ct (Ciclo umbral) 23.6, teniendo el Ct
60
(VDVB-1) de la muestra 216 distrito Ancahuasi
0.2
61
(VDVB-1) de la muestra 130 del distrito Ancahuasi
0.2
62
0.2
28 del distrito de Ancahuasi, siendo su Ct (Ciclo umbral) 24.3, teniendo el Ct del
63
0.2
64
(VDVB-2), de la muestra 130; 215; 122 del distrito de Zurite, 16 del distrito de
Huarocondo y 43; 5; 112 del distrito de Cachimayo
0.2
CONTROL POSITIVO (genotipo 2)(28.2) CONTROL NEGATIVO 130 ZURITE
215 ZURITE 122 ZURITE 16 HUAROCONDO 43 CACHIMAYO
5 CACHIMAYO 112 CACHIMAYO
En el gráfico 15 se muestra la amplificación del genotipo 2 de las muestras
130; 215; 122 del distrito de Zurite, de la muestra 16 del distrito de Huarocondo,
de las muestras 43; 5; 112 del distrito de Cachimayo, los cuales fueron negativos
por que no presentaron señal fluorescencia, teniendo el Ct del control positivo
28.2; resultando las muestras negativo al genotipo 2.
65
(VDVB-2), de las muestras 37; 4 del distrito de Anta, las muestras 281; 216;
130; 28; 248 del distrito Ancahuasi
0.2
CONTROL POSITIVO (genotipo 2)(28.4) CONTROL NEGATIVO 37 ANTA
4 ANTA 281 ANCAHUASI 216 ANCAHUASI 130 ANCAHUASI
28 ANCAHUASI 348 ANCAHUASI
En el gráfico 16 se muestra la amplificación del genotipo 2 de las muestras
37; 4 del distrito de Anta, de las muestras 281; 216; 130; 28; 248 del distrito de
Ancahuasi, los cuales fueron negativos por que no presentaron señal de
fluorescencia, teniendo el Ct del control positivo 28.2; resultando las muestras
negativo al genotipo 2.
66
CAPITULO V
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
5.1 CONCLUSIONES
1. En las 14 muestras evaluadas se determinó la presencia del genotipo 1
del Virus de la Diarrea Viral Bovina (VDVB-1) y la ausencia del genotipo
2 del Virus de la Diarrea Viral Bovina (VDVB-2), en vacas de la pampa de
67
5.2 RECOMENDACIONES.
1. Basándonos en los resultados obtenidos en este trabajo de investigación,
se recomienda eliminar a los animales Persistentemente Infectados (PI)
ya que son los principales focos de diseminación del Virus de la Diarrea
Viral bovina.
2. Basándonos a los resultados obtenidos en este trabajo se recomienda
crear una vacuna específico contra el genotipo presente en el Perú para
tener un control de la enfermedad.
3. Implementar medidas de bioseguridad manteniendo a los animales
adquiridos por los pobladores en cuarentena, para evitar la propagación
de la enfermedad.
4. Realizar charlas o capacitaciones a las poblaciones para brindar un mayor
conocimiento de la enfermedad.
68
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75
ANEXOS
76
Anexo 01: Ambiente de Reacción de la Cadena de la Polimerasa en Tiempo
Real (RT- PCR)
77
Anexo 02: Materiales para la extracción del material genético y detección del
genotipo del Virus de la Diarrea Viral Bovina (VDVB)
A B
D E
F G H I
J K L
(A. Lentes, B. Mandil descartable, C. gorro, D. Barbijo, E. Guantes de latex, F.
Cabina de bujo laminar, G. Vortex, H. Pipetas, I. Tips esteriles, J. Multi portador
de tubo para el vortex, K. Rack magnetico, L. Viales criogénicos).
78
Anexo 03: Reactivos para la extracción de material genético
A B
C D
E
G
F
A.Wash solution 1, B. Wash solution 2, C. Lysis solution, D. Binding solution, E.
Elution buffer, F. Magnetic beads, G. Proteinase K (Los reactivos mantener a T°
ambiente).
Anexo 04: Reactivos para la identificación del genotipo del Virus de la Diarrea
Viral Bovina (VDVB)
A B C D E F G
A. BVDV1 primer/probe mix, B. BVDV2 primer/probe mix, C. BVDV1 positive
control template, D. BVDV2 positive control template, E. Template prepration
buffer, F. RNAse/DNAse free water, G. BVDV1 and BVDV2 RT primer mix (los
reactivos mantener en hielo durante todo el proceso).
79
Anexo 05: Registro de vacunos Persistentemente Infectados (PI) de los distritos de Anta, Ancahuasi, Huarocondo, Cachimayo y
Zurite.
DISTRITO DE ZURITE
Mayores a 6 meses
NOMBRE / DENSIDAD COCIENTE
N° SECTOR NOMBRE/ PROPIETARIO N° MUESTRA ANIMAL OPTICA M/P DIAGNOSTICO
7 Ancachuro 130 s/n 0.618 0.3175 POSITIVO
119 Ancachuro Santusa Succno Paguada 215 Blanca 0.519 0.3108 POSITIVO
Tambo
182 Real Doris Sinchi 122 Candy 0.504 0.2244 POSITIVO
DISTRITO DE HUAROCONDO
3 - 4 Años
NOMBRE/ NOMBRE / DENSIDAD COCIENT
N° SECTOR PROPIETARIO N° MUESTRA ANIMAL OPTICA E M/P DIAGNOSTICO
Dalmata chata
1 Rawanqui Comunidad 16 cachuda 0.754 0.4736 POSITIVO
80
DISTRITO DE CACHIMAYO
1 - 2 Años
NOMBRE/ NOMBRE / DENSIDAD COCIENTE
N° SECTOR PROPIETARIO N° MUESTRA ANIMAL OPTICA M/P DIAGNOSTICO
12 Alamos Walter Curi La Torre 43 Cria de Rosa 0.477 0.1657 POSITIVO
2 - 3 Años
Quinta Johan Paucarmayta
15 Cajamarca Becerra 5 Rosi 0.557 0.2857 POSITIVO
5 - 6 Años
36 Granja 3 Leon Salas Carlos 112 Gilberta 0.451 0.1631 POSITIVO
DISTRITO DE ANTA
4 - 5 Años
9 Compone Hilario Cantoy Vargas 37 Bartola 0.616 0.5300 POSITIVO
81
2 - 3 Años
14 Occoruro Camilla Ana Maria 4 Pancha 0.851 0.5850 POSITIVO
DISTRITO DE ANCAHUASI
Mayores a 6 meses
Hermelinda Castillo
5 Catañiray Bañares 281 Rosa 0.559 0.4336 POSITIVO
2 - 3 Años
12 Ichubamba Franklin Ccancha 216 Flora 0.888 0.3040 POSITIVO
Asoc. Misti
15 Soccomarca Yoni Mendoza A. 130 Fany 0.553 0.1560 POSITIVO
125 Catañiray Arturo Ccapcha Kunchu 348 Nicolasa 0.645 0.3485 POSITIVO
1 - 2 Años
103 San Martin Cirila Huallparimachi 28 Justina 0.834 0.2801 POSITIVO
82
83

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN ANTONIO ABAD

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS

ESCUELA PROFESIONAL DE ZOOTECNIA

“IDENTIFICACIÓN DEL GENOTIPO DEL VIRUS DE LA DIARREA VIRAL

Tesis presentada por la Bachiller en

MILAGROS CENTENO FLORES,

Para optar al título profesional de

M.V.Z. EDGAR ALBERTO VALDEZ

ING. ZOOT. FIORELA KATTERINE

“PATROCINADOR: Proyecto “Evaluación de la Eficiencia Reproductiva en

más grandes metas trazadas en mi vida.

una persona de bien.

PAPÁ LEONCIO Y MAMÁ DEMETRIA.

A mis hermanos quienes son mis compañeros de locuras y alegrías, quienes

siempre me motivaron a continuar a pesar de los obstáculos, por la confianza

que depositaron en mí.

WILSON, FREDY, CINTHYA, WILMAR

A mis amigos, compañeros incondicionales quienes siempre me apoyaron,

estuvieron conmigo en los buenos y malos momentos, por siempre haberme

ALEXANDRA, MARGOT, JENNY, CRISTIAN

la comprensión y confianza depositaron en mí.

A la facultad de Ciencias Agrarias por haberme brindado la oportunidad de

A todos mis docentes de la escuela profesional de zootecnia por compartir sus

valiosos conocimientos en sus enseñanzas durante mi formación académica.

Mi especial reconocimiento al proyecto de investigación “Evaluación de la

Eficiencia Reproductiva en Vacas de la Pampa de Anta VIA CANON – UNSAAC”,

por el financiamiento brindado para la ejecución de este proyecto de

Mi especial gratitud a mi asesor el M.V.Z. Edgar Alberto Valdez Gutiérrez, quien

con su comprensión, su apoyo incondicional, confianza que me brindo,

conocimientos compartidos y sobre todo por el asesoramiento en la ejecución

del presente trabajo de investigación.

Mi especial gratitud a mi asesora Ing. Zoot. Fiorela Katterine Fernández Bustinza,

el asesoramiento en la ejecución del presente trabajo de investigación.

durante mi formación académica, gracias a cada uno, por ayudarme a crecer

como persona y por la amistad que me brindaron.

PROBLEMA OBJETO DE INVESTIGACIÓN .................................................... 3

OBJETIVOS Y JUSTIFICACIÓN ....................................................................... 5

1.1. OBJETIVOS ............................................................................................. 5

1.1.1. Objetivo general ................................................................................. 5

1.1.2. Objetivo especifico ............................................................................. 5

1.2. JUSTIFICACIÓN ...................................................................................... 6

MARCO TEORICO ............................................................................................ 7

2.1. ANTECEDENTES DE LA INVESTIGACIÓN ............................................ 7

2.2. BASES TEORICAS ................................................................................ 10

2.2.1. Diarrea Viral Bovina (DVB). ............................................................. 10

2.2.2. Agente etiológico ............................................................................. 10

2.2.2.1. Taxonomía y estructura ................................................................ 10

2.2.3. Clasificación ..................................................................................... 11

2.2.3.1. Genotipo y biotipos ....................................................................... 11

2.2.4. Patogénesis ..................................................................................... 14

2.2.4.2. Complejo respiratorio .................................................................... 15

2.2.4.3. Complejo diarrea neonatal bovina ................................................ 15

2.2.4.4. Infección subclínica ...................................................................... 16

2.2.4.10. Síndrome Hemorrágico ................................................................. 18

2.2.6. Diagnostico ...................................................................................... 18

2.2.7. Epidemiologia .................................................................................. 19

2.2.8. Prevención y control ........................................................................ 22

2.3 BASES CONCEPTUALES ..................................................................... 24

2.3.1. Prueba de PCR en tiempo real (TR - PCR) ..................................... 24