UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA

LA MOLINA

FACULTAD DE INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

“DETERMINACIÓN DE LA DIGESTIBILIDAD IN VITRO DE LA

PROTEÍNA”
CURSO:
ALIMENTACIÓN Y NUTRICIÓN HUMANA

GRUPO: 1 “LOS POLIFENOLES”

ESTUDIANTES:

● HIJAR VARGAS, MAIRA ALEXANDRA

● OLIVA VALDERA, JEAN PIERO LEONARDO
● PALPA DIAZ, LESSLIE JULISSA
● REYES SANTOS, MARCO ANTONIO

LIMA – PERÚ

2022
 I. INTRODUCCIÓN
La soya es una fuente rica en aceite y proteínas donde la FDA recomendó que un consumo
de 25 gramos por día de proteína de soya reduce el riesgo de una cardiopatía. Las semillas
se procesan para obtener harina o leche de soya, esta proteína iguala a la proteína
proveniente de los alimentos de origen animal. Es por eso que para los seres humanos y los
animales monogástricos las semillas de soya son tóxicas, por lo que requieren de
tratamiento térmico para destruir los inhibidores de la tripsina (Islas & Higuera, 2002).

Al saber que la caseína es la proteína espesa de la leche de vaca y que su consumo impide
la absorción de nutrimentos (calcio), esto último ocurre porque al consumir proteínas
animales, el pH de la sangre se vuelve ácido y el organismo por naturaleza saca parte del
calcio que tenemos en los huesos para poder neutralizar esa acidez. La caseína misma
siendo una sustancia difícil de eliminar por nuestro organismo, en ciertas personas se
adhiere a los vasos linfáticos del intestino y así ocasionan problemas inmunológicos,
alergias y hasta asma. Es en este caso al decir que, vivir sin alimentos lácteos no es
impedimento para tener huesos y dientes fuertes, y que la mejor manera de adquirir calcio
son las fuentes vegetales (Pérez, 2013).

Por lo cual se controla mediante el método enzimático (mezcla de tripsina, quimiotripsina

y peptidasa) para una hidrólisis y con ello se pueda determinar el grado de digestibilidad.
Con ventajas de un menor costo y determinar la calidad de la proteína en alimentos
procesados, y que para un estudio nutricional se recomienda el ensayo in vitro propuesto.
Por lo tanto los objetivos de la siguiente práctica fueron:

- Conocer un método seguro y práctico para la determinación del grado de

digestibilidad in vitro de proteínas, con bastante aproximación a las condiciones
reales; utilizando para la hidrólisis un sistema multienzimático de Tripsina,
Quimiotripsina y Peptidasa.

- Confeccionar para cada muestra analizada un gráfico de pH versus tiempo de

incubación, teniendo como tiempo máximo 10 minutos e interpretar los resultados.
 II. REVISIÓN DE LITERATURA
2.1. Proteína

Tanto las proteínas como los ácidos nucleicos forman el grupo de moléculas responsables
de toda la información biológica. Las proteínas juegan un papel central en los sistemas
biológicos. Los microorganismos tienen al menos cerca de 3000 clases de proteínas que
cubren una variedad de funciones: estructura, transporte, movimiento, defensa,
reconocimiento, almacenamiento y funciones catalíticas de las enzimas (Badui, 2006).

2.1.1. Calidad de las proteínas

Existen dos factores que determinan el valor nutricional de una fuente proteica, ya que
cubren los requerimientos de nitrógeno y aminoácidos que aseguran el adecuado
crecimiento y mantenimiento de un individuo, estos son: el contenido proteico y la calidad
de las proteínas (Badui, 2006). Otro factor que determina el uso de proteínas en los
alimentos, y los altera de diferentes maneras, es la digestibilidad (Suárez, Kizlansky, y
López, 2006).

2.1.2. Digestibilidad de las proteínas

La digestibilidad ileal es más adecuada para cuantificar la digestión porque la verdadera

digestibilidad del nitrógeno fecal no tiene en cuenta la pérdida de aminoácidos esenciales
en el colon a través de la actividad de la microbiota intestinal (Vásquez et al., 2019).
Cuando el nitrógeno ingerido se absorba por completo, la digestibilidad será igual a 100. El
contenido de nitrógeno en las heces representa la cantidad no absorbida, es decir, la
proporción de proteína que es resistente al ataque de las enzimas proteolíticas debido a sus
propiedades físicas o químicas (Suárez, Kizlansky, y López, 2006).

Los experimentos in vivo presentan altos costos y largos tiempos de ejecución

experimental, además de objeciones éticas debido al uso de animales.Por lo tanto se deben
considerar el empleo de metodologías in vitro para aumentar las correlaciones con los
ensayos in vivo (Tavano et al., 2016).
2.1.3. Valor biológico de las proteínas

El valor biológico de una proteína depende de la composición de aminoácidos y las

proporciones entre ellos, y su valor biológico es mayor cuando estas proporciones son
necesarias para cumplir con los requisitos de nitrógeno para el crecimiento, la síntesis y la
reparación de tejidos (Suárez, Kizlansky, y López, 2006).

2.2. Harina de soya

La soya se ha considerado la principal fuente de proteína vegetal para consumo humano y

animal, esto se debe a que en el grano integral la proteína representa alrededor del 40% de
la materia seca. La harina es el producto que pasa por menor cantidad de procesos, ya que
se produce por una molienda del frijol descascarillado (Jiménez, 2006). Las harinas pueden
tener características estructurales y funcionales deseables o mejoradas en comparación con
las leguminosas convencionales y no germinadas (Muñoz et al. 2022).

La proteína de soya purificada es totalmente disponible para el organismo, sin embargo, en

la naturaleza no se presenta de esta forma. En la mayoría de los casos, se encuentra
mezclada con otros componentes biológicamente activos que están presentes en la semilla
como son los inhibidores de tripsina, los fenoles, los fitatos, entre otros. El tratamiento
térmico mejora la digestibilidad al inactivar estos inhibidores, así mismo, desnaturaliza las
proteínas dietéticas (Jiménez, 2006).

2.3. Solución multienzimática

2.3.1. Tripsina

La tripsina es un ejemplo de proteasa, la cual es una enzima digestiva de gran importancia

en la digestión de los monogástricos como el hombre. Cabe destacar la amplia presencia de
los inhibidores de tripsina en alimentos de origen vegetal, en donde la mayor proporción se
manifiesta en semillas (Badui, 2006).

2.3.2. Quimotripsina

Las actividades de tripsina y quimotripsina se han propuesto como indicadores del estado
nutricional debido a su importancia durante la digestión de proteínas y, por tanto, en la
asimilación y utilización de nutrientes. La tripsina como la quimotripsina son las enzimas
responsables de la hidrólisis total de las proteínas al ser afines a las cadenas polipeptídicas
que contienen fenilalanina, triptófano y tirosina (Ramirez et al., 2017).

2.3.3. Peptidasa

Las peptidasas realizan funciones reguladoras de procesos fisiológicos celulares

fundamentales tales como: ciclo celular, apoptosis, autofagia, respuesta inmune,
cicatrización, digestión. Con su acción estrictamente controlada, se ha demostrado la
desregulación de la actividad de estas enzimas en muchas patologías, de las cuales
mencionaremos: diabetes, enfermedades cardiovasculares y neurodegenerativas y cáncer
(Zambrano, de la cruz y Coita, 2013).
 III. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1. LUGAR DE EJECUCIÓN

Laboratorio de Análisis Fisicoquímico de Alimentos de la FIAL-UNALM.

3.2. MATERIALES Y EQUIPOS

3.2.1. Materia prima

- Harina de soya

3.2.2. Materiales
- Beaker de 20 mL
- Pipeta de 5 mL
- Bagueta
- Bomba de succión
- Agitador magnético con calefacción
- Cronómetro
- Gotero

3.2.3. Reactivos
- Caseína
- NaOH 0.1N
- HCl 0.1N
- Tripsina
- Quimiotripsina
- Peptidasa

3.2.4. Equipos
- Balanza analítica
- Baño maría
- pH-metro ( Hanna instruments/Hi 2211)
3.3 MÉTODOS

3.3.1. Métodos de análisis

Método multienzimático pH variable (Hsu et al. 1977) .

3.3.2. Metodología experimental

La parte experimental inició con la evaluación, mediante la digestibilidad de la caseína, la
actividad de la solución multienzimática (preparada previamente). Se pesó 31.9 g de
caseína y añadió 5 mL de agua destilada, luego se ajustó el valor de pH a 8 y se añadió la
solución multienzimatica, luego se mide el pH durante 10 minutos, se anotó el valor en
cada intervalo de 1 minuto. Los valores de digestibilidad in vitro de la caseína son
ampliamente conocidos en la literatura.

Luego, se procedió con el análisis de la muestra, en donde se preparó 10 mL de una

suspensión proteica, para lo cual se pesó 138.88 mg de harina de soya, luego se trasladó a
un beaker de 20 mL. Posteriormente se añadieron 10 mL de agua destilada. Con ayuda de
una bagueta, se homogeneizó la suspensión para luego ajustar el pH a 8 , hasta el momento
que se llevó a incubar en baño maría a 37°C, luego se añadió 5 mL de la mezcla
multienzimática. Por último se midió el pH durante 10 minutos, se anotó en cada intervalo
de 1 minuto, el valor de pH de la suspensión proteica.
 IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En la Figura 1 se muestra la variación promedio del pH de la caseína y la harina de soya, la

gráfica se obtuvo usando los valores de la Tabla 1 del Anexo 1.

Figura 1. Comparación de la variación del pH versus el tiempo de la soya y la caseína.

En la Figura 1, se observa que ambas muestras tienen una tendencia descendente en el

valor de pH a medida que avanza el tiempo, resultando asì que la soya luego de 10 minutos
de digestión tuvo menor pH que la caseína, esto tal como se muestra en la Tabla 1,
significa que la soya se hidroliza más que la caseína.

Tabla 1. Porcentaje de hidrólisis de la caseína y la harina de soya luego de 10 minutos

de digestión in vitro

Muestra % Hidrólisis

Caseína 69,62

Harina de soya 73,97

En un estudio hecho por Hsu et al. (1977), donde se usó el mismo método, se obtuvo que
la digestibilidad in vitro de la caseína fue de 89.2, mientras que la de un aislado de soya fue
de 88.1.
En este caso la soya se hidrolizó menos que la caseína, siendo un resultado opuesto al
obtenido en la práctica. Benitez, Ibarz y Pagan (2008) dicen que las caseínas son proteínas
fáciles de hidrolizar y más flexibles. En cambio, De Luna (2006) menciona que los
inhibidores de tripsina de la semilla de soya son el factor principal que afecta la
digestibilidad de las proteínas. También, Elizalde et al. (2009) menciona que los
inhibidores de la familia Bowman-Birk, que se unen a la tripsina y a la quimotripsina
forman complejos estables e inactivos y causan la hidrólisis incompleta de las cadenas
peptídicas, por ende la digestibilidad de las proteínas disminuye y fueron ambas enzimas
las que formaron parte de la solución multienzimatica que se usó en la práctica. Teniendo
en cuenta esto, la acción de los inhibidores debió resultar en un menor porcentaje de
hidrólisis de soya comparado con la caseína. En el estudio hecho por Quizacán y Caicedo
(2012) se comprobó que los inhibidores de tripsina pueden inhabilitarse con un tratamiento
térmico de 80 °C. Ya que se trabajó con una temperatura de 37 °C, se descarta la
posibilidad de que los inhibidores de tripsina hayan sido inactivados por tratamiento
térmico. Uno de los errores que pudo haber alterado los resultados fue el inadecuado uso
del pH-metro, ya que en una de las repeticiones realizadas con la muestra de soya no se
realizó el lavado correspondiente del electrodo, lo que pudo contaminar la muestra y alterar
la lectura del pH. Esto también se vió reflejado en la desviación estándar de los resultados
obtenidos de la soya (Anexo 1), el cual evidenció una diferencia entre las dos repeticiones.

El porcentaje de proteína de la soya es alrededor del 40% de la materia seca (De Luna,
2006), por ello se usó 138.88 gramos de harina de soya para poder trabajar con 31.25
mg/ml de proteína. En un estudio realizado por Ciro et al., (2022), usaron una muestra de
Lupinus angustifolius con 62.5 mg de proteína que se hidrolizó hasta un 73,0 % sin
germinación, este porcentaje se explica por la presencia de compuestos antinutricionales
como el ácido fítico y de inhibidores de la tripsina, porque forman complejos con la
proteína evitando su hidrólisis y digestión. Además un factor clave para la inhibición de la
tripsina es el proceso de germinación (Modgil & Scood, 2017), es decir, a medida que
aumenta el tiempo de germinación los inhibidores de la tripsina disminuyen, aunque esto
no influyó de manera significativa en la hidrólisis de la proteína estudiado por Ciro et al.,
(2022). Sin embargo en un estudio hecho por Shimeli & Rakshit (2007), demostró que la
semilla de soya germinada durante 6 días tuvo una disminución de inhibidores de la
tripsina en un 45,65 %.
 IV. CONCLUSIONES

4.1. Se pudo conocer el método de Hsu et al., (1977), para determinar el grado de
digestibilidad de proteínas in vitro usando un complejo multienzimático formado
por peptidasa, quimotripsina y tripsina, en muestras de caseína y harina de soya
obteniéndose 69,62 y 73,97 % de hidrólisis respectivamente.

4.2. Se graficó una curva de pH versus tiempo, donde se observó el comportamiento

descendente de ambas muestras, donde la harina de soya tuvo un menor valor de
pH en comparación con la caseína.
 V. BIBLIOGRAFÍA
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 VI. CUESTIONARIO

6.1. ¿Son los ensayos in vitro mejores que los ensayos in vivo?

En el margen de los ensayos propuestos (in vivo / in vitro), se conoce que in vivo ocurre o
tiene lugar dentro de un organismo vivo donde es apropiado para la observación de efectos
finales y totales para un experimento en el sujeto viviente. Pruebas con animales y ensayos
clínicos son formas de investigación in vivo (los experimentos de propagación de plantas
que se hacen en viveros). Ahora se conoce que in vitro es una técnica en tubos de ensayos
o en un ambiente controlado fuera del organismo vivo siendo estas no tan precisas con
menos variables (propagación de plantas en tubos de ensayos) (Moreno, 2011).

Por tal razón, la extrapolación de los efectos observados in vitro a la situación in vivo debe
hacerse con precaución y teniendo siempre presentes las limitaciones de estos modelos
experimentales al tener una brecha de igual importancia en los 2 ensayos (Garcia, 2006).

Como ejemplos en campos iguales se tiene que los ensayos in vitro mediante pruebas
químicas y el empleo de cultivos celulares proporcionan información valiosa acerca de la
eficacia y los mecanismos de acción de determinados antioxidantes o de alimentos ricos en
dichas sustancias. Sin embargo, al hablar de los efectos observados a la situación in vivo
debe hacerse con precaución, ya que en estos ensayos no se consideran la absorción en el
tracto gastrointestinal ni el metabolismo (Ames et al., 1993; Meydani 2001).

6.2. Diga cuáles son las ventajas y desventajas del uso del ensayo realizado en la
práctica

A la hora de hablar de las ventajas en los ensayos propuestos es que permite permite un
enorme nivel de la simplificación del sistema bajo estudio, por lo que el investigador puede
centrarse en un pequeño número de componentes. Por ejemplo, la identidad de las
proteínas de la sistema inmune (por ejemplo, anticuerpos), y el mecanismo por el cual se
reconocen y se unen a los antígenos extraños, seguiría siendo muy oscuro si no fuera por el
uso extensivo de el trabajo in vitro para aislar las proteínas. La desventaja de los estudios
experimentales in vitro es que a veces puede ser muy difícil extrapolar a partir de los
resultados de ensayos in vitro de trabajo de nuevo a la biología del organismo intacto.
Los investigadores hacen en el trabajo in vitro debe ser cuidadoso para evitar la mala
interpretación de sus resultados, a veces puede llevar a conclusiones erróneas erróneas
acerca de organismos organismos y biología biología de sistemas (Moreno, 2011).

Si hablamos como extra el ensayo in vivo su ventaja y desventaja tenemos como primero
siendo dar más información de lo que realmente está pasando dentro por ejemplo el de la
célula y en segundo lugar como desventaja se tiene demasiados parámetros que no se
pueden controlar bien. Por lo tanto no podría ser capaz de darse cuenta de lo que se está
observando (Moreno, 2011).
 VII. ANEXO
ANEXO 1. Tabla 1. Resultados de variación del pH respecto al tiempo de la caseína y
la soya.

Tiempo Caseína Soya

(min) R1 R2 Promedio DS R1 R2 Promedio DS
0 8,01 7,9 7,96 0,078 7,74 8,11 7,93 0,262
1 8,01 7,89 7,95 0,085 7,66 8,06 7,86 0,283
2 8 7,88 7,94 0,085 7,61 8,02 7,82 0,29
3 7,99 7,87 7,93 0,085 7,54 7,97 7,76 0,304
4 7,96 7,85 7,91 0,078 7,49 7,92 7,71 0,304
5 7,94 7,81 7,88 0,092 7,47 7,88 7,68 0,29
6 7,92 7,78 7,85 0,099 7,44 7,83 7,64 0,276
7 7,9 7,76 7,83 0,099 7,42 7,8 7,61 0,269
8 7,9 7,73 7,82 0,12 7,39 7,76 7,58 0,262
9 7,89 7,68 7,79 0,148 7,39 7,73 7,56 0,24
10 7,88 7,67 7,78 0,148 7,37 7,7 7,54 0,233

ANEXO 2. Tabla 2. Digestibilidad de las proteínas en varios alimentos

Fuente: FAO (1993)