HPLC
HPLC
Dr.
DANTE FLORES
HPLC
HIGH –PRESSURE LIQUID-SOLID
CHROMATOGRAPHY
CROMATOGRAFIA DE LIQUIDOS
DE ALTA RESOLUCION
CROMATOGRAFIA DE LIQUIDOS DE
ALTA EFICACIA
VENTAJAS
El proceso cromatográfico es rápido
pudiéndose resolver mezclas muy
complejas en minutos.
Permite la separación de sustancias
termolábiles.
Se puede lograr resolución de sustancias
con peso molecular de 54 a 450.000
Diagrama de los
componentes del HPLC
Instrumentación
Reservorio de solventes
Desgasificador
Bomba
Inyector automático
Termostato de columna
Detectores
Instrumentación
BOMBAS
Los instrumentos de HPLC deben tener un sistema que
suministre la presión adecuada, para que se alcance un
caudal suficiente a su salida.
•Bombas reciprocas
•Bombas de jeringas o
desplazamiento
•Bombas neumáticas o de presión
constante
Requisitos para un sistema de bombeo
•Generación de presión por encima de 6000 psi
•Flujo libre de pulsaciones
•Intervalo de caudal de 0.1 ml a 10 ml
•Componentes resistentes a la corrosión
Funciones de la bomba
LA BOMBA TIENE TRES FUNCIONES
BASICAS
Proveer al sistema un flujo exacto y constante
Proveer una fase móvil de composición exacta
Proveer la fuerza necesaria para impulsar la
fase móvil a través de la columna
Gradiente:
Isocrático
Gradiente de caudal:
Es la variación del caudal
durante el proceso
cromatográfico.
Muestras de características
hidrosolubles
VITAMINAS
INYECTORES Volumen de
muestra de 5 a
Actualmente se disponen de inyectores
500 ul.
automáticos.
7000 psi
Los manuales son:
* Sistema de bucle
* Resistencia hidrodinámico
Jeringas Hamilton
COLUMNAS PARA HPLC
Se construyen de acero inoxidable.
Presentan una longitud de 10 y 30 cm. El
mas frecuente es de 25 cm.
El diámetro es 4 a 10 mm.
El tamaño de la partícula de la fase
estacionaria es de 3.5 y 10um
Precolumna
Aumenta la vida de la columna analítica
Satura la fase móvil con la fase
estacionaria.
La composición de la fase estacionaria
debe ser semejante a la columna analítica
El tamaño de partícula es mayor
Precolumna
Clasificación de la columna
según su relleno
En función de su consistencia
Según la porosidad de las partículas
En función de la forma de la partícula
En función del diámetro medio de la
partícula.
Columnas
La parte interna de
las columnas
presentan surcos
concéntricos
revestidos con una
capa de glicerina
para dar
uniformidad a la fase
estacionaria
empacada.
Cromatografía de fase
normal
Retardo por
interacción de la
superficie polar de la
fase estacionaria con
partes polares de las
moléculas.
SIO2, Al2 O3,
AMINO,-CN, -NO2
Cromatografia de fase normal
Heptano, hexano,
ciclohexano,
cloroformo
diclorometano,
dioxano, metanol
Separación de
sustancias no iónicas
apolares hasta
semipolares
(hidrocarburos ---
Ac. Carbónicos)
Cromatografía fase inversa
Retardo por
interacción de la
cadena apolar
hidrocarbonada de la
fase estacionaria con
partes apolares de las
moléculas de la
prueba
Cromatografía fase inversa
n – octadecilo (RP-18) n-octilo , etilo fenilo
polímeros hidrófobos.
Metanol o Acetonitrilo/agua o tampón
Separación de sustancias no iónicas
apolares hasta semipolares. Mayor
resolución de separación.
Condiciones que debe reunir
el detector
Respuesta universal con todos los solutos
Sensibilidad alta (10-12 – 10-11g/ml
Ruido de fondo muy bajo
Celda del detecto de menor volumen
No debe destruir la muestra
Debe ser capaz de funcionar durante mucho
tiempo.
Clasificación de los detectores
Absorbancia UV-VIS
Fluorescencia
Electroquímico
Índice de refracción
Conductividad
Espectrometría de masas
Detector de absorbancia
Definida por la ley de Lambert-Beer
Utiliza lámparas de vapor de mercurio
Celda de flujo para 10 ul
Son de doble haz
Deberá tener regiones electromagnéticas de
la luz ultravioleta y visible.