Informe Teórico Primers

INFORME TEÓRICO
Importancia
Se buscó el primer designado en BLAST, así se descubrió que se trata del gen TMPRSS6,
además descubrimos que este se encuentra en la especie “Homo Sapiens”. Buscamos el
gen TMPRSS6 en el NCBI por información relevante: El den se expresa en las células
eucariotas, codifica una proteína transmembrana serina proteinasa que se encuentra en la
superficie celular, es de importancia para el remodelamiento y mantenimiendo del hígado;
se encuentra en el cromosoma 22 en los brazos largos “q”, consta de 22 exones por lo que
tiene 21 intrones.
Para evaluar de dónde tomar la muestra se estudia sus lugares de mayor expresión, siendo
el hígado el lugar de excelencia, es decir, una biopsia del hígado podría ser ideal, sin
embargo, buscamos diferentes estudios en los que se declara que también se peude tomar
muestra de la saliva o plasma sanguíneo.
Como se mencionó anteriormente se buscó en BLAST los primers designados. Se
confirma su selectividad en la especie Homo Sapiens
De igual manera con el Reverse

Evaluamos la estabilidad de cada primer tanto del foward como el Reverse
Foward Análisis
Horquillas Foward
Se evidencia un delta G de -1.25 por lo que se infiere que es muy improbable que se
formen horquillas
Homodímeros Foward - Foward
El primer resultado es una sumatoria asique se desprecia, desde el segundo resultado en

adelante todos los deltas G no alcanzan los -10 por lo que se les considera estables.
Heterodímeros Forward - Reverse

Reverse Análisis
Reverse Horquillas
Se evidencia un delta G de -1.41 por lo que se infiere que es muy improbable que se
formen horquillas
Homodímeros Reverse - Reverse

Protocolo Extracción ADN y Electroforesis:

Se opta por emplear el método de columnas por su limpieza, eficacia y cuidado del
material genómico.
Genomic DNA Mini Kit: Extracción ADN

• Extraemos 3 mL sangre de un compañero y lo almacenamos en un tubo morado
(contiene EDTA), el EDTA nos servirá como anti coagulante así evitaremos que
la sangre cambie su consistencia.
• Transferimos 300uL de la muestra de sangre a un tubo de microcentrífuga de
1.5mL
• Añadimos el triple del volumen de muestra de buffer lisis, es decir 900uL, este
servirá para lisar las células con material genético presente (leucocitos).
• Incubar el tubo por 10 minutos a temperatura ambiente, se da la lisis celular
• Se centrifuga a 10000 rpm durante 5 minutos, esto provocará la separación de
fases, tendremos los compuestos de interés en el fondo por su peso molecular
mientras que los compuestos de bajo interés permanecerán como sobre nadante,
retiramos el sobre nadante porque no es de utilidad, tener cuidado de no absorber
la fase del fondo.
• Añadimos 100uL de buffer lisis para resuspender los leucocitos que quedaron en
el fondo.
• Añadimos 200uL de GB buffer, este servirá para mantener un ambiente adecuado
para el ADN y evitamos su ruptura.
• Incubamos a 60°C por al menos 10 minutos para asegurarnos que el lisado esté
completo, mientras cada 3 minutos vamos agitando el tubo de microcentrífuga. Al
mismo tiempo vamos pre calentando el ET Buffer que se empleará más adelante
pero por mientras calentamos el ET buffer a 60°C.
• Opcional: Se recomienda agregar 5uL de RNAsas para degradar el ARN presente
pero se optó por lo hacerlo puesto que el ARN es volátil y se desprenderá por sí
solo.
• Agregamos etanol absoluto 200uL y agitamos vigorosamente 10 segundos, si se
forma un precipitado muy grande debemos romperlo con una pipeta, lo que se
espera en este paso es precipitar el ADN.
• Colocamos todo lo tratado en una columna GD y esta la colocamos encima de un
tubo colector de 2mL, centrifugamos a 16000 rmp durante 5 minutos, lo que se
espera es que todos los componentes fluyan através de la columna y reposen en el
tubo colector mientras que el ADN precipitado se mantendra en la columna.
• Descartamos el tubo colector y colocamos la columna en un nuevo tubo colector
de 2mL, se añade 400uL de W1 Buffer a la columna y se centrifuga a 16000rpm
por 60 segundos, el propósito del W1 buffer, es lavar al ADN precipitado, de ser
el caso que alguna materia sea metal o remanentes de proteína se le quedara
adherido con el W1 vamos a retirarlo y a eluirlo a través de la columna.
• Se descarta el tubo colectos y la columna se le coloca en otro tubo colector de
2mL y se agrega 600uL de Wash buffer para seguir limpiando y purificando el
ADN, se centrifuga a 16000 rmp por 60 segundos, se descarta el tubo colector
• Se coloca la columna sobre un nuevo tubo colector pero no se le añade nada a la
columna, se centrifuga a 16000rmp por 3 minutos, este paso es para secar el ADN
y la columna.
• Transferimos la Columna a un tubo eppendorf, esta vez le agregaremos 100uL de
el precalentado Elution Buffer y se deja reposar por 3 minutos, este va a diluir el
agua de modo que cuando centrifuguemos el ADN atraviese la columna y repose
en el tubo eppendorf, se centrifuga a 16000 rmp por 30 segundos.
• Se conserva el tubo eppendorf con ADN en la refri o se utiliza al momento para
electroforesis o PCR.
Electroforesis:
Básicamente vamos a inducir un desplazamiento de la muestra según su tamaño y
carga.
• Se prepara el gel de agarosa a 1%, este se prepara con buffer TAE 1X, se calienta
hasta ser traslúcido y se agrega safeview para poderlo visualizar en la cámara UV,
alcanzado este punto se le vierte sobre sobre la cabina de electroforesis y se deja
enfriar, mientras enfría se le perfora con unos “dientes” estos dejarán pozos donde
posteriormente se sembrará la muestra preparada. Se opta por una concentración al
1% por que concentraciones mayores dificultarían el viaje del ADN y concentraciones
menores lo facilitarían demasiado o volverían quebradizo el gel.
• Una vez el gel esté gelificado se retiran los dientes se le sumerge en buffer TAE
0.5X, debe sumergirlo hasta 5 mm por encima del gel. El buffer TAE también dará un
pH de 8.2 – 8.4.
• Para preparar la muestra la mezclamos con loading buffer (8uL de muestra + 2uL
de Loading) este se utiliza para darle densidad a la muestra así esta podrá ir hasta la
profundidad del pozo y no se quedará “flotando”, para que la electroforesis funcione
la muestra debe migrar por el medio del gel y no por encima, además que si no le
damos densidad esta se irá flotando y perderemos la muestra, adicionalmente a la
muestra con loading buffer se le agrega safegreen, este es un intercalante que en la
cámara de rayos UV nos permitirá ver la migración de la muestra preparada.
• Una vez sembrada la muestra preparada en un pozo se enciende la cámara
electroforética, 100 voltios por 20 minutos, una vez terminado este tiempo se le
observa en la cámara de rayos UV, en la que se puede diferenciar el gel de la muestra
corrida, el ADN se observa una leve migración en la parte superior del gel. En realidad
la potencia del voltaje y el tiempo varían según la disponibilidad del investigador pero
debemos tener en cuenta que a más voltaje menor tiempo requerirá y que el lado
negativo debe ir junto los pozos donde se siembra la muestra.

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De igual manera con el Reverse

Homodímeros Foward - Foward

El primer resultado es una sumatoria asique se desprecia, desde el segundo resultado en

El primer resultado es una sumatoria asique se desprecia, desde el segundo resultado en

Homodímeros Reverse - Reverse

Protocolo Extracción ADN y Electroforesis:

Genomic DNA Mini Kit: Extracción ADN

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