Enzimas de interés biotecnológico

Dra. Ing. María Teresita Castañeda

Copyright © Este apunte fue redactado por la Dra. María Teresita Castañeda para la cátedra de
Biotecnología, perteneciente a la carrera de Ingeniería Química.

U NIVERSIDAD T ECNOLÓGICA NACIONAL - FACULTAD R EGIONAL L A P LATA

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Año 2019
 Índice general

1 Conceptos generales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
1.1 Biocatalizadores 5
1.2 Estructura de las enzimas 6
1.3 Nomenclatura de las enzimas 8
1.4 Clasificación de enzimas 9
1.5 Mecanismo de catálisis enzimática 10
1.6 Cinética enzimática 11
1.7 Determinación de parámetros cinéticos 13
1.8 Actividad enzimática 14

2 Producción biotecnológica de enzimas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

2.1 Enzimas microbianas 15
2.2 Producción biotecnológica de enzimas microbianas 16
2.3 Operaciones del Upstream 17
2.4 Fermentación 18
2.5 Operaciones del Downstream 18
2.5.1 Recuperación del biocatalizador . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
2.5.2 Purificación del biocatalizador . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
2.5.3 Formulación del biocatalizador . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
2.6 Aplicación industrial de enzimas 21

3 Bibliografía de referencia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
 1. Conceptos generales

En este capítulo veremos los conceptos generales sobre uno de los productos biotecnológicos
mas empleados en la industria. Su conocimiento es fundamental para el ingeniero químico, ya que
permite ampliar el espectro de catalizadores que pueden utilizarse en un proceso químico. Aborda-
remos en este capítulo los conceptos generales sobre su naturaleza, clasificación y mecanismo de
catálisis.

1.1 Biocatalizadores
Muchas de las reacciones químicas presentes en la naturaleza requieren de catalizadores para
poder aumentar la velocidad a la que ocurren espontáneamente. Los catalizadores pueden definirse
como moléculas que aumentan la velocidad de una reacción termodinámicamente favorable, me-
diante la disminución de la barrera energética de dicha reacción. En la Figura 1.1 puede observarse
un esquema simplificado del mecanismo de funcionamiento de los catalizadores. El catalizador
interactúa con los sustratos o reactivos formando un complejo transitorio el cual reduce significati-
vamente la energía de activación de la reacción (Ea), para luego dar lugar a los productos previo a
la liberación del catalizador, el cual no se ve afectado durante la reacción.
Los catalizadores que actúan específicamente en reacciones bioquímicas, es decir en reacciones
que intervienen en el metabolismo de seres vivos, se conocen como enzimas o biocatalizadores.
Las enzimas son proteínas de elevado peso molecular y altamente específicas. En los organismos
vivos intervienen en reacciones metabólicas (Fig. 1.2) de forma óptima para luego ser liberadas sin
alteración funcional. Esto permite que la enzima pueda emplearse en sucesivas reacciones, lo que
las hace uno de los catalizadores más eficientes de la naturaleza.
Desde los inicios de la enzimología aplicada existen amplias controversias sobre si las enzimas
aisladas de los organismos vivos pueden actuar como biocatalizadores de la misma forma que
actúan en el organismo de origen . Sin embargo, hasta la actualidad, las enzimas han logrado
aislarse, purificarse, inmovilizarse y emplearse exitosamente en diversos procesos tecnológico,
convirtiéndose en un área de especial interés para la industria en general.
 6 Capítulo 1. Conceptos generales

Figura 1.1: Reacción catalizada

Figura 1.2: Rol de las enzimas en el metabolismo

1.2 Estructura de las enzimas

Todas aquellas propiedades que hacen de las enzimas un catalizador altamente eficiente derivan
de su estructura. Las enzimas tienen naturaleza proteica y por ende presentan las estructuras básicas
de las proteínas. Ya se ha visto anteriormente en la materia las estructuras de las proteínas, con
lo cual las mencionaremos brevemente solamente con la intención de recordarlas. La estructura
más elemental de las enzimas es la estructura primaria, la cual consiste en la unión secuencial de
aminoácidos por enlace peptídico entre el grupo carboxilo de un aminoácido y el grupo amino del
siguiente (Fig. 1.3).

Figura 1.3: Estructura primaria de las enzimas

La secuencia con la cual se unen los aminoácidos, así como la naturaleza de los residuos (R),
definen las características y el comportamiento de las enzimas.
Los aminoácidos próximos en la cadena polipeptídica pueden interaccionar mediante enlaces
puentes de hidrógeno entre los grupos amidas dando lugar a dos tipos de conformaciones espaciales,
conocidas como estructura secundaria: α hélice (la más predominante en enzimas) y β lámina (Fig.
1.4).
1.2 Estructura de las enzimas 7

Figura 1.4: Estructura secundaria de las enzimas

Además, de estas interacciones entre aminoácidos próximos, también tienen lugar interacciones
entre los R de aminoácidos produciendo un plegamiento adicional de las configuraciones nombradas.
Estos plegamientos resultan en una estructura tridimensional más compleja, denominada estructura
terciaria (Fig. 1.5). Las interacciones entre dichos R pueden ser muy diversas comprendiendo:
enlaces puentes disulfuro, interacciones iónicas, fuerzas de Van der Waals, puente de hidrógeno,
interacciones hidrofóbicas, etc. Como resultado de estos enlaces, en un ambiente hidrofílico, la
superficie de la proteína es rica en R de aminoácidos polares, mientras que los R hidrofóbicos
quedan principalmente agrupados en el interior de la macromolécula, en tanto que lo inverso ocurre
en un entorno hidrofóbico. Las enzimas presentan estructura terciaria globular, lo que les confiere
algunas de sus propiedades mas características como la solubilidad en agua.

Figura 1.5: Estructura terciaria de las enzimas

 8 Capítulo 1. Conceptos generales

Algunas enzimas pueden contar con una estructura cuaternaria constituida por varias cadenas
polipeptídicas, conformando subunidades, las cuales pueden tener o no la misma función catalítica
dentro de este complejo (Fig 1.6).

Figura 1.6: Estructura cuaternaria de las enzimas

La funcionalidad biológica de las enzimas depende de su estructura nativa, la cual se basa en

la estructura tridimensional más estable de la proteína bajo condiciones fisiológicas. Si bien la
estructura tridimensional de la enzima está determinada genéticamente, estará condicionada por el
medio en que se encuentran. Este hecho reviste importancia a la hora de trabajar con enzimas, ya
que el medio que las rodea puede diferir al entorno original donde fueron sintetizadas, con lo cual
deben tomarse las precauciones para evitar pérdidas de funcionalidad.
Finalmente, es importante mencionar que algunas enzimas pueden conjugarse con diferentes
macromoléculas como glúcidos, lípidos, ácidos nucleicos, etc., o bien con iones metálicos. Dichas
enzimas se denominan holoenzimas y la parte no proteica conjugada se conoce como grupo
prostético. Los grupos prostéticos están fuertemente unidos a las apoenzimas (grupo proteico) y no
se disocian durante la catálisis

1.3 Nomenclatura de las enzimas

Las enzimas se nombran de acuerdo a la reacción química que catalizan y el sustrato que
interviene en la misma, con la terminación –asa. Estas tienen en general nombres comunes,
sencillos y de amplio uso en la bibliografía, y un nombre sistemático que es el que corresponde por
norma para definirla correctamente. Por ejemplo la enzima aldehído reductasa (nombre común) es
correctamente nombrada como: alditol:NAD(P)+ 1- oxidorreductasa (nombre sistemático).
Además del nombre, las enzimas pueden identificarse, de acuerdo a la Comisión de Enzimas
de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología molecular (IUBMB), con un número (EC)
compuesto por cuatro dígitos:
1° dígito: Identifica a las enzimas por la familia o categoría a la cual pertenecen.
2° dígito: Indica el subgrupo dentro de la familia, el cual está relacionado con la tipología
del grupo químico sobre el cual actúa.
3° dígito: Se refiere a la subclase dentro del subgrupo, el cual identifica el grupo químico
específico que interviene en la reacción.
 1.4 Clasificación de enzimas 9

4° dígito: Se trata de un número correlativo que las identifica dentro de la subclase.

En la siguiente sección veremos la clasificación de enzimas que definen el primer dígito del
número EC.

1.4 Clasificación de enzimas

En lo que refiere a la clasificación de las enzimas, pueden distinguirse 6 categorías generales de
acuerdo al tipo de reacción que catalizan:
Oxidorreductasas: Esta categoría incluye a todas las enzimas que catalizan reacciones de
óxido-reducción, que consisten en transferencia de electrones, hidrógeno u oxígeno. El nom-
bre sistemático de estas enzimas está conformado por: “donor:aceptor oxidorreductasa”. Un
ejemplo de esta familia es la Glucosa oxidasa (Beta-D-glucosa:oxigeno 1-oxidorreductasa):
EC 1.1.3.4.

Transferasas: Esta categoría incluye a todas las enzimas que catalizan la transferencia de
un grupo químico específico, como puede ser metil, acil, amino, glicosil, o fosfato, desde
un compuesto a otro. El nombre sistemático de estas enzimas está conformado por “do-
nor:aceptor grupo transferido-transferasa”. Un ejemplo de esta familia es la Glucoquinasa
(ATP:D-glucosa 6-fosfotransferasa): EC 2.7.1.2.

Hidrolasas: Esta categoría incluye a todas las enzimas que catalizan la escisión hidrolítica
principalmente de los grupos C-O, C-N y C-C. El nombre sistemático de estas enzimas está
conformado por: “sustrato hidroxilasa”. Un ejemplo de esta familia es la Lactasa (lactosa
galactohidrolasa): 3.2.1.108.

Liasas: Esta categoría incluye a todas las enzimas que catalizan la escisión no hidrolítica y no
oxidativa de los grupos C-O, C-N y C-C, dando lugar a un doble enlace en los productos.El
nombre sistemático de estas enzimas está conformado por: “sustrato prefijo-liasa”. Un
ejemplo de esta familia es la PAL (L-Fenilalanina amonio-liasa): 4.3.1.24

Isomerasas: Esta categoría incluye a todas las enzimas que catalizan el reacomodamiento
geométrico o estructural dentro de la molécula, sin cambiar la composición atómica del
producto. El nombre sistemático de estas enzimas está conformado por: “sustrato prefijo-
isomerasa”. Un ejemplo de esta familia es la Glucosa isomerasa: EC 5.3.1.5.

Ligasas: Esta categoría incluye a todas las enzimas que catalizan la unión covalente entre dos
moléculas. El nombre sistemático de estas enzimas está conformado por: “X:Y ligasa”. Un
ejemplo de esta familia es la Piruvato carboxilasa (piruvato: dióxido de carbono ligasa) EC:
6.4.1.1.
 10 Capítulo 1. Conceptos generales

1.5 Mecanismo de catálisis enzimática

La catálisis enzimática comienza cuando una enzima (E) se encuentra con un sustrato con
el cual puede interaccionar (S). Esta interacción da lugar a un estado transitorio o intermediario
denominado complejo enzima-sustrato (ES). La energía asociada a la formación de este complejo
impulsa la formación del complejo activado, el cual está asociado a una menor energía libre que el
estado transitorio de la reacción sin catalizar. Seguidamente, la reacción prosigue con la formación
del complejo enzima-producto (EP), el cual es el intermediario previo a la liberación de P y E.

E+S ES EP E+P

El mecanismo por el cual una enzima cataliza una reacción comienza con la interacción de la
enzima (E) con el sustrato (S). Esta interacción tiene lugar en un sitio muy específico de la enzima,
denominado sitio activo (Fig. 1.7). El sitio activo de la enzima es un pequeño espacio tridimensional
de la proteína constituido por unos pocos R de aminoácidos donde se lleva a cabo propiamente la
catálisis, sirviendo el resto de la enzima como soporte del sitio activo.

Figura 1.7: Sitio activo

Existen diferentes teorías acerca de cómo interacciona el sustrato con el sitio activo para
conformar el complejo transitorio enzima-sustrato. De acuerdo al modelo de llave-cerradura (Fig.
1.8-A), el sitio activo de la enzima tiene una geometría espacial tal que el sustrato con una geometría
complementaria encaja perfectamente en el mismo. Por otro lado, el modelo de ajuste inducido
(Fig. 1.8-B) sugiere que el sustrato induce un cambio en la conformación del sitio activo de la
enzima luego de hacer contacto con la misma. Este último explicaría la posibilidad de que una
enzima pueda emplear como sustrato compuestos químicamente similares.

Figura 1.8: Modelos de la interacción E y S

 1.6 Cinética enzimática 11

Algunas enzimas, a su vez, requieren de ciertos compuestos para llevar a cabo la catálisis.
Estos compuestos se conocen como cofactores y coenzimas. La diferencia entre éstos se ilustra en
la Figura 1.9. Los cofactores son iones metálicos que se unen fuertemente a la enzima en forma
reversible, con lo cual no se disocian durante la reacción y no sufren alteración alguna, mientras
que el término coenzima está asociado a pequeñas moléculas orgánicas que se unen también
reversiblemente a la enzima pero lo hacen durante la reacción, sin formar parte de su estructura.

Figura 1.9: (a) Cofactores y (b) Coenzimas

1.6 Cinética enzimática

Dado que las enzimas son catalizadores biológicos es importante determinar la velocidad a la
cual transcurre la catálisis. Para ello, usaremos el caso mas simple que es aquel en el que hay un
único sustrato (S) y un único producto (P).

Para calcular la velocidad a la que ocurre esta reacción existen diversos abordajes, los más
conocidos son los de Michaelis-Menten y Briggs-Haldane. En este apunte consideraremos una
combinación de ambos. Michaelis-Menten asume que la velocidad de formación de P es mucho
menor que la velocidad reversible de ES, o sea k2 «« k–1, por ende la formación de P determina la
velocidad de reacción. En ecuaciones esto es:

dP
v= = k2 [ES]
dt
Para hallar la concentración del complejo [ES] debemos tener en cuenta el abordaje de Briggs-
Haldane, el cual propone que el cambio de la concentración de [ES] respecto al tiempo es insignifi-
cante, lo que implica que el [ES] se consume a la vez que se produce. Luego,
dES
Velocidad de produccion : = k1 [E][S]
dt
−dES
Velocidad de consumo : = k−1 [ES] + k2 [ES]
dt
Igualando ambas velocidades tenemos que:

k1 [E][S] = k−1 [ES] + k2 [ES]

12 Capítulo 1. Conceptos generales

Seguidamente despejamos las constantes,

[E][S] k−1 + k2
=
[ES] k1
Dado que como dijimos anteriormente k2 «« k–1:
[E][S] k−1
= = Km
[ES] k1
La constante Km se denomina constante de Michaelis-Menten.
Seguidamente despejamos [ES]:

[E][S]
[ES] =
Km
La concentración total de enzima [E 0] es fácilmente medible, no así la concentración libre de
enzima [E] (no asociada al complejo ES). Ambas se relacionan de la siguiente manera: [E] [E0] −
[ES]. Reemplazando en la ecuación anterior:

([E0 ] − [ES])[S]
[ES] =
Km
Reordenando:
[E0 ][S]
[ES] =
Km + [S]
Reemplazando el valor de [ES] en la ecuación de la velocidad tenemos:

k2 [E0 ][S]
v=
Km + [S]

La constante k 2 se conoce como k cat. Además, cuando se cumple que [ES] [E0], v vmax. De
lo anterior, tenemos que:

vmax = kcat [E0 ]

Reemplazando la expresión de kcat en la ecuación de velocidad, nos queda la siguiente expresión:

vmax [S]
v=
Km + [S]
Esta última se conoce como ecuación de Michaelis-Menten y se representa en la Figura 1.10.
A partir de esta ecuación podemos inferir que a bajas concentraciones de sustrato (S ≤ 0,05Km ),
la reacción es de primer orden, mientras que a concentraciones elevadas de sustrato (S ≥ 100Km ) la
reacción es de orden cero, con lo cual la velocidad no dependerá de la concentración de sustrato y
el sistema se dice que está saturado. Por otro lado, Km es igual a la concentración de sustrato para
la cual v = vmax /2.
Los parámetros cinéticos Km y kcat brindan información sobre la afinidad de una enzima
respecto a un sustrato determinado. Por un lado, la constante Km es un parámetro característico de
 1.7 Determinación de parámetros cinéticos 13

Figura 1.10: Cinética de Michaelis-Menten

las enzimas, que puede variar empleando diferentes sustratos y modificando algunos parámetros de
reacción como la temperatura, el pH, etc. Por otro lado, kcat es también conocido como número de
recambio y se define como la cantidad de moléculas de producto formado, por molécula de enzima
por unidad de tiempo, de acuerdo a la siguiente ecuación:

vmax
kcat =
[E0 ]
A partir de la ecuación anterior podemos concluir que a una concentración de enzima dada y en
condiciones saturantes de sustrato, kcat representa la máxima velocidad a la cual puede transcurrir la
reacción catalizada. El cociente kcat /Km es el mejor índice de la eficiencia enzimática y es conocido
también como constante de especificidad. Esta constante permite comparar diversas enzimas, la
misma enzima con diversos sustratos e incluso la eficiencia de la enzima en una reacción reversible.
Una mayor constante de especificidad implica un mayor número de recambio (elevada kcat ) y
mayor afinidad por el sustrato (menor Km).

1.7 Determinación de parámetros cinéticos

La representación de Michaelis-Menten, en la cual se relaciona la velocidad de formación de P
con la concentración de S, permite observar a simple vista si existe una correlación de los datos
obtenidos con el modelo de Michaelis-Menten. No obstante, este tipo de representación no es útil a
la hora de calcular con precisión las variables cinéticas, tales como Km o vmax. Para ello, se han
empleado a lo largo de la historia diferentes ecuaciones que surgen de la linealización de la ecuación
de Michaelis-Menten. La más utilizada es la linealización de Lineweaver–Burk. Ésta se basa en
obtener el recíproco de la ecuación de Michaelis-Menten, dando una ecuación que representa 1/v
en función de 1/S.

1 Km 1 1
= +
v vmax S vmax
Mediante la ecuación anterior se puede determinar el valor de vmax por medio de la ordenada al
origen y Km por la pendiente de la recta (Fig. 1.11).
Este tipo de representación depende mucho de la exactitud de los valores experimentales y por
ende puede acarrear un error en la determinación de los parámetros cinéticos. Sin embargo continúa
siendo uno de los métodos de más empleados para estos fines. Otros métodos de linealización para
la determinación de las constantes cinéticas se presentan en la Tabla 1.1.
 14 Capítulo 1. Conceptos generales

Figura 1.11: Linealización de Lineweaver–Burk

Tabla 1.1: Métodos de linealización de la ecuación de Michaelis-Menten

Método gráfico Ecuación Ordenada Abscisa
1 Km 1 1 1 1
Lineweaver-Burk = +
v vmax S vmax v S
S Km S S
Langmuir = + S
v vmax vmax v
v v
Eadle-Hofstee v = vmax − Km v
S S
S S Km S
Hanes-Wolff = + S
v vmax vmax v

1.8 Actividad enzimática

La velocidad de catálisis enzimática (v) se mide a partir de la actividad enzimática (AE). Esta
me da una idea de que tan eficiente (veloz) es una enzima para llevar a cabo una biotransformación,
en determinadas condiciones (pH, temperatura, etc.). La AE se puede determinar midiendo la
formación del producto en la mezcla de reacción o bien el consumo del sustrato en la misma. La
elección de uno u otro método dependerá fundamentalmente de la facilidad de cuantificación de los
mismos, la exactitud de la medida, el equipamiento requerido, la posibilidad de interferencia por
contaminantes, la estabilidad de la reacción, el costo, etc. La unidad que permite cuantificar la AE
se denomina unidad enzimática y se representa con la letra U. La definición de una U depende de la
enzima que se trate y debe aclararse las condiciones de ensayo (tiempo, pH y temperatura). Una U
es la cantidad de enzima que cataliza la disminución de una cantidad de sustrato o la producción de
una cantidad de producto por unidad de tiempo. Podemos expresar la AE de diferentes maneras.
Por un lado, la actividad total representa todas las U que tiene el extracto enzimático. A partir de la
AE total se puede calcular la AE volumétrica como el cociente entre la AE total y el volumen del
extracto y se expresa normalmente en U/ml. Finalmente, la AE específica es la relación entre la
AE total y la cantidad de proteínas en la mezcla y se expresa en U/mg. Esta última también puede
calcularse a partir de la AE volumétrica dividiendo la misma por la concentración de proteínas.
Estas medidas me permiten tener una idea de que tan ‘rico’ es el extracto enzimático en la enzima
de interés. También es una medida de como se va enriqueciendo la mezcla en la enzima de interés
durante la purificación. Este ultimo concepto se verá en detalle en el siguiente capítulo.
 2. Producción biotecnológica de enzimas

En este capítulo veremos en forma muy resumida como se producen biotecnológicamente las
enzimas de interés industrial. Nos enfocaremos en las enzimas de origen microbiano, ya que son
las más empleadas en la actualidad. Se abordará el bioproceso en forma general y se verá en mayor
profundidad las etapas de downstream, ya que el upstream y la etapa de fermentación en si misma
se verán mas adelante en el transcurso de la materia.

2.1 Enzimas microbianas

A lo largo de la historia las enzimas se han aislado de fuentes naturales (vegetal, animal y
microbiano) para su empleo en diferentes procesos químicos y bioquímicos. A partir de la década
del ‘60 las enzimas microbianas (principalmente amilasas y proteasas) comenzaron a reemplazar
gran parte de las enzimas de origen vegetal y animal. En la década del ‘70, con la introducción de
la ingeniería genética y la biología molecular, se lograron obtener microorganismos recombinantes,
los cuales aumentaron la productividad y por ende, disminuyeron los costos de los biocatalizadores
microbianos. En la Figura 2.1 se muestran los tipos de microorganismos mas empleados para la
producción de enzimas microbianas.

Figura 2.1: Microorganismos utilizados para la producción de enzimas: (A) hongos filamentosos,
(B) levaduras y (c) bacterias.
 16 Capítulo 2. Producción biotecnológica de enzimas

Actualmente, la industria de enzimas microbianas representa aproximadamente un 90 % del

mercado de biocatalizadores. Esto es consecuencia de algunas propiedades de los microorganismos
que los diferencian de las demás fuentes naturales como las plantas y animales: tienen un metabolis-
mo muy vigoroso, son versátiles y fáciles de propagar a gran escala, son fácilmente manipulables ya
sea genéticamente o mediantes cambios en su medio ambiente, sus requerimientos nutricionales son
simples y no estacionales, etc. Esto hace que la producción de enzimas a partir de microorganismos
sea relativamente simple, barata y confiable.

2.2 Producción biotecnológica de enzimas microbianas

A la hora de diseñar el bioproceso para la producción de enzimas microbianas deben tenerse en
cuenta una serie de variables que definirán el número de etapas y el tipo de operaciones unitarias.
El proceso para la producción de enzimas microbianas depende de la escala a la que se trabaje.
Esta puede variar desde escala de laboratorio (para algunas enzimas muy específicas) a escala
industrial para la producción de enzimas de uso masivo, las cuales se consideran hoy en día
commodities. Otro factor a tener en cuenta es la pureza requerida, ya que no es lo mismo un
producto de grado farmacéutico que una enzima para uso doméstico. A mayor pureza requerida,
mayor será el número de operaciones del proceso y por ende el costo del producto. Por otro
lado, debe considerarse la fuente natural de la enzima, o sea el tipo de microorganismo que la
sintetiza (hongo filamentoso, bacteria, levadura). Como vimos ya en esta materia la morfología y la
fisiología de estos microorganismos es muy diferente y, por lo tanto, la forma en que se cultiva y
sus requerimientos nutricionales serán diferentes. Por último, es fundamental conocer si la enzima
que vamos a producir se trata de una enzima intracelular (si es retenida dentro de la células) o
extracelular (se excreta al medio de cultivo). De ello dependerán las operaciones unitarias que
conformarán el proceso, fundamentalmente las etapas del downstream.
El diseño de un bioproceso para la producción de enzimas incluye una serie de etapas previas
al proceso de síntesis, las cuales se conocen como Upstream y etapas posteriores o de separación
conocidas como Downstream (Fig. 2.2). En las siguientes secciones se describirán sintéticamente
estas etapas.

Figura 2.2: Etapas del bioproceso para la producción de enzimas

 2.3 Operaciones del Upstream 17

2.3 Operaciones del Upstream

Se trata de todas las operaciones previas al proceso fermentativo. Estas operaciones se verán en
detalle más adelante en la materia, por lo tanto solamente se mencionarán brevemente las etapas
mas importantes.
La primera etapa es el mantenimiento y propagación de la cepa para la producción del inóculo
(Fig. 2.3). Normalmente las enzimas se producen a partir de culturas puras, esto es, solamente
debe estar presente el microorganismo de interés. Por ello, es importante mantener un stock del
mismo en condiciones cultivables (congelado, liofilizado, etc) y propagarlo para generar suficiente
cantidad de masa microbiana para inocular el biorreactor donde se llevará a cabo la fermentación.

Figura 2.3: Producción del inóculo

En paralelo, se lleva a cabo la formulación y preparación del medio del cultivo. Este tendrá
todos los nutrientes necesarios para el crecimiento de los microorganismos y la producción de
la enzima (inducción enzimática). La calidad y cantidad de los nutrientes dependerá del costo
del mismo, la escala y los requerimientos nutricionales del microorganismo, entre otros. Si bien
muchos de estos datos están en bibliografía es recomendable llevar a cabo la optimización del
medio de cultivo para maximizar la producción de la enzima y minimizar los efluentes del proceso.
Como ya mencionamos anteriormente, normalmente las enzimas se producen en cultivos puros,
con lo cual, tanto el medio de cultivo como el biorreactor y todo lo que ingresa al mismo (por ej.
aire) deben esterilizarse. Esta operación consiste en eliminar completamente la carga (número) de
microorganismos presentes en el material debido al contacto con el ambiente, el operario , etc. El
material esterilizado resultará libre de microorganismos y estará apto para ser inoculado con el
microorganismo de interés. Normalmente la esterilización se lleva a cabo por tratamiento térmico
(en autoclaves o intercambiadores de calor) o bien por filtración absoluta en caso de componentes
del medio de cultivo termolábiles.
Las etapas mencionadas anteriormente se integran en la Figura 2.4.

Figura 2.4: Upstream del bioproceso

 18 Capítulo 2. Producción biotecnológica de enzimas

2.4 Fermentación
Es el proceso en el cual se lleva a cabo propiamente la fermentación, entendiendo como tal, la
etapa (aeróbica o anaeróbica) donde acontece el crecimiento del microorganismo y la producción
de productos (ej. enzima) a expensas de los nutrientes del medio de cultivo. En las siguientes clases
se verá en detalle esta etapa. Se estudiará la estequiometría y la cinética del proceso, se verán las
diferentes configuraciones de biorreactores y se estudiarán los diferentes sistemas de cultivos para
lograr el objetivo deseado. Debido a ello, nos limitaremos a decir que las enzimas pueden producirse
en cultivo líquido sumergido (FLS) o en sustrato sólido (FSS). En la FLS hay una gran cantidad
de agua libre disponible y los nutrientes se encuentran en solución. Es el tipo de fermentación
más utilizado en la industria debido a que es sencillo, pueden controlarse las variables y puede
emplearse para una amplia variedad de microorganismos. En contraste, la fermentación en sustrato
sólido (FSS) es aquella en la cual no hay agua libre, por lo cual el microorganismo (usualmente
hongos filamentosos) crecen sobre la superficie de un soporte sólido húmedo (normalmente una
mezcla de residuos agroindustriales). Dada la dificultad para mezclar y controlar el sistema no es
muy utilizado en la actualidad, salvo en casos especiales. Lo mencionamos aquí ya que ha sido
utilizado (sobre todo en países orientales) para producir enzimas a partir de hongos filamentosos.
De aquí en mas, continuaremos el estudio para fermentación en cultivo líquido sumergido (FLS).

2.5 Operaciones del Downstream

El downstream del proceso incluye todas aquellas etapas posteriores a la fermentación ten-
dientes a la recuperación y formulación del producto de interés biotecnológico, en nuestro caso el
biocatalizador. Debido a que el downstream pueden incluir un gran número de operaciones unitarias,
llega a representar alrededor del 60 % de los costos de producción, los cuales se reflejarán en el
precio final del producto. Debido a ello, la elección correcta de la secuencia y de las operaciones
involucradas es fundamental. En lo que respecta a las operaciones que engloba el downstream
del proceso, podemos distinguir tres grupos fundamentales: la recuperación del biocatalizador,
la purificación del biocatalizador y la formulación del biocatalizador (Fig. 2.5). En las próximas
secciones se describirá brevemente cada una de ellas.

Figura 2.5: Downstream del bioproceso

 2.5 Operaciones del Downstream 19

2.5.1 Recuperación del biocatalizador

Las operaciones de recuperación tienen como objetivo aislar el biocatalizador del medio
circundante. En el caso de biocatalizadores producidos a partir de microorganismos, el medio
circundante es el medio de cultivo en el cual se encuentra inmerso el microorganismo productor y el
biocatalizador. De acuerdo a la naturaleza del biocatalizador, dependerán las operaciones destinadas
a su recuperación:
• Enzimas extracelulares: se trata de aquellas enzimas que se producen y se excretan al exterior
de la célula. En este caso, la enzima quedará diluida en el medio de cultivo con lo cual las
operaciones de recuperación incluirán la separación de las células del medio de cultivo conteniendo
la enzima (extracto enzimático) y la concentración de dicho extracto. Debido a que el extracto
enzimático contiene los componentes del medio de cultivo más las sustancias excretadas por las
células, requerirá de técnicas de purificación adicionales.
• Enzimas intracelulares: son aquellas enzimas que quedan retenidas dentro de las células. En
este caso, las operaciones de recuperación incluirán la separación de las células (conteniendo la
enzima) del medio de cultivo. Una vez obtenido el pellet de biomasa puede optarse por liberar la
enzima de la célula por ruptura celular, obtener el extracto enzimático y proceder a la purificación
de dicho extracto, o bien puede emplearse la célula como soporte de la enzima mediante técnicas de
permeabilización selectiva de la membrana plasmática. Las operaciones de recuperación utilizan las
diferencias entre las propiedades físico-químicas de las sustancias a separar. El criterio de elección
de estas operaciones debe priorizar aquellas que aprovechen al máximo estas diferencias y a la vez
resulten económicas.
Para la separación de biomasa del medio de cultivo se utilizan operaciones de separación del
tipo sólido-líquido. La elección de las mismas dependerá, entre otras cosas, del tamaño de las
partículas (células), la diferencia de densidad entre las células y el medio de cultivo, la forma de
dichas partículas (esféricas, alargadas, filamentosas), etc. Si bien los microorganismos pueden
decantar naturalmente, la velocidad de sedimentación natural es muy lenta debido al tamaño
pequeño de estos y que la densidad de los microorganismos es muy similar a la del medio de
cultivo que lo rodea. Para acelerar dicha separación las operaciones más empleadas son la filtración
y la centrifugación. Una vez separadas ambas fases, y dependiendo la ubicación de la enzima,
se continúa el proceso con la fase líquida (producto extracelular) o con la fase sólida (producto
intracelular).
La disrupción o ruptura celular es utilizada cuando el producto de interés es intracelular y
se requiere liberarlo al medio para su posterior purificación. Se trata de la disgregación de la
membrana y/o pared celular con la consiguiente desestabilización de la misma y liberación del
contenido intracelular. La disrupción de la célula usualmente requiere de métodos fuertes, en
particular en microorganismos como las bacterias y levaduras debido a la estructura de la pared
celular. Los métodos de disrupción celular pueden clasificarse en: métodos físicos (molino de perlas,
homogeinizadores, ultrasonicadores etc.), métodos químicos (surfactantes, álcalis fuerte, solventes
orgánicos, etc) y métodos enzimáticos (lisozimas, glucanasas, etc.).
Finalmente, una de las etapas previa a la purificación enzimática es la concentración del
extracto crudo. Mediante esta etapa se elimina el contaminante más abundante: el agua. Además al
reducir el volumen de material se facilitan las operaciones de purificación y a su vez, se reduce el
costo de dichas operaciones. Las técnicas de concentración dependerán fundamentalmente de las
propiedades físico-químicas del producto a recuperar. Algunos de los métodos mas utilizado para
estos fines son: métodos térmicos, precipitación con sales o solventes y filtración por membrana.

2.5.2 Purificación del biocatalizador

Las operaciones de purificación tienen como objetivo remover todos aquellos contaminantes
que se encuentran en el extracto crudo y que pueden interferir en su uso posterior. A su vez, a través
20 Capítulo 2. Producción biotecnológica de enzimas

de la purificación se logra incrementar la actividad específica de la enzima.

La composición del extracto crudo dependerá si la enzima es extracelular o intracelular. En
el primer caso el extracto contendrá un pool de enzimas extracelulares y pequeños solutos de
bajo peso molecular, ya que la membrana celular es una poderosa barrera que retiene todo el
contenido celular. Sin embargo, en el caso de extracto de enzimas intracelulares que debieron
pasar por un proceso de disrupción celular, esta contiene todos los componentes intracelulares,
entre ellos, una mezcla compleja de proteínas y ácidos nucleicos. En este último caso unas de
las primeras etapas de purificación debe separar los ácidos nucleicos de la muestra, lo cual puede
lograrse mediante precipitación con algunos agentes o bien empleando nucleasas. El sulfato de
amonio puede emplearse con este fin pero no es específico, ya que también precipita proteínas. Los
componentes de bajo peso molecular, principalmente las sales, pueden ser removidas previamente
ya sea mediante diálisis o cromatografía de exclusión molecular. Esta etapa se conoce como
desalado.
Una vez eliminados los componentes no proteicos, el extracto crudo consiste principalmente en
una mezcla de proteínas. A estas alturas la purificación del extracto estará dirigida a operaciones de
fraccionamiento de las diferentes proteínas. Cada una de estas etapas incrementará la pureza del
compuesto, expresado como el grado de purificación, pero a su vez se perderá parte de la enzima
en cada etapa, parámetro conocido como el rendimiento de purificación. Idealmente, el grado de
purificación final debe ser elevado al igual que el rendimiento. Esto dependerá en gran medida de la
cantidad de etapas de purificación, ya que aun si se obtiene un rendimiento por etapa elevado, si el
proceso tiene muchas etapas, el rendimiento final será bajo.
Desde el punto de vista industrial, las operaciones de purificación en general son costosas y el
precio del producto muchas veces no puede compensar los costos de obtención de enzimas puras.
Es por ello, que aun cuando el grado de purificación es importante, es esencial obtener un buen
rendimiento final en detrimento de la purificación.
Las operaciones empleadas para la purificación de un extracto enzimático que contiene mayori-
tariamente proteínas, consistirá en una serie de etapas cromatográficas que utilizan las diferencias
entre las propiedades físicas (tamaño molecular, solubilidad y distribución de carga en la superficie)
así como también propiedades biológicas (especificidad a un determinado ligando) para separar las
diversas proteínas. La cromatografía es una de las técnicas de purificación más empleadas debido a
su eficacia. La configuración más común para este propósito es en columna. Esta técnica consiste en
el pasaje de una mezcla de sustancias (en este caso proteínas) disueltas en una fase móvil a través
de una fase estática, la cual generalmente es una matriz sólida. Durante dicho pasaje los solutos
interaccionan de manera diferente con la matriz, produciendo un retardo en la elución de acuerdo a
sus propiedades. Existen muchas técnicas cromatográficas para la purificación de proteínas, las más
relevantes son: Cromatografía de exclusión molecular o filtración en gel (separa las moléculas por
su peso molecular), Cromatografía de intercambio iónico (separa las proteínas de acuerdo a su carga
neta a un determinado pH), Cromatografía por interacción hidrofóbica (separa las proteínas de
acuerdo a su hidrofobicidad) y cromatografía de afinidad (separa una proteína gracias a su afinidad
con un ligando absorbido en el relleno).
Finalmente, la cristalización es una forma de purificación muy antigua la cual se está empleando
en la actualidad, debido a la búsqueda de alternativas factibles de aplicar a escala industrial y a su
vez económicas. Algunas enzimas que se lograron cristalizar para uso comercial son las celulasas,
la glucosa isomerasa y la alcohol oxidasa. La cristalización trata de la formación de partículas
sólidas de la enzima de tamaño y forma definida. Para que una enzima cristalice se tienen que dar
las condiciones adecuadas para que se encuentre sobresaturada en el solvente. Existen muchos
factores que influyen en la cristalización incluyendo el tipo de sal y su concentración, el pH, la
temperatura, la agitación, el núcleo de cristalización, etc. Mediante el control de los niveles de
saturación se puede optimizar el tamaño del cristal obtenido. Adicionalmente algunas enzimas se
 2.6 Aplicación industrial de enzimas 21

pueden hacer crecer en diferentes morfologías modificando las condiciones de cristalización.

2.5.3 Formulación del biocatalizador

La formulación del producto consiste en una serie de operaciones diversas tendientes a la
estabilización, estandarización y presentación del producto de acuerdo a su aplicación. Las enzimas
en general se presentan para su comercialización de dos maneras: sólidas o líquidas.
Para la presentación de enzimas en forma sólida, las mismas se mezclan con estabilizantes y
se someten a operaciones de secado. Las técnicas de secado más comunes son el secado a baja
temperatura y la liofilización. La primera técnica se emplea a escala industrial ya que es un método
económico y la segunda es más comúnmente empleada a bajas escalas. Las enzimas presentadas
en forma sólida tienen el beneficio de conservar la vida útil del producto por más tiempo debido
a la disminución de la actividad acuosa (aw). Bajas aw reducen la velocidad de ocurrencia de la
mayoría de las reacciones de deterioro, incluyendo el deterioro microbiano. Adicionalmente pueden
ser almacenadas a temperatura ambiente con el concomitante ahorro de energía de refrigeración y a
su vez son más fácilmente transportables, debido a la reducción de volumen. En contraposición,
la presentación de enzimas en forma sólida puede producir polvo y afectar a los trabajadores, los
cuales pueden sufrir de alergias debido a ello.
Por otro lado, la presentación de enzimas en forma líquida incluye la concentración, la adición
de estabilizantes y la posterior filtración. Los estabilizantes más empleados son la glucosa, sacarosa
y algunos polioles. Estas sustancias confieren estabilización en cuanto al mantenimiento de la
estructura nativa de la proteína y de este modo evitan la desnaturalización. Además previenen
la formación de agregados, manteniendo a la enzima soluble. Seguidamente el producto se filtra
para eliminar sólidos insolubles y reducir la carga microbiana. Las ventajas de utilizar enzimas
líquidas están dadas por la facilidad de manejo y dosificación y existe además un ahorro energético
al no tener que utilizar operaciones como el secado. Sin embargo tiene la desventaja de ser más
vulnerable a desestabilización y contaminación microbiana, con lo cual generalmente debe ser
almacenada en condiciones de refrigeración.
En definitiva, la aplicación del biocatalizador determinará si es más factible su utilización en
forma sólida o líquida. Por ejemplo, para la industria de detergentes para la ropa en general deben
suministrarse en forma sólida, mientras que para la industria de jarabes de alta fructosa se prefiere
la enzima líquida.
Finalmente, parte de la formulación del producto es su estandarización. Es muy común en los
procesos biológicos las variaciones entre batch y batch, y desde el punto de vista de la comercializa-
ción se requiere que el producto tenga características estables en el tiempo. Una forma de disminuir
las fluctuaciones del proceso es mediante la incorporación de sistemas de monitoreo y control del
mismo. Aun así la estandarización del producto es necesaria para lograr obtener las especificacio-
nes del producto y una calidad constante. Dichas especificaciones deben suministrar la siguiente
información: Actividad específica, estabilidad en el almacenamiento, solubilidad, contenido de
agua, etc.

2.6 Aplicación industrial de enzimas

El empleo indirecto de enzimas en la manufactura y conservación de los alimentos se remonta
al antiguo Egipto, donde las mismas intervenían en el proceso de obtención de bebidas alcohólicas.
Sin embargo, no fue hasta el siglo ‘18 que comenzaron a aislarse y estudiarse desde un punto
de vista más científico. Con el avance de la biotecnología se ha logrado mayor eficiencia en la
búsqueda, obtención y purificación de las enzimas, permitiendo su aplicación en diversas industrias.
Algunas de las aplicaciones actuales se resumen en la Tabla 2.1.
A la hora de escoger un catalizador para su aplicación industrial, existen una serie de caracterís-
22 Capítulo 2. Producción biotecnológica de enzimas

Tabla 2.1: Algunas aplicaciones industriales de las enzimas

Aplicación Industria
Detergentes
Producto final Farmacéutica
Analítica
Textil
Cuero
Coadyuvantes Pulpa y papel
Azucarera
Café
Láctea
Cervecera
Vinos y jugos
Alimentos y bebidas
Cárnica
Panadera
Aceites

ticas que hacen a las enzimas más eficientes que los catalizadores químicos. Entre las principales
ventajas que surgen de la utilización de enzimas está su elevada especificidad, tanto que permite
discriminar entre partes similares de las moléculas (regioespecificidad) e incluso entre isómeros
ópticos de una misma molécula (estereoespecificidad). Otra ventaja importante de las enzimas
respecto a los catalizadores químicos es su capacidad de trabajar en condiciones de reacción (tem-
peratura, pH, presión, etc.) suaves, con lo cual el consumo energético es bajo y el equipamiento
necesario no requiere materiales y aspectos constructivos especiales, lo que resulta favorable para
su aplicación industrial. Finalmente es importante destacar que las enzimas, a diferencia de muchos
catalizadores, son inalteradas por el proceso que catalizan pudiendo emplearse sucesivas veces, no
son tóxicas para el ser humano si se usan correctamente, son biodegradables, etc. En contraste, las
enzimas presentan algunos inconvenientes o desventajas a la hora de emplearlas. Si bien tienen una
alta actividad en condiciones moderadas de operación, la mayoría son muy lábiles en condiciones
de elevada temperatura o pH extremos, inestables en presencia de solventes no acuosos, pueden
ser degradadas por proteasas o inactivas en presencia de algunos inhibidores. Además, algunas
enzimas y sus coenzimas son costosas o difíciles de conseguir en grandes cantidades. Finalmente
es necesario tener en cuenta que si bien muchas enzimas están presente en nuestros alimentos
cotidianos, algunas pueden causar alergias cuando son ingeridas o inhaladas.
 3. Bibliografía de referencia

Aehle, W. (Ed.). (2007). Enzymes in industry: production and applications. John Wiley & Sons.

Brauer, H. (Ed.). (1985). Fundamentals of biochemical engineering (Vol. 2). Wiley-VCH.

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